銀杏愈傷組織生長(zhǎng)、褐化與黃酮積累研究

王俊燚 董金金 劉偉 曹福亮 汪貴斌 王義強(qiáng)

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué)林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004；2. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037；3. 中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004）

銀杏（Ginkgo bilobaL.）又名白果，最早出現(xiàn)于古生代石炭紀(jì)，迄今已有3.45億年，現(xiàn)僅存一科一屬一種，是我國(guó)珍貴的孑遺植物［1-3］。不僅具有極高的觀賞價(jià)值，還具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科學(xué)研究?jī)r(jià)值［4］。其中，銀杏中的黃酮類化合物具有抗氧化、抑菌、治療心血管疾病及保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用，是國(guó)內(nèi)外植物藥用成分的開發(fā)熱點(diǎn)［5-6］。盡管銀杏黃酮的傳統(tǒng)提取方法已十分成熟，但由于占有大量耕地，也無法避免環(huán)境影響，仍存在許多不足［7］。運(yùn)用植物組織培養(yǎng)的方法生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物能排除不良環(huán)境影響，解決自然資源短缺與森林破壞問題，是目前國(guó)內(nèi)外研究的重要方向［8-9］。

然而，銀杏愈傷組織在實(shí)際培養(yǎng)中存在生長(zhǎng)緩慢、易褐化和次生代謝物產(chǎn)量低等問題，無法達(dá)到工業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)。近年來，為了探究適宜銀杏愈傷組織生長(zhǎng)與黃酮積累的條件，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了取材部位、基本培養(yǎng)基和激素種類等方面的影響［9-11］，但鮮有綜合討論細(xì)胞生長(zhǎng)、褐化與黃酮積累的研究，更未見利用正交實(shí)驗(yàn)探究總黃酮實(shí)際產(chǎn)量的報(bào)道，缺乏工業(yè)生產(chǎn)指導(dǎo)性。同時(shí)程水源等［12］研究表明，銀杏葉黃酮含量在不同月份間存在較大差異，且外植體中酚醌類底物隨著月份的積累也可能會(huì)影響愈傷組織的生長(zhǎng)與褐化［13］，而目前尚未在銀杏愈傷組織培養(yǎng)中見到關(guān)于外植體月份對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與黃酮積累影響的研究；綜合研究外植體、激素和抗褐化劑共同影響下的銀杏愈傷組織生長(zhǎng)與黃酮積累，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究以銀杏4、5、6月份葉片誘導(dǎo)的愈傷組織為供試材料，選用萘乙酸（α-Naphthaleneacetic acid，NAA）為細(xì)胞生長(zhǎng)素、呋喃氨基嘌呤（Kinetin，KT）為細(xì)胞分裂素，抗壞血酸（Ascorbic acid，VC）為抗褐化劑，在繼代中設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)考察四因素交互作用下銀杏葉愈傷組織的生長(zhǎng)指數(shù)、褐化指數(shù)及黃酮含量差異。結(jié)合供試銀杏樹4、5、6月葉片黃酮含量與愈傷組織的總黃酮產(chǎn)量，旨在發(fā)現(xiàn)銀杏愈傷組織生長(zhǎng)與黃酮積累規(guī)律，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 供試材料為4、5、6月中旬中南林2號(hào)葉片誘導(dǎo)且在恒溫組培室中繼代三次的愈傷組織。

1.1.2 試劑 MS培養(yǎng)基自制（含3%蔗糖，0.6%瓊脂）；植物激素萘乙酸（NAA）和呋喃氨基嘌呤（KT）購(gòu)自Sigma公司；抗壞血酸（VC）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.1.3 儀器 202-0A型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），高效液相色譜儀LC-2010A HT（日本島津），JY92-2D超聲波破碎儀（寧波新芝科器研究所）。

1.2 方法

1.2.1 銀杏愈傷組織正交繼代培養(yǎng) 各月份銀杏葉愈傷組織在相同條件下繼代3次后，選擇生長(zhǎng)旺盛、色澤黃綠的愈傷組織，按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。每瓶愈傷組織接種鮮重為0.3 g，培養(yǎng)基選取MS基本培養(yǎng)基，添加激素為NAA與KT組合，抗褐化劑為VC，選用 L9（34）正交設(shè)計(jì)表（表1），在40 d的繼代周期內(nèi)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)考察銀杏葉愈傷組織的生長(zhǎng)、褐化及黃酮積累（表2）。

表1 L9（34）正交因素水平設(shè)計(jì)表

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.2.2 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時(shí)間為12 h/d。

1.2.3 生長(zhǎng)指數(shù)測(cè)定 以每瓶銀杏愈傷組織的鮮重（Fresh weight，F(xiàn)W）為生長(zhǎng)指標(biāo)，銀杏愈傷組織處理每8 d隨機(jī)取5瓶稱鮮重，取平均值并計(jì)算生長(zhǎng)指數(shù)，生物學(xué)重復(fù)3次。

銀杏愈傷組織生長(zhǎng)指數(shù)=（收獲時(shí)愈傷組織鮮重-接種時(shí)愈傷組織鮮重）/接種時(shí)愈傷組織鮮重

1.2.4 褐化指數(shù)測(cè)定 每8 d對(duì)各組銀杏愈傷組織處理總體進(jìn)行觀察，按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定褐化級(jí)別并計(jì)算褐化指數(shù)［14］。

愈傷組織褐化級(jí)別評(píng)定：0級(jí)：愈傷組織呈黃綠色；1級(jí)：愈傷組織呈淡黃色；2級(jí)：愈傷組織呈淺褐色；3級(jí)：愈傷組織呈深褐色。

銀杏愈傷組織褐化指數(shù)=∑（褐化級(jí)別×該褐化級(jí)別瓶數(shù)）/（總瓶數(shù)×4）

1.2.5 總黃酮含量測(cè)定

1.2.5.1 色譜條件 色譜柱supersil ODS2 5 μm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸（50∶50）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

1.2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定五氧化二磷干燥過夜的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品6 mg、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品6 mg、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品4 mg于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得槲皮素、山奈酚、異鼠李素濃度分別為120、120、80 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取該對(duì)照品溶液1.562 5、3.125、6.25、12.5和 25 mL分別置于 50 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液，高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）依次進(jìn)樣，重復(fù)3次，以樣品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制槲皮素、山奈酚、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.4 銀杏葉片黃酮提取與含量測(cè)定 分別取4、5、6月中旬中南林二號(hào)當(dāng)年生葉片，清水沖洗后轉(zhuǎn)移至恒溫烘箱110℃殺青10 min，隨后轉(zhuǎn)入60℃烘干12 h至恒重，冷卻研細(xì)過100目篩，稱量干重（Dry weight，DW）。按中國(guó)藥典（2015）方法提取總黃酮并制備供試溶液，HPLC進(jìn)樣后，根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算槲皮素、山奈素和異鼠李素的含量，按下式換算成總黃酮醇苷的含量，生物學(xué)重復(fù)3次。

總黃酮醇苷含量（mg/g）DW：（槲皮素含量+山奈酚含量+異鼠李素含量）×2.51

1.2.5.5 銀杏愈傷組織黃酮提取與含量測(cè)定 各處理組繼代培養(yǎng)至40 d時(shí)，每組隨機(jī)取10瓶生長(zhǎng)旺盛的銀杏愈傷組織，按上述相同方法提取、測(cè)定并計(jì)算總黃酮含量，重復(fù)3次。

1.2.6 銀杏愈傷組織總黃酮產(chǎn)量計(jì)算 根據(jù)40 d時(shí)各組愈傷組織的平均干重（g/瓶）與總黃酮含量，以下式計(jì)算總黃酮產(chǎn)量：

愈傷組織總黃酮產(chǎn)量（mg/瓶）=愈傷組織干重（g/瓶）×總黃酮含量（mg/g）

2 結(jié)果

2.1 銀杏愈傷組織生長(zhǎng)指數(shù)分析

各月份銀杏葉愈傷組織相同條件下繼代3次后，按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行40 d的繼代培養(yǎng)，接種后每8 d計(jì)算各試驗(yàn)號(hào)生長(zhǎng)指數(shù)；愈傷組織繼代至40 d，均有明顯生長(zhǎng)（圖1），統(tǒng)計(jì)愈傷組織各時(shí)期生長(zhǎng)指數(shù)，結(jié)果見圖2。

圖1 銀杏愈傷組織生長(zhǎng)進(jìn)程

圖2 銀杏愈傷組織生長(zhǎng)指數(shù)曲線

據(jù)圖2可知銀杏愈傷組織生長(zhǎng)趨勢(shì)在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)間有較大區(qū)別，以0-16 d為緩慢生長(zhǎng)期；16-32 d進(jìn)入快速增長(zhǎng)期；32 d以后生長(zhǎng)速率又明顯降低。截止到第40 d，銀杏葉愈傷組織的正交繼代實(shí)驗(yàn)中生長(zhǎng)指數(shù)最高的為第6組，達(dá)到5.75，最低的第4組為4.20。

通過直觀分析40 d時(shí)的銀杏葉愈傷組織生長(zhǎng)指數(shù)（表3），銀杏外植體采摘月份對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)影響不顯著；激素影響中NAA對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)有極顯著影響（P＜0.01），由低濃度升高時(shí)對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)有較大的促進(jìn)作用，而KT濃度影響不顯著；VC對(duì)銀杏愈傷組織生長(zhǎng)有抑制作用，且影響顯著（P＜0.05），根據(jù)4因素的R值可判定它們對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)指數(shù)影響的主次順序?yàn)椋篘AA濃度＞VC濃度＞外植體月份＞KT濃度，銀杏愈傷組織者最佳生長(zhǎng)組合為A1B3C1D1。

表3 40 d時(shí)銀杏葉愈傷組織生長(zhǎng)指數(shù)直觀分析

2.2 銀杏愈傷組織褐化指數(shù)分析

銀杏愈傷組織接種后，各試驗(yàn)號(hào)每8 d進(jìn)行愈傷組織形態(tài)觀察，計(jì)算各組愈傷組織褐化指數(shù)，繪制40 d內(nèi)銀杏愈傷組織褐化指數(shù)曲線如圖3。

據(jù)圖3，銀杏愈傷組織色澤在繼代后16 d左右開始由黃綠色出現(xiàn)轉(zhuǎn)變，且32-40 d間褐化指數(shù)會(huì)大幅提升。截至40 d，褐化指數(shù)最高的為第5組51.88%，最低為第2組17.50%。

據(jù)表4結(jié)果顯示，4因素中VC濃度對(duì)褐化率影響極顯著（P＜0.01），VC濃度從5 mg/L到20 mg/L，褐化指數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，當(dāng)VC濃度為10 mg/L時(shí)，平均褐化指數(shù)到達(dá)最低值22.71%；而其他3因素均對(duì)愈傷組織褐化無顯著影響（P＞0.05）。根據(jù)4因素的R值判定它們影響愈傷組織褐化率的主次順序?yàn)椋篤C濃度＞KT濃度＞外植體月份＞NAA濃度，在最優(yōu)組合為A1B1C2D2下，銀杏愈傷組織的褐化指數(shù)能達(dá)到最低。

圖3 銀杏愈傷組織褐化指數(shù)曲線

表4 40 d時(shí)銀杏葉愈傷組織褐化指數(shù)直觀分析

2.3 總黃酮含量分析

2.3.1 線性關(guān)系：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜（圖4），以樣品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制槲皮素、山奈酚、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)曲線（表5），根據(jù)相關(guān)系數(shù)r可知槲皮素、山奈酚、異鼠李素在濃度范圍為 3.75-60.00 μg/mL、3.75-60.00 μg/mL 及2.50-40.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 總黃酮苷對(duì)照品HPLC圖

2.3.2 銀杏葉片黃酮含量分析 根據(jù)4、5、6月中旬銀杏葉片黃酮含量趨勢(shì)（圖5），4月銀杏葉片黃酮含量為3個(gè)月份中的最低值8.90 mg/g；從4月中旬到6月中旬，銀杏葉片黃酮含量呈上升趨勢(shì)，以4月中旬到5月中旬為黃酮相對(duì)快速積累期，5月中旬到6月中旬黃酮積累減慢，在6月中旬葉片黃酮達(dá)到3個(gè)月份中的最高含量12.70 mg/g。

表5 三種黃酮醇苷的回歸方程與線性關(guān)系

圖5 銀杏葉片總黃酮含量

2.3.3 銀杏愈傷組織黃酮含量分析 根據(jù)圖6中銀杏愈傷組織黃酮含量及表6直觀分析，截至40 d，正交試驗(yàn)中黃酮含量最高的第9組達(dá)到11.04 mg/g，而最低的第3組僅為6.31 mg/g；根據(jù)直觀與方差分析結(jié)果，愈傷組織黃酮含量隨外植體月份的延后而有顯著增長(zhǎng)（P＜0.05）；激素中NAA對(duì)黃酮含量有極顯著影響（P＜0.01），KT濃度也對(duì)黃酮含量呈顯著影響（P＜0.05），在激素配比為2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT時(shí)愈傷組織黃酮積累量最大；而抗褐化劑VC濃度對(duì)黃酮積累的影響不顯著，但最低與最高濃度間仍有顯著差異。根據(jù)4因素的R值判定它們影響愈傷組織黃酮積累的主次順序?yàn)椋篘AA濃度＞葉片月份＞KT濃度＞ VC濃度，銀杏愈傷組織黃酮積累最優(yōu)組合為A3B2C2D1。

圖6 40 d時(shí)銀杏愈傷組織總黃酮含量

表6 40 d時(shí)銀杏愈傷組織總黃酮含量直觀分析

2.4 銀杏愈傷組織總黃酮產(chǎn)量計(jì)算

以40 d時(shí)各組的平均愈傷組織干重（g/瓶）和總黃酮含量（mg/g）DW，計(jì)算各組的總黃酮實(shí)際產(chǎn)量（表7）。

直觀分析結(jié)果顯示，銀杏愈傷組織繼代培養(yǎng)40 d后，總黃酮產(chǎn)量最高的為第9組1.49 mg/瓶，最低為第7組0.83 mg/瓶。通過4因素的R值判定它們影響愈傷組織總黃酮產(chǎn)量的主次順序?yàn)椋篘AA濃度＞ VC濃度＞KT濃度＞葉片月份；由于細(xì)胞生長(zhǎng)差異影響，銀杏愈傷組織中最佳黃酮積累條件并非適合生產(chǎn)黃酮，總黃酮產(chǎn)量的最佳組合為A2B2C1D1，即以5月份葉片為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織，在MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+5 mg/L VC條件下實(shí)際總黃酮產(chǎn)量達(dá)到最高。

3 討論

銀杏是藥用植物的開發(fā)熱點(diǎn)，穩(wěn)定高效地培養(yǎng)細(xì)胞，最大程度優(yōu)化培養(yǎng)條件是銀杏愈傷組織工業(yè)化生產(chǎn)黃酮的關(guān)鍵。植物細(xì)胞培養(yǎng)周期一般為20-40 d，本研究通過40 d的繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)銀杏愈傷組織接種到新培養(yǎng)基后，會(huì)經(jīng)歷一段緩慢生長(zhǎng)期，隨后在16 d左右進(jìn)入快速上升期，32 d后生長(zhǎng)開始變得平緩，褐化指數(shù)卻顯著升高，在32-40 d階段，褐化指數(shù)最高的第5組從23.13%上升至51.88%；認(rèn)為在實(shí)際生產(chǎn)中銀杏愈傷組織的合適繼代周期為24-32 d之間，生長(zhǎng)較快且不易褐化。

表7 銀杏愈傷組織總黃酮產(chǎn)量正交分析

愈傷組織的生長(zhǎng)與次生代謝受外植體影響，以銀杏不同部位為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，黃酮含量表現(xiàn)為葉＞莖＞子葉［15］，同時(shí)房惠勇等［16］認(rèn)為以原植物中次生代謝產(chǎn)物含量高的外植體誘導(dǎo)的愈傷組織，繼代培養(yǎng)中也更易積累該產(chǎn)物。銀杏葉愈傷組織培養(yǎng)中，供試外植體一般取4-6月銀杏樹當(dāng)年生嫩葉，細(xì)胞全能性強(qiáng)，誘導(dǎo)率較高且不易染菌；本實(shí)驗(yàn)通過研究4、5、6月中旬銀杏葉片誘導(dǎo)的愈傷組織，發(fā)現(xiàn)隨著外植體月份的延后，其誘導(dǎo)的愈傷組織在繼代中生長(zhǎng)指數(shù)降低，褐化指數(shù)增加，但總體差異不顯著；而銀杏愈傷組織中黃酮含量隨外植體采摘月份從4月到6月顯著升高，以6月葉片誘導(dǎo)的愈傷組織在40 d后黃酮含量達(dá)到平均最高值9.21 mg/g（DW）；對(duì)比4、5、6月中旬銀杏葉片發(fā)現(xiàn)，從4月到6月葉片黃酮含量同樣呈上升趨勢(shì)，認(rèn)為銀杏愈傷組織的黃酮含量與其外植體本身呈正相關(guān)關(guān)系。

激素是植物愈傷組織生長(zhǎng)與次生代謝的重要影響因子，在組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素間具有相互協(xié)同、拮抗等復(fù)雜的的調(diào)控關(guān)系，調(diào)節(jié)兩者的比值能達(dá)到不同的促進(jìn)效果。崔剛等［17］發(fā)現(xiàn)，相較于2，4-D和6-BA，NAA和KT的組合更適合銀杏愈傷組織生長(zhǎng)，且能提高繼代過程中銀杏細(xì)胞的葉綠素含量。本研究以NAA為生長(zhǎng)素，KT為細(xì)胞分裂素，通過正交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)激素中NAA濃度的增加會(huì)顯著提高愈傷組織繼代中的生長(zhǎng)指數(shù)，在NAA 濃度為3.0 mg/L時(shí)愈傷組織40 d時(shí)平均生長(zhǎng)指數(shù)可達(dá)到5.54，KT影響則不顯著；而HPLC結(jié)果顯示NAA與KT對(duì)愈傷組織中的黃酮含量都有顯著影響，且直觀分析顯示過低或過高的激素濃度均不利于黃酮積累，在本實(shí)驗(yàn)正交設(shè)計(jì)組中，以6月葉片為外植體，在3.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+5 mg/L VC組合下40 d時(shí)黃酮含量可達(dá)到最高值11.04 mg/g（DW），與5、6月銀杏葉黃酮含量接近，高于4月銀杏葉。據(jù)Cheng等［11］報(bào)道，以銀杏胚芽為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織，在MS+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA條件下繼代，45 d時(shí)黃酮含量為12.5 mg/g（DW）；而陳學(xué)森等［15］將繼代3個(gè)月的葉愈傷組織進(jìn)行不同激素處理，發(fā)現(xiàn)在3.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA的激素配比下，40 d后黃酮含量可達(dá)23.7 mg/g（DW）；通過與前人實(shí)驗(yàn)中銀杏愈傷組織黃酮含量差異對(duì)比，認(rèn)為銀杏愈傷組織黃酮含量的影響因素是多元復(fù)合的，不僅受到激素種類和濃度影響，還受到種質(zhì)資源、取材樹樹齡、取材部位、抗褐化劑等因子共同作用。

褐化是銀杏愈傷組織繼代中的常見問題，主要是由于愈傷組織內(nèi)酚類物質(zhì)易與空氣中的氧結(jié)合形成醌類物質(zhì)，使愈傷組織色澤轉(zhuǎn)為褐色的同時(shí)阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝；合適的抗褐化劑能通過吸附或還原多酚，降低愈傷組織褐化率。VC是一類防氧化抗褐化劑，廣泛用于組培中的抗褐化研究，高紅兵等［18］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加VC能通過防止天女木蘭中的咖啡酸與綠源酸氧化，使其外植體褐化率由52.2%降至12.2%；本實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基VC濃度由5 mg/L升高到10 mg/L時(shí)，銀杏愈傷組織平均褐化指數(shù)由45.00%降至22.71%，效果顯著（P＜0.05），是經(jīng)濟(jì)有效的愈傷組織抗褐化添加品。但研究同樣發(fā)現(xiàn)VC濃度升高到20 mg/L時(shí)會(huì)顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和黃酮積累，并提升褐化指數(shù)，猜測(cè)可能是高濃度VC降低了培養(yǎng)基PH，而培養(yǎng)基過酸或過堿都會(huì)阻礙細(xì)胞正常生長(zhǎng)［13］，需要在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中嚴(yán)格控制濃度范圍。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)一定范圍內(nèi)的VC雖然降低了愈傷組織褐化指數(shù)，但也降低了黃酮總產(chǎn)量，這其中的機(jī)理反應(yīng)，還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過誘導(dǎo)4、5、6月銀杏葉片形成愈傷組織，建立了穩(wěn)定的銀杏愈傷組織繼代體系。并發(fā)現(xiàn)銀杏愈傷的最佳繼代周期為24-32 d；最佳生長(zhǎng)組合為4月葉片誘導(dǎo)的愈傷組織+3.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+5 mg/L VC；褐化指數(shù)最低的組合為4月葉片誘導(dǎo)的愈傷組織+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+10 mg/L VC，適宜在銀杏愈傷組織培養(yǎng)中長(zhǎng)期繼代；最佳黃酮積累組合為：6月葉片誘導(dǎo)的愈傷組織+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+5 mg/L VC；結(jié)合愈傷組織干重與黃酮含量，發(fā)現(xiàn)不同于黃酮含量最高的條件，實(shí)際總黃酮產(chǎn)量最高的組合為5月葉片為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+5 mg/L VC，適合利用銀杏細(xì)胞生產(chǎn)黃酮。