柔木丹顆粒對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的治療作用

史曉燕，許小凡，宋 亮，李 倩，常占杰，席 奇，李京濤

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝病科，陜西 咸陽(yáng) 712000)

肝纖維化是慢性肝損傷導(dǎo)致的纖維生成和炎癥反應(yīng)過(guò)程，表現(xiàn)為肝細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過(guò)度增生和異常沉積，導(dǎo)致肝臟的結(jié)構(gòu)和功能異常，可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌，嚴(yán)重威脅人類的健康[1-2]。柔木丹顆粒由黃芪、皂刺、鱉甲、枳殼、柴胡、赤芍、丹參、川芎、漢防己等組成，針對(duì)肝纖維化的中醫(yī)病機(jī)和證型，方中黃芪甘溫補(bǔ)氣，皂刺、鱉甲軟堅(jiān)散結(jié)，枳殼、柴胡疏肝理氣，赤芍、丹參、川芎活血散瘀，漢防己利濕消腫，諸藥配伍寓“氣行則血行”、“血行則瘀散”之意，達(dá)到補(bǔ)氣活血、散結(jié)排毒之目的[3]。本研究旨在探索柔木丹顆粒對(duì)小鼠肝纖維化的治療作用，為其臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)雄性昆明小鼠30只，體質(zhì)量25～35 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030。將30只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、肝纖維化組及柔木丹組，每組10只。

1.2主要試劑與儀器柔木丹顆粒(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室，陜藥制字Z20160012)；四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)、無(wú)水乙醇(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，阿格利司(AGRIC)歐麗薇娜特級(jí)初榨橄欖油(西班牙億芭利橄欖油公司)，TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(日本TaKaRa公司)，蛋白提取、定量及Western blot相關(guān)試劑(武漢博士德生物工程有限公司)，Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR)引物(生工生物工程上海股份有限公司)。RM2235石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)，TC-120S型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、TB-718EL生物組織包埋機(jī)、TK-218II生物組織攤片、烤片機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司)，A1研究級(jí)正置數(shù)碼顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)，BCD-579WE低溫冰箱(青島海爾股份有限公司)，JY3002電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，蛋白電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)，7500 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems公司)，手術(shù)用剪刀、注射器、小鼠灌胃針、小鼠籠具(陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1肝纖維化小鼠模型的建立及給藥3組小鼠給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，于造模前1 d上午禁食不禁水24 h。肝纖維化組和柔木丹組小鼠腹腔注射含體積分?jǐn)?shù)20% CCl4的橄欖油混合液5 mL·kg-1，對(duì)照組小鼠腹腔注射相同體積的橄欖油，每周2次，連續(xù)8周；第3周起，柔木丹組小鼠灌胃柔木丹顆粒4 g·kg-1，每日1次，共6周；肝纖維化組和對(duì)照組小鼠灌胃相同體積的生理鹽水。

1.3.2小鼠體質(zhì)量及肝質(zhì)量測(cè)定實(shí)驗(yàn)前稱小鼠體質(zhì)量，末次給藥后小鼠禁食不禁水24 h(實(shí)驗(yàn)后)，稱體質(zhì)量；然后100 g·L-1水合氯醛溶液(4 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，取肝臟，稱肝質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量差及肝體比(肝體比=肝質(zhì)量/體質(zhì)量)。

1.3.3小鼠肝組織病理學(xué)檢測(cè)取0.2～0.3 cm厚度的肝組織，浸入體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片(厚度約3 μm)；按照常規(guī)步驟進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)和Masson染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3.4免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肝組織中α-SMA的表達(dá)取肝組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)3% H2O2室溫避光孵育10 min，純水沖洗3次，每次3 min；枸櫞酸緩沖液煮沸15 min修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min；50 g·L-1牛血清白蛋白室溫封閉1 h后滴加抗 α-SMA 的一抗(1200稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，用含Tween-20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution with Tween-20，PBST)沖洗5次，每次3 min；滴加生物素化山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，PBST沖洗5次，每次3 min；加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物室溫孵育40 min，PBST沖洗5次，每次3 min；二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5Real-timePCR檢測(cè)小鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、COL1A1和TIMP-1mRNA的表達(dá)取約30 mg肝組織，使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取小鼠肝組織總RNA。以總RNA為模板，經(jīng)PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR。以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算α-SMA、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白A1(collagen type Ⅰ A 1，COL1A1)、組織金屬蛋白酶抑制劑1(tissue-inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)的相對(duì)表達(dá)量。α-SMA上游引物序列為5′-GGCTCTGGGCTCTGTAAGG-3′，下游引物序列為5′-CTCTTGCTCTGGGCTTCATC-3′；COL1A1上游引物序列為5′-ACCTGTGTGT-TCCCTACTCA-3′，下游引物序列為5′-GACTGTTG-CCTTCGCCTCTG-3′；TIMP-1上游引物序列為5′-GGTGTGCACAGTGTTTCCCTGTTT-3′，下游引物序列為5′-TCCGTCCACAAACAGTGAGTGTCA-3′；TGF-β1上游引物序列為5′-GCCCTGGATACCAACTATTGC-3′，下游引物序列為5′-TGTTGGACAGCTGCTCCA-CCT-3′；GAPDH上游引物序列為5′-TGAACGG-GAAGCTCACTGG-3′，下游引物序列為5′-TCCACC-ACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.3.6Westernblot法檢測(cè)小鼠肝組織中α-SMA和TGF-β1蛋白的表達(dá)取30 mg肝組織，加入添加Protease and Phosphatase Inhibitor 的蛋白裂解液500 μL，充分勻漿，冰上孵育2 h，12 000×g、4 ℃離心10 min，吸取上清液，二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量；加等量的蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，用含50 g·L-1脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h；分別加抗β-actin(11 000)、抗TGF-β1(1200)、抗α-SMA(1200)的一抗，4 ℃下在搖床上孵育過(guò)夜，用加Tween-20的Tirs-HCl緩沖液漂洗3次，每次5 min；加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋度11 000 的山羊抗小鼠IgG或15 000的山羊抗兔IgG)，室溫下在搖床上孵育1 h，TBST漂洗3次，每次 5 min。加電化學(xué)發(fā)光液，利用凝膠成像系統(tǒng)，選擇合適的曝光時(shí)間拍照。

2 結(jié)果

2.13組小鼠體質(zhì)量及肝體比比較結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)前3組小鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.312，P>0.05)。肝纖維化組和柔木丹組小鼠體質(zhì)量增加顯著小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；柔木丹組小鼠體質(zhì)量增加顯著大于肝纖維化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。肝纖維化組小鼠肝體比顯著大于對(duì)照組和柔木丹組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；對(duì)照組與柔木丹組小鼠肝體比比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表13組小鼠體質(zhì)量及肝體比比較

組別n實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量/g實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量/g體質(zhì)量差/g肝體比對(duì)照組636.56±0.9844.50±0.887.94±1.070.043 3±0.001 5肝纖維化組636.75±1.1640.43±1.643.68±0.85a0.054 7±0.005 3a柔木丹組635.00±1.9141.14±1.776.15±0.62ab0.046 1±0.003 4b

注：與對(duì)照組比較aP<0.01；與肝纖維化組比較bP<0.01。

2.23組小鼠肝組織病理學(xué)變化結(jié)果見(jiàn)圖1。HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；肝纖維化組小鼠肝組織出現(xiàn)空泡，肝細(xì)胞明顯變形，肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞；柔木丹組小鼠肝組織損傷程度較肝纖維化組顯著改善。Masson染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，肝纖維化組小鼠肝臟膠原纖維沉積，出現(xiàn)明顯的纖維化；柔木丹組小鼠肝纖維化程度明顯減輕。

圖13組小鼠肝組織病理學(xué)變化(×100)

Fig.1Pathologicalchangesoflivertissuesofmiceinthethreegroups(×100)

2.33組小鼠肝組織中α-SMA表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3和表2。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝組織中未見(jiàn)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞；肝纖維化組小鼠肝組織中α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞大量增加，尤以中央靜脈周圍較明顯；柔木丹組小鼠肝組織中α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞較肝纖維化組減少，中央靜脈周圍幾乎無(wú)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。肝纖維化組小鼠肝組織中α-SMA蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；柔木丹組小鼠肝組織中α-SMA蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于肝纖維化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；柔木丹組與對(duì)照組小鼠肝組織中α-SMA蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：對(duì)照組；B：肝纖維化組；C：柔木丹組。

圖23組小鼠肝組織中α-SMA的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)

Fig.2Expressionofα-SMAinlivertissuesofmiceinthethreegroups(immunohistochemicalstaining，×200)

A：對(duì)照組；B：肝纖維化組；C：柔木丹組。

圖33組小鼠肝組織中α-SMA蛋白的表達(dá)(Westernblot)

Fig.3Expressionofα-SMAproteininlivertissuesofmiceinthethreegroups(Westernblot)

表23組小鼠肝組織中α-SMA蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

組別nα-SMA蛋白α-SMA mRNA對(duì)照組60.82±0.061.00±0.06肝纖維化組61.50±0.19a1.63±0.09a柔木丹組60.82±0.04b0.97±0.09b

注：與對(duì)照組比較aP<0.01；與肝纖維化組比較bP<0.01。

2.43組小鼠肝組織中COL1A1及TIMP-1mRNA表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)表3。肝纖維化組小鼠肝組織中COL1A1和TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；柔木丹組小鼠肝組織中COL1A1和TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于肝纖維化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；柔木丹組小鼠肝組織中COL1A1和TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表33組小鼠肝組織中COL1A1及TIMP-1mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

組別nCOL1A1 mRNATIMP-1 mRNA對(duì)照組61.00±0.051.00±0.03肝纖維化組660.65±3.31a8.34±1.22a柔木丹組617.06±2.75ab4.65±0.56ab

注：與對(duì)照組比較aP<0.01；與肝纖維化組比較bP<0.01。

2.53組小鼠肝組織中TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)圖4和表4。肝纖維化組小鼠肝組織中TGF-β1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；柔木丹組小鼠肝組織中TGF-β1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于肝纖維化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.160、11.873，P<0.01)；柔木丹組小鼠肝組織中TGF-β1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A：對(duì)照組；B：肝纖維化組；C：柔木丹組。

圖43組小鼠肝組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)(Westernblot)

Fig.4ExpressionofTGF-β1proteininlivertissuesofmiceinthethreegroups(Westernblot)

表43組小鼠肝組織中TGF-β1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

組別nTGF-β1蛋白TGF-β1 mRNA對(duì)照組60.90±0.121.00±0.03肝纖維化組62.18±0.22a1.82±0.11a柔木丹組61.21±0.08ab1.26±0.04ab

注：與對(duì)照組比較aP<0.01；與肝纖維化組比較bP<0.01。

3 討論

肝纖維化是多種原因引起的慢性肝損傷導(dǎo)致的纖維生成和炎癥反應(yīng)過(guò)程，是慢性肝病發(fā)展為肝硬化甚至肝癌的必經(jīng)階段[4]。目前研究認(rèn)為，肝纖維化階段尚有逆轉(zhuǎn)的可能，因此，尋找治療肝纖維化的有效藥物對(duì)肝硬化及肝癌的防治具有重要意義[5-6]。CCl4是一種選擇性肝毒性藥物，其進(jìn)入肝臟后經(jīng)氧化產(chǎn)生CCl3·及Cl·自由基，引發(fā)活性氧自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷肝細(xì)胞，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化，分泌大量α-SMA、COL1A1和TIMP-1等，破壞ECM的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[7-8]。此外，壞死的肝細(xì)胞所釋放的TGF-β1可能是激活鄰近HSC并使其分化為肌成纖維細(xì)胞的首要信號(hào)，對(duì)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展具有重要影響[9]。

中醫(yī)并無(wú)“肝纖維化”概念，根據(jù)其臨床癥狀、體征及病理特征可歸屬于“脅痛”、“積聚”、“癥瘕”、“鼓脹”等范疇，基本病機(jī)特點(diǎn)為氣陰兩虛、淤阻肝絡(luò)，基本治法為益氣養(yǎng)陰、活血化瘀[10-11]。由于肝纖維化是多因素、多環(huán)節(jié)相互作用的動(dòng)態(tài)發(fā)展過(guò)程，而中藥復(fù)方的優(yōu)勢(shì)恰好在于其作用具有多環(huán)節(jié)、多層次及多靶點(diǎn)性，且不良反應(yīng)較少，因此，深入研究中藥復(fù)方對(duì)肝纖維化的防治具有重要意義。

柔木丹顆粒治療肝纖維化具有一定的效果，但其作用方式和機(jī)制尚不明確。本研究采用腹腔注射CCl4的方法建立小鼠肝纖維化模型，并對(duì)模型小鼠灌胃柔木丹顆粒進(jìn)行干預(yù)，以探索柔木丹顆粒對(duì)肝纖維化的治療效果及相關(guān)機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，柔木丹顆粒可以顯著改善小鼠肝纖維化，減少膠原纖維沉積，使肝臟損傷得到改善，肝小葉結(jié)構(gòu)趨于正常。α-SMA在活化的HSC中大量表達(dá)，是肝纖維化的重要標(biāo)志[12]。本研究結(jié)果顯示，柔木丹顆?？梢燥@著降低小鼠肝組織中α-SMA的表達(dá)，但其作用是通過(guò)促進(jìn)活化的HSC凋亡還是抑制HSC的活化而實(shí)現(xiàn)，還有待深入研究[13]。COL1A1是ECM的重要組成部分，在肝內(nèi)占蛋白總量的5%～10%，當(dāng)肝臟發(fā)生纖維化時(shí)，膠原蛋白含量可增加至約50%[14]。TIMP-1在肝纖維化進(jìn)展過(guò)程中持續(xù)保持高水平，可與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)結(jié)合，使沉積的ECM不能被降解，導(dǎo)致MMP與TIMP之間平衡被破壞，進(jìn)一步促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[15]。本研究結(jié)果顯示，柔木丹顆粒能夠顯著降低COL1A1和TIMP-1的轉(zhuǎn)錄水平。TGF-β1是一種重要的細(xì)胞因子，不僅可誘導(dǎo)HSC的活化，還能激活TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，在肝纖維化中扮演著重要角色。本研究結(jié)果顯示，柔木丹顆?？梢越档蚑GF-β1的表達(dá)，但其是否會(huì)影響TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的作用，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，柔木丹顆粒能夠降低HSC中肝纖維化相關(guān)基因α-SMA、COL1A1和TIMP-1的表達(dá)，其作用可能是通過(guò)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中TGF-β1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。該研究可能為柔木丹顆粒在肝纖維化防治中的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。