達烏里胡枝子沒食子酸提取條件的優(yōu)化

趙宇星，李小鵬，任 敏，趙 祥

（山西農業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801）

植物酚類物質是由植物的次生代謝途徑產(chǎn)生的，其在植物體內分布廣泛、種類繁多，但是對植物的初級生產(chǎn)沒有直接影響，而是作為一種次生防御物質發(fā)揮著重要的作用[1]。酚類物質是植物體內普遍存在的次生代謝物，廣泛存在于植物的葉、根、皮、花和果實中[2]。酚酸類物質對多種植物病原真菌均可抑制活性[3]。達烏里胡枝子（Lespedeza davurica）是豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionatae）胡枝子屬（Lespedza Michx.）的喜暖旱中生半灌木，其含有豐富的酚類物質[4]，干旱脅迫能夠顯著提高達烏里胡枝子的抗氧化能力[5]。沒食子酸（Gallic acid，GA）又稱五倍子酸，是一種天然酚類化合物[6]，能夠抗菌、抗突變、消除自由基[7]。因此，沒食子酸在提高植物適應極端環(huán)境方面發(fā)揮著重要作用。

目前，胡枝子屬植物不僅被廣泛用于各種動物的飼草，而且在藥用領域也有著廣泛的應用[8]；已從達烏里胡枝子中分離鑒定了香葉木素、山奈酚、檉柳素、木犀草素、槲皮素等11種化合物[4]。達烏里胡枝子的研究多集中在自然狀態(tài)下胡枝子體內的單寧含量，但是對達烏里胡枝子酚類次生代謝物質的研究較少。

本試驗以達烏里胡枝子為對象，研究了其沒食子酸最佳的提取工藝及其最優(yōu)測定條件，旨在為達烏里胡枝子沒食子酸的提取和利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為晉農1號達烏里胡枝子，由山西農業(yè)大學牧站草學實驗室種子資源庫提供。沒食子酸標準品（99%），來源于北京索萊寶公司。

1.2 試驗設計

試驗采用盆栽方式，于2016年4月1日在山西農業(yè)大學草業(yè)科學系溫室中進行，平均溫度為14.5～29.5℃，相對濕度為64%～79%。土壤來源于試驗田用地過篩耕層土（0～20 cm），與細沙2∶1混合，pH值為7.5，并測得田間最大持水量約為24%。

試驗采用上端口直徑為21 cm、高26 cm的塑料桶，每桶裝風干土約7.5 kg，播種量為55粒/盆。待苗齊后，每桶留苗25株。待達烏里胡枝子長到分枝期取樣放置于裝有冰袋的泡沫箱中，迅速帶回實驗室保存于超低溫-80℃冰箱，以備測定。

1.2.1 達烏里胡枝子單因素提取試驗 設定蒸餾水、60%甲醇、60%乙醇為提取溶劑，其他提取條件為固液比1∶40，超聲時間30 min，超聲溫度40℃；提取溶劑濃度為20%，40%，60%，80%共4個梯度，其他提取條件為固液比1∶50，超聲時間30 min，超聲溫度60℃；固液比為1∶30，1∶40和1∶50，其他提取條件提取溶劑為60%甲醇，超聲時間30 min，超聲溫度60℃；測定時間為30，45，60 min，其他提取條件為提取溶劑為60%甲醇，固液比1∶40，超聲溫度60℃；測定溫度分別設定為40，50，60，70℃，其他提取條件提取溶劑為60%的甲醇，固液比1∶40，超聲時間為30 min，測定達烏里胡枝子沒食子酸含量，確定單因素提取條件。

1.2.2 正交試驗確定沒食子酸的最佳提取條件根據(jù)單因素試驗確定的因素和水平，選取溶劑濃度（A）、固液比（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）4個因素，采用正交表L9（34）進行試驗，以確定沒食子酸的最佳提取條件（表1）。

1.2.3 沒食子酸含量的測定

1.2.3.1 分析樣品的制備 精確稱取達烏里胡枝子樣品0.200 g（±0.005 g），加入有提取溶劑10 mL的具塞試管中，超聲提取，超聲后離心取上清液，過0.45 μm濾膜，供試驗測定。

1.2.3.2 色譜條件的確定 采用Waters 1500高效液相色譜儀-2489紫外檢測器測定，C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，分別選取色譜條件：甲醇-0.1%磷酸[9]（色譜條件1）；乙腈（A）-0.1%磷酸（梯度洗脫0～10 min，A 2%～10%）[10]（色譜條件2）；乙腈（A）-0.2%冰醋酸（梯度洗脫 0～10 min，A 5%～12%）[11]（色譜條件3）；乙腈（A）-0.15%三氟乙酸（梯度洗脫0～10 min，A 0%～7%）[12]（色譜條件4）；乙腈（A）-0.15%三氟乙酸（梯度洗脫0～5 min，A 0%～3%）[13]（色譜條件5），測定達烏里胡枝子沒食子酸含量，以確定色譜條件。

1.2.3.3 沒食子酸標準液相色譜 其色譜圖如圖1所示。

1.2.3.4 標準曲線的繪制 準確稱取沒食子酸對照品20.0mg，甲醇溶解并定容到100mL，得200μg/mL的沒食子酸溶液，以此液為母液，進一步稀釋成濃度梯度為 0.5，1，5，10，15，20 μg/mL 的沒食子酸溶液，分別取20 μL進樣于高效液相色譜儀進行測定，并且以峰面積為縱坐標，沒食子酸含量為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精確稱取達烏里胡枝子樣品8份各0.200 g，按正交試驗結果中最優(yōu)條件進行提取，制備提取液，每隔15 min測定一份，記錄數(shù)據(jù)并計算標準偏差RSD值。

1.3.6 加樣回收率試驗 精確稱取達烏里胡枝子樣品8份各0.200 g，按正交試驗結果中最優(yōu)條件進行提取，制備提取液，向各個樣品浸提液中分別加入一定量的標樣，測定含量，計算加樣回收率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2016和SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析（ANOVA）比較不同處理間達烏里胡枝子沒食子酸含量差異顯著性。使用SigmaPlot 13.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 達烏里胡枝子沒食子酸最佳提取條件篩選

2.1.1 提取溶劑對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響 不同提取溶劑對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響不同（圖2），其中，用60%甲醇提取溶劑提取時，測得沒食子酸含量最高，為7.65 mg/g；用蒸餾水溶劑提取時，測得沒食子酸含量最低，為6.16mg/g。3種溶劑測得沒食子酸含量由高到低順序為60%甲醇＞60%乙醇＞蒸餾水。因此，選擇60%甲醇為提取的最佳溶劑。

2.1.2 提取溶劑濃度對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響 不同提取溶劑濃度對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響不同（圖3），隨著甲醇濃度的升高沒食子酸含量表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢，當甲醇濃度為60%時，沒食子酸含量達最大值，為9.49mg/g；當甲醇濃度超過60%時，沒食子酸含量有明顯降低的趨勢。因此，選擇60%為最佳提取溶劑濃度。

2.1.3 提取固液比對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響 不同固液比對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響不同（圖4），當固液比為1∶40時，沒食子酸含量最高，為9.04 mg/g。因此，選擇1∶40為最佳提取固液比。

2.1.4 提取時間對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響 不同提取時間對達烏里胡枝子沒食子酸浸出速度的影響不同（圖5），當提取時間為30～45min時，達烏里胡枝子沒食子酸浸出速度較快；當提取時間為45～60 min時，沒食子酸含量浸出速度較慢，且在60 min時沒食子酸含量達到最大值，為9.283 mg/g；當浸提時間超過60 min后，沒食子酸含量開始降低。因此，選擇60 min為最佳提取時間。

2.1.5 提取溫度對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響 不同提取溫度對達烏里胡枝子沒食子酸浸出速度的影響不同（圖6），隨著溫度的升高，達烏里胡枝子沒食子酸含量增加，當提取溫度超過50℃時，沒食子酸含量增長的幅度較大，且在60℃時達到最大值，為9.523 mg/g；60℃以后溫度繼續(xù)升高，沒食子酸含量反而降低，且降低幅度較大。因此，選擇60℃作為最佳提取溫度。

2.2 高效液相色譜測定條件對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響

2.2.1 色譜條件1對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響 采用甲醇和0.1%的磷酸作為流動相，甲醇與水的比例為1∶9時，沒食子酸的峰與雜質峰未完全分離（圖7），且洗脫出的其他雜質峰偏多，并未出現(xiàn)較為理想的色譜圖。

2.2.2 色譜條件2對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響 采用乙腈（A）與0.1%的磷酸（B）作為流動相，梯度洗脫0～10 min，A 2%～10%，體積流量1 mL/min，檢測波長280 nm時，雜質峰仍然較多（圖8），未得到較好的色譜圖。

2.2.3 色譜條件3對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響 采用乙腈（A）-2%冰醋酸（B）為流動相，梯度洗脫0～10min，A5%～12%；體積流量1mL/min，檢測波長280 nm，柱溫28℃，雜質峰仍然較多（圖9），并未得到理想的色譜圖。

2.2.4 色譜條件4對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響 采用乙腈（A）和0.15%三氟乙酸（B）作為流動相，梯度洗脫0～10min，A0%～7%；10～20min，A7%～16%，體積流量1 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫28℃，雜質峰明顯減少，但沒食子酸前后峰保留時間與沒食子酸峰保留時間較近（圖10），未得到較為理想的色譜圖。

2.2.5 色譜條件5對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響 將色譜條件4優(yōu)化后，用乙腈（A）和0.15%TFA（B）作為流動相，梯度洗脫變?yōu)?0～5 min，A 0%～3%，體積流量1 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫30℃，色譜圖如圖11所示，得到了較好的沒食子酸色譜圖。

2.3 綜合提取條件對達烏里胡枝子沒食子酸含量的影響

通過正交試驗可知，綜合影響達烏里胡枝子沒食子酸含量的最佳提取條件4個因素的主次順序為A＞B＞D＞C，即提取溶劑濃度、固液比、提取溫度、提取時間，A2B2C1D2為最佳提取工藝（表2）。結合單因素試驗，根據(jù)沒食子酸提取規(guī)律，最終選擇溶劑濃度為60%甲醇，固液比為1∶40，提取時間為45 min，提取溫度為60℃。在此條件下，測得達烏里胡枝子沒食子酸的保留時間為2.837 min，沒食子酸色譜峰的理論塔板數(shù)均不低于5 000，沒食子酸與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，說明沒食子酸與其他雜質色譜峰達到了基線分離（圖11）。

表2 正交試驗確定沒食子酸最佳條件

沒食子酸的峰面積（Y）與沒食子酸的濃度（X）回歸方程為：Y＝5.094X＋7.594 4（R2＝0.999 362），表明沒食子酸在4.91～30.64 μg/mL范圍內，沒食子酸峰面積值與質量濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關系。在 0，0.25，0.5，1，2，4，8，24 h 測得達烏里胡枝子沒食子酸含量為7.30～7.73 mg/g，其RSD值為0.021%（表3），表明24 h內供試液穩(wěn)定性良好。按照已知的方法對樣品液制備處理，且用已知的色譜條件進行沒食子酸含量的測定，最終計算出達烏里胡枝子沒食子酸平均含量為7.57 mg/g，并計算回收率，結果表明，平均回收率為99.58%，RSD為0.30%（表 4）。

表3 穩(wěn)定性測定結果

表4 加樣回收率測定結果

3 討論

本研究采用超聲提取法對達烏里胡枝子沒食子酸含量進行測定，以60%甲醇、60%乙醇、蒸餾水作為提取溶劑進行提取，結果發(fā)現(xiàn)，60%甲醇提取的沒食子酸含量最高，并選取20%，40%，60%，80%的甲醇分別進行提取，結果表明，60%甲醇提取的沒食子酸含量最高，與關瀟瀅等[13]和金玲等[14]以甲醇作為提取溶劑，沒食子酸含量最高，穩(wěn)定性最好，峰形對稱，分離度好的結果一致。故選用60%甲醇作為提取溶劑。

本研究通過采用 1∶30，1∶40，1∶50的固液比分別進行提取，結果表明，固液比為1∶40時，提取的沒食子酸含量最高，原因可能是由于在一定的體積范圍內，增加提取液的體積可增大提取液與提取物的接觸面積，使得沒食子酸在甲醇中較多溶出，但隨著提取液體積的增加沒食子酸溶出達到飽和，再增加提取液的體積，沒食子酸的溶出會減小[15]。故選取1∶40作為固液比。

本研究通過采用 30，45，60，75 min 作為提取時間分別進行提取，結果表明，60 min時，沒食子酸含量最高，原因可能是由于60 min之前，沒食子酸溶出不完全；當時間到達60 min時，沒食子酸含量溶出達到最大值；60 min之后，隨著時間的延長，沒食子酸受到氧化的時間延長，沒食子酸含量故而下降[16-17]。因此，選取60 min作為提取時間。

本研究通過采用40，50，60，70℃作為提取溫度分別進行提取，結果表明，60℃時，沒食子酸含量最高，這是由于隨著溫度的升高，分子熱運動速度加快，滲透、擴散、溶解速度加快，使沒食子酸更容易從細胞中轉移到溶劑中，從而使沒食子酸的含量提高；當溫度上升到一定程度時，部分沒食子酸可能被氧化破壞，或者由于沒食子酸分子結構改變，從而使其含量下降[15]。故選取60℃作為提取的溫度。

本研究通過正交試驗，確定達烏里胡枝子沒食子酸的最佳提取工藝，最佳提取條件為溶劑濃度為60%甲醇，固液比為1∶40，提取時間為45 min，提取溫度為60℃，這與黃斌等[17]的研究結果相似。

對沒食子酸對照品甲醇溶液的紫外可見光（190～600 nm）掃描發(fā)現(xiàn)，沒食子酸在280 nm處有最大吸收波長。故選擇280 nm為其檢測波長。

流動相分別考察了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%冰醋酸、乙腈-0.15%三氟乙酸，結果發(fā)現(xiàn)，流動相為乙腈-0.15%三氟乙酸時，峰型和分離度均較好；其他條件下，雜質峰較多，且與沒食子酸峰未完全分離。故選用乙腈-0.15%三氟乙酸作為流動相。

4 結論

本研究通過正交試驗，得到達烏里胡枝子沒食子酸最佳提取條件為溶劑濃度60%甲醇、固液比為1∶40、提取時間為45 min、提取溫度為60℃，在該條件下，采用乙腈-0.15%三氟乙酸梯度洗脫，流量為1 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫30℃。結果表明，沒食子酸在4.91～30.64 μg/mL范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，平均加樣回收率為99.58%，RSD為0.30%；并且利用上述方法，測得達烏里胡枝子沒食子酸含量為7.57 mg/g。