部分玉米種質(zhì)南繁區(qū)自然條件下抗銹性評(píng)價(jià)

劉秀峰，吳紅宇，樓辰軍，楊兆順，袁文婭，許高平

（1.天津市農(nóng)作物研究所，天津300381；2.禾雨鑫農(nóng)業(yè)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，河北涿州072750）

玉米銹病是影響玉米生產(chǎn)的重要病害，在已報(bào)道的4種玉米銹病中[1]，我國(guó)主要發(fā)生的有由玉米柄銹菌（Puccinia sorghi Schw.）引起的普通玉米銹病和由玉米多堆柄銹菌（Puccinia polysora Underw.）引起的玉米南方銹病。其中，普通玉米銹病是我國(guó)東北地區(qū)玉米發(fā)生的主要類型，華北、華南和西南等地區(qū)也是普通玉米銹病的發(fā)生區(qū)域[2]。一般認(rèn)為，該病害對(duì)玉米產(chǎn)量影響不大，但近年有為害加重的趨勢(shì)。玉米南方銹病于1891年首次在鴨茅狀摩擦禾（Tripsacum dactiloides）干標(biāo)本上被發(fā)現(xiàn)，于1897年被正式定名[3]。玉米南方銹病于1950年在西非多個(gè)國(guó)家大流行，造成嚴(yán)重?fù)p失。在此之前，西非的玉米銹病均為普通型銹病，對(duì)玉米產(chǎn)量影響很小[4]。在我國(guó)，20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)了玉米南方銹病在海南、臺(tái)灣發(fā)生為害[2，5]。隨著氣候及耕作制度的變化，加之當(dāng)前生產(chǎn)上主要玉米品種缺乏抗銹性，玉米南方銹病由僅為害南方玉米區(qū)逐步向北方玉米種植區(qū)擴(kuò)展。1997—1998年玉米南方銹病在浙江淳安縣、河北省邯鄲、滄州地區(qū)以及山東、河南、江蘇大面積暴發(fā)[6-7]。2015年玉米南方銹病在黃淮海夏玉米產(chǎn)區(qū)大流行，造成嚴(yán)重減產(chǎn)[8]。目前，玉米南方銹病在全國(guó)20多個(gè)省份均有報(bào)道，由于該病害可遠(yuǎn)距離傳播，病原菌可能隨強(qiáng)氣流在更大的區(qū)域擴(kuò)散。

布局抗病品種是控制玉米銹病經(jīng)濟(jì)、安全的措施，多國(guó)推廣抗病品種防治玉米銹病已取得明顯成效[9]。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，不同玉米品種、自交系對(duì)銹菌的抗性差異很大[10-16]，玉米種質(zhì)抗性水平差異明顯，為培育抗病品種提供了可能。玉米育種除考慮抗病特性外，還需要綜合考慮結(jié)實(shí)性等豐產(chǎn)性狀，已報(bào)道的玉米品種（品系）抗銹性多為在當(dāng)?shù)剌o以人工接種進(jìn)行的抗性鑒定。

本研究于海南三亞南繁區(qū)玉米銹病自然發(fā)生條件下，對(duì)創(chuàng)制的部分玉米種質(zhì)進(jìn)行抗銹鑒定與評(píng)價(jià)，旨在了解這些玉米種質(zhì)對(duì)玉米銹病的抗性水平，以期為培育兼具豐產(chǎn)性和抗銹性的玉米品種篩選骨干種質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試玉米種質(zhì)共161份，其中，蘭卡斯特（Lancaster）群、瑞德（Reid）、Lancaster/衣阿華瑞德黃馬牙（Iodent）、黃早四/Iodent以及Reid/黃早四、Reid/Lancaster、黃早四/旅大紅骨改良系分別為3，5，5，8，43，29，66 份，除對(duì)照自交系外，其余各玉米種質(zhì)均為筆者選育創(chuàng)制。

1.2 方法

試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)在海南省三亞市黃流鎮(zhèn)，每份種質(zhì)種植5行區(qū)，最終每行留苗25株。至散粉期未噴施殺菌劑。

1.2.1 玉米銹病病原鑒定 在玉米進(jìn)入散粉期，采集發(fā)病病葉，用4%戊二醛固定后掃描電鏡觀察。刮取葉片上銹菌孢子，液氮研磨，用CTAB法提取玉米樣品中銹菌的DNA，利用CROUCH等[17]設(shè)計(jì)的區(qū)分普通銹菌和南方銹菌的2對(duì)引物POLYF/POLYR和COMF/COMR（POLYF序列為 5′-ccaagaggtacac ctgtttgagt-3′，POLYR 序列為 5′-CATTATTACACAT CAAGTCAATCCA-3′；COMF 序列為 5′-CCAAAAG GCACACCTGTTTGAGT-3′，COMR 序列為 5′-AATT ATTACACATCAAGTCAATCCA-3′）對(duì)樣品中銹菌分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后分別利用低熔點(diǎn)瓊脂糖回收片段，連接pTZ57R/T載體。轉(zhuǎn)化后每個(gè)樣品挑選至少3個(gè)陽(yáng)性克隆重復(fù)測(cè)序。將序列分別在NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)。引物由蘇州金唯志生物技術(shù)有限公司合成，序列測(cè)定由北京信諾金達(dá)生物科技有限公司完成。

1.2.2 玉米銹病調(diào)查方法 銹病調(diào)查在玉米散粉期進(jìn)行，每份種質(zhì)調(diào)查5行，每行連續(xù)調(diào)查25株。發(fā)病嚴(yán)重度按照傅俊范等[18]玉米銹病調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情分級(jí)：0級(jí)，葉片上無(wú)可見(jiàn)病斑；1級(jí)，發(fā)病面積占葉面積5%以下（包括5%）；2級(jí)，發(fā)病面積占葉面積5%～10%（包括10%）；3級(jí)，發(fā)病面積占葉面積10%～25%（包括25%）；4級(jí)，發(fā)病面積占葉面積25%～40%（包括40%）；5級(jí)，發(fā)病面積占葉面積40%～65%（包括65%）；6級(jí)，發(fā)病面積占葉面積65%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米銹病病原菌鑒定

玉米散粉期黃流鎮(zhèn)田間銹病自然發(fā)生較為普遍，夏孢子堆分布于葉片正面，淡黃色，呈卵圓形。采集發(fā)生銹病的病葉，用4%戊二醛固定液抽氣固定，掃描電鏡觀察到夏孢子表面具有交錯(cuò)排列的較密集的刺突，刺突基部外圍有近圓形凹陷的脊（圖1）。部分刺突傾倒可能是由樣品抽氣處理所導(dǎo)致。

利用引物POLYF/POLYR對(duì)20個(gè)玉米銹病病原菌的rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，18個(gè)標(biāo)樣均能得到約300 bp的單一片段（圖2），對(duì)該片段用低熔點(diǎn)瓊脂糖回收、T載體克隆測(cè)序，分析表明，各擴(kuò)增片段序列為288 bp，序列間堿基相似性為100%。Blast比對(duì)結(jié)果顯示，三亞市黃流鎮(zhèn)玉米銹病病原菌擴(kuò)增序列與CROUCH等[17]登錄的玉米南方銹病病原菌（GenBank：HQ189432）的堿基序列相似性為99%。利用引物COMF/COMR對(duì)上述20個(gè)銹病病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未得到可辨產(chǎn)物。這些結(jié)果顯示，本研究南繁種植點(diǎn)玉米銹病病原菌為玉米多堆柄銹菌（Puccinia polysora Underw.）。

2.2 玉米種質(zhì)對(duì)南方銹病的抗性表現(xiàn)

通過(guò)在玉米散粉期進(jìn)行銹病田間調(diào)查，明確了創(chuàng)制種質(zhì)對(duì)南方銹病的抗性等級(jí)（表1）。供試的161份玉米種質(zhì)中，對(duì)照種質(zhì)黃早四高感南方銹??；對(duì)玉米南方銹病抗性表現(xiàn)為 1，2，3，4，5級(jí)的材料分別占總種質(zhì)的42.86%，19.25%，16.15%，13.04%和8.07%；未發(fā)現(xiàn)對(duì)玉米南方銹病免疫的種質(zhì)材料。表現(xiàn)抗病及高抗的種質(zhì)有100份，高感的種質(zhì)有14份（表1）。

表1 玉米種質(zhì)對(duì)南方銹病抗性表現(xiàn)

結(jié)果表明，不同玉米種質(zhì)對(duì)南方銹病的抗性存在明顯差異。供試的Lancaster，Reid以及Lancaster/Iodent改良系的抗病性表現(xiàn)為高抗和中抗。Reid/Lancaster改良的29份種質(zhì)中表現(xiàn)抗病和高抗的有22份，中度抗病的有5份，僅有2份表現(xiàn)為感病。高感南方銹病但結(jié)實(shí)性優(yōu)良的黃早四分別和Iodent，Reid改良后，各自有接近1/2的改良材料表現(xiàn)為抗病或者高抗（表1）。黃早四與旅大紅骨改良的種質(zhì)中，43份（占比65.2%）表現(xiàn)抗病及高抗，12份（占比18.2%）種質(zhì)材料高感南方銹病。熱帶種質(zhì)自交系8085泰高抗玉米南方銹病。本研究中，玉米種質(zhì)的大多數(shù)對(duì)南方銹病表現(xiàn)抗病或中度抗病，而含有熱帶血緣的材料表現(xiàn)高度抗病，這與前人的研究結(jié)果一致。通過(guò)本研究鑒定篩選的這些材料對(duì)玉米抗銹育種具有重要價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

海南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣、云南、貴州、山東、陜西、山西、河北等地玉米普通銹病和南方銹病2種病害都有發(fā)生，尤其是玉米南方銹病在我國(guó)發(fā)生范圍逐步北擴(kuò)，已在我國(guó)多個(gè)省份多次發(fā)生大流行，目前已經(jīng)成為南方和黃淮海玉米主產(chǎn)區(qū)的一種主要病害。分析其流行的原因，可能與當(dāng)前主栽品種鄭單958、先玉335等品種抗性差[18]、病原菌小種的適應(yīng)性[19]有一定的關(guān)系；另外，強(qiáng)氣流北上加快了銹菌夏孢子在玉米產(chǎn)區(qū)的傳播速度，可能促使玉米南方銹病發(fā)生范圍向北擴(kuò)展。

由于種植戶防治玉米病害管理措施粗放以及玉米生長(zhǎng)后期施藥困難的特點(diǎn)，面對(duì)玉米銹病加重發(fā)生的嚴(yán)峻形勢(shì)，解決生產(chǎn)上的病害問(wèn)題，急需加強(qiáng)玉米抗銹性研究和品種選育，篩選適宜當(dāng)?shù)胤N植的抗性品種，遏制玉米銹病的流行勢(shì)頭。同時(shí)，玉米抗銹品種選育除考慮其抗病特性外，還應(yīng)考慮品種豐產(chǎn)性、脫水性、抗倒性以及環(huán)境適應(yīng)性等多個(gè)因素。試驗(yàn)證明，一些熱帶種質(zhì)具有優(yōu)良的抗銹性，但由于生育期長(zhǎng)、適應(yīng)性差、品質(zhì)差等原因難以直接用于玉米育種。Lancaster群、Reid群、Iodent群以及旅大紅骨群被育種者普遍認(rèn)可，將熱帶種質(zhì)導(dǎo)入這些優(yōu)勢(shì)群的代表自交系，經(jīng)多代回交轉(zhuǎn)育有望獲得優(yōu)良抗銹種質(zhì)材料進(jìn)而配制玉米新組合。由于育種方向原因，筆者的種質(zhì)中未使用抗銹性十分突出的齊319[20]，而是充分利用Lancaster群、Iodent群和Reid群種質(zhì)的抗病性，輔以8085泰等不同的抗源材料導(dǎo)入這些優(yōu)勢(shì)群的優(yōu)良自交系。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，優(yōu)良自交系黃早四與Reid群改良材料中高抗玉米南方銹病的種質(zhì)少，而黃早四/旅大紅骨改良材料中高抗玉米南方銹病的比例較高，有望篩選出兼具豐產(chǎn)性、適應(yīng)性和抗銹性的種質(zhì)材料。