墨蘭“夢之蘭”雜交種子無菌播種繁殖技術(shù)

張月嬌

（福建省林業(yè)科技試驗中心，福建 南靖 363600）

我國蘭花資源豐富，已知有173屬，1 240種，主要分布于云南、臺灣和海南等地。我國蘭屬資源雖然比較豐富，但是開展雜交育種較晚，品種改良進(jìn)程緩慢。近年來，隨著花卉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，蘭花市場也跟著蓬勃發(fā)展，但墨蘭市場則顯得較為冷清，這與墨蘭育種工作研究不多，少有新品種發(fā)現(xiàn)和推出具有重要的關(guān)系[1-2]。墨蘭通過雜交育種獲得的一個蘭花果莢約能產(chǎn)生1.0×104～1.0×106粒種子，但非常細(xì)小，呈粉末狀，沒有胚乳，只有一個弱小的胚，胚內(nèi)含有很少的營養(yǎng)物質(zhì)，絕大部分為脂類物質(zhì)，外面覆蓋一層不透水不透氣的膜狀物質(zhì)，在自然環(huán)境中很不容易發(fā)芽。為能獲得新品種，開展無菌播種繁殖技術(shù)研究是解決蘭花種子萌發(fā)困難的有效途徑。

通過以墨蘭良種“夢之蘭”（良種編號：閩R-SCCS-038-2014)為母本開展雜交育種，對雜交獲得的果莢進(jìn)行無菌播種繁殖技術(shù)研究，為墨蘭的雜交育種及自主品種選育提供有利的參考依據(jù)。墨蘭良種“夢之蘭”雜交種子無菌播種繁殖技術(shù)還未見報道。

1 試驗材料

以“夢之蘭”與“大富貴”雜交獲得的果莢為試驗材料。

2 試驗方法

2.1 雜交果莢的獲得

選擇母本植株花葶中上部花蕾期長勢較好的花朵掛牌，每枝花葶保留1～3朵花，其余花朵全部去除，掛牌后每天觀察開花情況；選取當(dāng)天開放的父本花朵，取下父本蕊柱先端的藥帽，取出相互粘結(jié)的花粉塊備用；挑選開放3～7 d的母本花朵，將母本花朵蕊柱的花粉囊蓋打開，用鑷子輕輕地將花粉塊取出剔除；將父本的花粉塊放入母本蕊柱頂端下側(cè)的蕊腔中，去掉授粉花朵的唇瓣，隨即在授粉花朵的部位懸掛標(biāo)牌，寫明雜交組合父母本名稱（按母本在前、父本在后）、授粉日期和操作人。授粉時遮光75%，溫度24～28℃。

母本植株授粉成功的花朵子房開始膨大，逐漸發(fā)育長成果莢，定期觀察果莢的發(fā)育情況，待果莢轉(zhuǎn)為黃綠色且未開裂時，即可采收進(jìn)行無菌播種。

2.2 外植體的消毒處理

采收后的果莢先用軟毛刷輕輕刷去附著于表面的灰塵等雜質(zhì)，用沾有肥皂粉或洗潔精的軟毛刷進(jìn)行表面清潔，清水沖洗干凈，晾干后用鋒利的刀片切除花梗、殘留的柱頭等，裝進(jìn)廣口瓶中，置無菌超凈臺上進(jìn)行消毒處理，首先用75%酒精消毒30～60 s，無菌水沖洗2次后，再用0.1%的HgCl2振蕩消毒10～20 min，無菌水沖洗5次以上，瀝干水分備用。

2.3 原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

在超凈工作臺上，取出消毒后的果莢，吸干附著于表面的水分，用解剖刀切去果莢上下兩端的柱頭和果柄，剖開果莢，將種子播撒在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以因素基本培養(yǎng)基（改良MS、MS、KC）、6-BA(1.0、2.0、3.0 mg·L-1)和NAA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）為試驗因子，采用正交表L9(34)安排試驗[3]（表1），共9個試驗號，每個試驗號接種30瓶，180 d后調(diào)查統(tǒng)計原球莖萌發(fā)數(shù)和萌發(fā)率，篩選最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。

2.4 原球莖增殖培養(yǎng)基的選擇

在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，挑選出生長健壯、大小均勻的原球莖，接種于因素基本培養(yǎng)基（改良MS、MS、KC、B5），6-BA(1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1)、KT（1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1）、NAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1），采用正交表L16(45)安排試驗（表3），每個試驗號接種30瓶，60 d后調(diào)查統(tǒng)計其增殖倍數(shù)，篩選最佳增殖培養(yǎng)基配方。

2.5 原球莖分化培養(yǎng)基的選擇

將生長健壯的原球莖接種于以改良MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的因素6-BA(2.0、3.0、4.0 mg·L-1)、KT(2.0、3.0、4.0 mg·L-1)、NAA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1），采用正交表L9(34)安排試驗（表5），每個試驗號接種30瓶，60 d后觀察并統(tǒng)計原球莖分化出芽情況，篩選出最佳分化培養(yǎng)基配方。

2.6 生根壯苗培養(yǎng)基的選擇

當(dāng)分化出的芽苗長至3 cm以上時，即可接種于以改良1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的因素NAA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）、IBA(1.0、1.5、2.0 mg·L-1)、AC（1.0、1.5、2.0 g·L-1），采用正交表L9(34)安排試驗（表7），每個試驗號接種10瓶，每瓶接種10株小苗，50 d后調(diào)查統(tǒng)計平均生根數(shù)，篩選出最佳生根培養(yǎng)基配方。

2.7 培養(yǎng)條件

果莢無菌播種后在誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)時，先進(jìn)行7 d的暗培養(yǎng)后，再在培養(yǎng)室中進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照時間為12 h·d-1、溫度為（25±2）℃、光照強度為2 000 lx[4]，各階段的培養(yǎng)基糖用量為30 g·L-1，pH值為5.0～5.5。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同基本培養(yǎng)基和激素濃度對原球莖誘導(dǎo)影響

種子播種后，為保持培養(yǎng)空間的潔凈，7 d后需及時剔除污染的接種瓶。種子在播種3個月后，部分種子開始腫脹萌發(fā)，慢慢形成乳白色的球狀體，球狀體漸漸變大變綠，部分長出白色的絨毛[5-6]，播種6個月后，統(tǒng)計原球莖個數(shù)和萌發(fā)率，結(jié)果見表1。

表1 原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)正交試驗結(jié)果與分析Tab.1 Orthogonal test analysis results of protocorminduction culture

從表1的結(jié)果可以看出，各個試驗號均能誘導(dǎo)出原球莖，試驗3號（改良MS+6-BA 3.0mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1）誘導(dǎo)出的原球莖數(shù)最多（48個），從極差可以看出6-BA對試驗結(jié)果的影響最大，其次是基本培養(yǎng)基，再次是因素NAA；從萌發(fā)率可以看出，試驗3號（改良MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1）的萌發(fā)率最高（87%），從極差可以看出，6-BA對萌發(fā)率的影響最大，其次是基本培養(yǎng)基，再次是NAA。從不同激素濃度看，隨著6-BA和NAA的濃度升高，原球莖分化數(shù)和萌發(fā)率逐步增加，從各水平的結(jié)果看，當(dāng)6-BA的濃度為3.0 mg·L-1、NAA的濃度為1.5 mg·L-1時，其原球莖誘導(dǎo)數(shù)和萌發(fā)率的結(jié)果值最高。因此，得出墨蘭夢之蘭雜交果莢原球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1。

各因素對試驗結(jié)果的影響進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

表2 原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)正交試驗方差分析表Tab.2 Protocorm induced culture orthogonal test ANOVA

從表2的方差分析可以看出，基本培養(yǎng)基在原球莖誘導(dǎo)中的F值為256.00，大于F0.01,達(dá)到極顯著水平，6-BA在原球莖誘導(dǎo)中的F值為304.00，大于F0.01，達(dá)到了極顯著水平；在萌發(fā)率方差分析中，基本培養(yǎng)基的F值為50.08，大于F0.05小于F0.01，達(dá)到了顯著水平，6-BA的F值為59.15，大于F0.05小于F0.01，達(dá)到了顯著水平；NAA在原球莖誘導(dǎo)的F值為17.71，在萌發(fā)率的F值為6.08，均小于F0.05，表明NAA對原球莖的誘導(dǎo)和萌發(fā)率的影響不顯著。

3.2 不同基本培養(yǎng)基和激素濃度對原球莖增殖影響

原球莖在增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)膨大，30 d后開始分裂出一些白色球狀物；隨著培養(yǎng)時間的增長，白色球狀物漸漸變大變綠[7]，接種60 d后統(tǒng)計原球莖增殖倍數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 原球莖增殖培養(yǎng)正交試驗結(jié)果與分析Tab.3 Protocorm proliferation culture orthogonal test results

從表3中可以看出，各處理對原球莖的增殖均有一定的影響，從各試驗號來看，以試驗3號的增殖倍數(shù)最高（3.9）；其次為試驗4號和試驗8號，增殖倍數(shù)均為3.2。從R值可以看出，基本培養(yǎng)基對增殖倍數(shù)的影響最大，其次是KT,再次是NAA。從K值可以看出，基本培養(yǎng)基的第1水平最好，6-BA的第3水平最好，KT的第4水平最好，NAA的第3水平最好，由此，原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 2.0 mg·L-1+KT 2.5 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1。

對原球莖增殖的試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 原球莖增殖培養(yǎng)正交試驗方差分析表Tab.4 Protocorm proliferation culture orthogonal test ANOVA table

由表4可以看出，基本培養(yǎng)基和KT的F值均大于F0.05小于F0.01，說明基本培養(yǎng)基和KT對原球莖的增殖影響顯著，6-BA和NAA的F值均小于F0.05，說明6-BA和NAA對原球莖的增殖影響不顯著。

3.3 不同激素濃度對原球莖分化的影響

原球莖在分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后有白色芽點冒出，芽點慢慢變綠，葉原基逐漸發(fā)育長出幼葉，形成單株小苗，60 d后統(tǒng)計萌芽株數(shù)，結(jié)果見表5。

表5 不同激素濃度對原球莖分化的影響Tab.5 Effects of different hormone concentraitions on protocorm differentiation

從表5可以看出，不同激素濃度組合均能使原球莖分化出苗，其中試驗5號的萌芽株數(shù)最多（89株），從R值可以看出，KT的R值最高，表明KT對原球莖分化的萌芽數(shù)影響最大，其次是NAA，再次是6-BA。從K值可以看出，6-BA的第2水平最好，KT的第2水平最好，NAA的第3水平最好。

對原球莖分化試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表6 原球莖分化正交試驗方差分析表Tab.6 Protocorm differentiation orthogonal test ANOVA

從表6可以看出，因素6-BA、KT、NAA的F值均大于F0.05I小于F0.01,表明各因素對原球莖的分化均有顯著影響。從各因素的最優(yōu)水平可以得出，原球莖分化最佳培養(yǎng)基配方為改良MS+6-BA 3.0 mg·L-1+KT 3.0 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1。

3.4 生根壯苗培養(yǎng)基的選擇

將原球莖分化出帶有3片以上葉子、高3 cm以上的小苗接種于生根壯苗培養(yǎng)基中，20 d后，小苗基部有白色根點形成，50 d后統(tǒng)計平均生根數(shù)，結(jié)果見表7。

表7 不同因素對生根壯苗影響的結(jié)果Tab.7 Effects of different factors on rooting and seedlings

從表7中可以看出，各試驗號均能誘導(dǎo)出不定根，其中試驗5號誘導(dǎo)出的根數(shù)最多，平均生根數(shù)可達(dá)3.1條，從R值可以看出，IBA對誘導(dǎo)生根數(shù)的影響最大，從各水平的K值看，因素NAA的第2水平最好，因素IBA的第2水平最好，因素AC的第3水平最好。

對生根壯苗的試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8。

表8 不同因素對生根壯苗影響的方差分析表Tab.8 ANOVA table of different factors affecting rooting

從表8可以看出，IBA和AC對試驗結(jié)果有顯著影響，NAA對試驗結(jié)果影響不顯著。因此，結(jié)合各因素的最優(yōu)水平看，夢之蘭雜交種子生根壯苗的最適培養(yǎng)基為改良1/2MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 1.5 mg·L-1+AC 2.0 mg·L-1。當(dāng)培養(yǎng)基中的小苗根長至1 cm以上時，即可移到煉苗大棚進(jìn)行移栽煉苗。

4 討論與結(jié)論

蘭花種子在自然條件下萌發(fā)較為困難，主要與其胚發(fā)育不完全、種皮致密透氣性差和種皮中含有抑制物有關(guān)。而通過組織培養(yǎng)技術(shù)對果莢進(jìn)行無菌播種可有效獲取蘭花幼苗，是蘭花雜交育種和蘭花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)之一[8-9]。前人在蘭花的無菌播種方面也有一些報道，如藍(lán)炎陽等[10]使用MS為基本培養(yǎng)基，植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA和NAA，在種子萌發(fā)培養(yǎng)基中添加了活性炭，壯苗生根培養(yǎng)基中添加了香蕉泥和活性炭，建立了大花蕙蘭和墨蘭雜交種子的無菌播種方法，獲得了種子萌發(fā)、根狀莖增殖與分化、壯苗生根培養(yǎng)基的最適配方。張小娟等[11]運用MS培養(yǎng)基，附加植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA，建立了墨蘭種子無菌播種方法。陳汝民[7]等通過對墨蘭種子、原球莖和根狀莖的培養(yǎng)，獲得了墨蘭的幼苗。墨蘭“夢之蘭”是墨蘭的一個新品種，其雜交種子無菌播種繁殖技術(shù)還未見有報道，本研究系統(tǒng)介紹了以“夢之蘭”為母本開展雜交育種的過程和方法，對雜交種子無菌播種繁殖技術(shù)做了深入的闡述。研究發(fā)現(xiàn)，墨蘭“夢之蘭”雜交種子無菌播種基本培養(yǎng)基的主要組成也是MS培養(yǎng)基、6-BA和NAA，可見MS、6-BA和NAA是蘭花無菌播種培養(yǎng)方法中的關(guān)鍵成分。但通過對MS基本培養(yǎng)基中的大量元素進(jìn)行改良，對各培養(yǎng)階段附加的激素濃度進(jìn)行優(yōu)化組合研究，獲得了原球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1，原球莖增殖培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 2.0 mg·L-1+KT 2.5 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1，原球莖分化最佳培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 3.0 mg·L-1+KT 3.0 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1，生根壯苗培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為改良1/2MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 1.5 mg·L-1+AC 2.0 g·L-1，研究結(jié)果顯示，利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方可獲得大量有效的雜交子代幼苗。

蘭花無菌播種受諸多因素的影響，每一個環(huán)節(jié)都可能影響最終的成苗。在實際操作中主要需注意如下幾點：（1）誘導(dǎo)原球莖時，同一果莢的種子同時播種在相同的培養(yǎng)基中其萌發(fā)時間不一致，萌發(fā)時間間隔較長，在實際操作中，可將先萌發(fā)出的原球莖轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中，未萌發(fā)種子轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)萌發(fā)；（2）原球莖增殖培養(yǎng)時，增殖的原球莖必須及時進(jìn)行轉(zhuǎn)接，一般不宜超過90 d，否則會逐漸褐化死亡；（3）原球莖分化培養(yǎng)時，分化出的小苗長至3 cm高帶有3片葉子時即可轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，其余的原球莖轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。