直接抗病毒藥物治愈的慢性丙型肝炎患者NK細胞的免疫學特點分析

周文靖，史繼靜，李元元，王福生

慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C,CHC）是由HCV感染引起的一種嚴重威脅人類健康的傳染性疾病。病毒持續(xù)復制，機體HCV特異性免疫功能低下，誘發(fā)肝臟組織發(fā)生天然免疫和適應性免疫的損傷是CHC發(fā)生的主要病理基礎[1-2]。機體適應性免疫尤其是細胞免疫在清除病毒過程中起重要作用，但天然免疫亦是機體抗HCV感染不可或缺的關鍵部分[3]。NK細胞作為機體天然免疫系統(tǒng)的主要成分，不僅在HCV感染早期病毒的自發(fā)性清除中發(fā)揮重要作用[4]，還與慢性感染階段抗病毒治療效果有關[5]。當前，臨床采用直接抗病毒藥物（direct-acting antivirals,DAAs）可以治愈CHC，且療程短、服用方便、安全性好，較干擾素抗病毒治療具有極大的優(yōu)勢[6]。DAAs治療已逐漸替代聚乙二醇干擾素- α/利巴韋林方案，成為國內(nèi)外治療CHC的主要手段。

目前有關DAAs治療慢性HCV感染的研究較多集中在臨床療效方面，有關機體免疫學變化的研究較少。本研究對接受達拉他韋（daclatasvir,DCV）和阿舒瑞韋（asunaprevir,ASV）治療的初治型HCV 1b型CHC患者外周血NK細胞表型和功能進行研究，以探索DAAs治療對機體NK細胞免疫學特點的影響。

1 對象與方法

1.1 對象與材料

1.1.1 對象 納入2015年9月 2016年11月于原解放軍第三〇二醫(yī)院門診就診，且接受DCV/ASV治療的初治型HCV 1b型CHC患者13例。入組標準：①年齡≥18周歲；②僅為HCV 1b型感染；③初治受試者定義為既往未曾暴露于任何干擾素制劑、利巴韋林和DAAs；④篩選時HCV RNA≥104IU/ml ；⑤HIV-1和血清HBsAg陰性。排除標準：①有證據(jù)顯示除HCV感染以外的疾病所導致的慢性失代償性肝病，包括但不限于腹水、靜脈曲張出血或肝性腦??；②確診或疑似肝細胞癌或其他惡性腫瘤；③TBIL≥2 mg/dl（34 μmol/L）；④ ALT ≥ 5×ULN；⑤白蛋白＜3.5 g/dl（35 g/L）； ⑥ AFP ＞ 100 ng/ml（82.6 IU/ml）或AFP≥50 ng/ml且≤100 ng/ml（≥41.3 IU/ml且≤82.6 IU/ml）的受試者須進行肝臟超聲檢查，如疑似肝細胞癌則應排除；⑦HGB＜8.5 g/dl（85 g/L）；⑧中性粒細胞絕對計數(shù)＜0.5×109/L；⑨PLT＜50×109/L；⑩未受控制的糖尿病或高血壓；中、重度抑郁癥。所有患者均接受24周的DCV/ASV治療，治療結(jié)束后隨訪24周。另納入健康對照（healthy control,HC）13例（表1）。入組的所有受試者均簽署知情同意書。

表1 入組患者和健康對照的基線臨床資料Table 1 Baseline clinical data for enrolled CHC patients and healthy controls

1.1.2 材料 鼠抗人CD3-BV421、CD56-Percp、CD56-BV510、CD16-FITC、HLA-DR-BV421、CD38-PE-cy7、NKP46-BV510、NKP30-BV421、IFN-γ-PE-cy7、TNF-α-PE 等熒光抗體均購自美國Biolegend公司；鼠抗人NKG2A-PE購自美國R&D公司；CD107a-FITC熒光抗體、Golgistop、破膜劑及破膜洗液均購自美國BD公司；胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）、離子霉素（ionomycin,IONO）、1%多聚甲醛均購自美國Sigma公司；淋巴細胞分離液購自天津美德太平洋公司；IL-12購自美國PeproTech公司；IL-18購自美國Biovision公司；HCV核酸定量檢測試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HCV核酸定量檢測 使用HCV核酸定量檢測試劑盒定量檢測HCV RNA水平，該試劑盒的定量下限為50 IU/ml，檢測下限為25 IU/ml，HCV RNA＜25 IU/ml定義為檢測不到。

1.2.2 外周血單個核細胞的分離與凍存 分別于CHC患者接受治療第0周、1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周、16周、24周及治療結(jié)束后隨訪第4周、12周、24周采集EDTA抗凝外周靜脈血，另外分別采集13例HC外周抗凝靜脈血，1500 r/min離心10 min，留取血漿，將剩余細胞懸液用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離獲取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs），用含90%FBS和10%DMSO的細胞凍存液進行凍存。

1.2.3 NK細胞表型分子流式染色 復蘇凍存的PBMCs，調(diào)整濃度為 5×106/ml，取 100 μl置于流式管中加入表型抗體（CD3、CD56、CD16、CD38、HLA-DR、NKP30、NKP46、NKG2A），混勻，室溫避光孵育25 min；加入1 ml PBS，混勻，離心洗滌，1500 r/min，5 min；棄上清，拍干；用200 μl 1%多聚甲醛液重懸細胞，4 ℃避光保存，24 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.2.4 NK細胞脫顆粒（CD107a）和釋放IFN-γ、TNF-α檢測 復蘇凍存的PBMCs，用含10%FBS的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液重懸，按5×105/孔鋪入96孔細胞培養(yǎng)板中；向指定培養(yǎng)孔內(nèi)分別加入刺激因子 [PMA（50 ng/ml）+IONO（1 μg/ml）、IL-12（50 ng/ml）+IL-18（50 ng/ml）]，同時向每孔加入 Golgistop（10 μg/ml）和鼠抗人CD107a熒光抗體，混勻，放入37 ℃ CO2細胞培養(yǎng)箱孵育6 h；收集細胞至流式管中，加入1 ml PBS，震蕩混勻，1500 r/min離心5 min洗去刺激劑；棄上清液，加入表型抗體（CD3、CD16、CD56），避光孵育25 min；PBS洗滌后加入破膜劑，4 ℃避光破膜30 min；破膜洗液洗滌后加入IFN-γ、TNF-α單抗，避光孵育25 min；破膜洗液洗滌后，用300 μl 1%多聚甲醛液重懸細胞，4 ℃避光保存，24 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并用GraphPad Prism 6.0進行圖形繪制。定量資料以中位數(shù)（最小值，最大值）表示，CHC患者與HC各不同治療時間點之間的比較采用Mann-Whitney非參數(shù)U檢驗，CHC患者不同治療時間點之間的兩兩比較采用Wilcoxon配對符號秩檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 DCV/ASV治療過程中CHC患者血清HCV RNA水平 對13例患者進行DCV/ASV抗病毒治療，并在治療過程中動態(tài)監(jiān)測患者血清HCV RNA水平。結(jié)果顯示，13例患者治療前的HCV RNA水平為6.82（4.31，7.29）log IU/ml，所有患者在接受DCV/ASV治療2周內(nèi)血清HCV RNA均下降至檢測不到的水平（HCV RNA＜25 IU/ml），并一直維持到隨訪結(jié)束。

2.2 DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞表型變化 外周血NK細胞表型檢測分析結(jié)果顯示，與HC組相比，CHC患者治療前外周血NK細胞活化程度較高，表達HLA-DR（U=43.000，P=0.037）（圖1A）、CD38（U=39.500，P=0.023）（圖1B）和NKP46（U=13.000，P＜ 0.001）（圖1C）的水平顯著升高；表達NKP30（圖1D）和NKG2A（圖1E）的水平無明顯差異。接受DAAs治療后HLA-DR的表達水平顯著下降，且與HC組無顯著性差異（圖1A）。隨訪結(jié)束時NKP46的表達水平較治療前顯著下降（Z=84.000，P=0.007），但仍高于HC組（U=31.000，P=0.008）（圖1C）。

圖1 DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞表型分析A～E.DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞HLA-DR、CD38、NKP46、NKP30、NKG2A的表達水平；0.治療第0周（治療前）；24.治療第24周；FU 12 、FU 24.治療結(jié)束后隨訪第12周、24周；*.P＜0.05Figure 1 Phenotypic analysis of NK cells in CHC patients treated with DCV/ASV

2.3 DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞毒性和功能的檢測 在體外分別用PMA+IONO、IL-12+IL-18刺激來源于CHC患者和HC的PBMCs，通過流式細胞術檢測NK細胞分泌CD107a、IFN-γ和 TNF-α的能力。結(jié)果顯示：IL-12+IL-18刺激下，CHC患者治療前分泌CD107a（U=16.000，P=0.002）和 TNF-α（U=36.000，P=0.040）的能力均較HC顯著增高（圖2A、2C），產(chǎn)生IFN-γ的能力顯著降低（U=28.000，P=0.012）（圖2B）；DAAs治療后，CHC患者在隨訪12周時CD107a的表達水平較治療前有顯著下降（Z=3.000，P=0.005）但仍高于HC（U=33.000，P=0.026），隨訪結(jié)束時與HC無明顯差異（圖2A）；CHC患者NK細胞產(chǎn)生IFN-γ的能力在DAAs治療后明顯增強（Z=71.000，P=0.012）（圖2B）。PMA+IONO刺激下，3種細胞因子的表達水平在組間及組內(nèi)不同時間點無明顯差異（圖3）。

圖2 IL-12+IL-18刺激下DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞毒性和功能的變化A～C.IL-12+IL-18刺激下DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞分泌細胞因子CD107a、IFN-γ和TNF-α的能力；0.治療第0周（治療前）；24.治療第24周；FU 12 、FU 24.治療結(jié)束后隨訪第12周、24周；*.P＜0.05Figure 2 Changes of NK cells cytotoxicity and function in CHC patients treated with DCV/ASV in response to IL-12 +IL-18 stimulation

圖3 PMA+IONO刺激下DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞毒性和功能的變化A～C.PMA+IONO刺激下DCV/ASV治療的CHC患者NK細胞分泌細胞因子CD107a、IFN-γ和TNF-α的能力；0.治療第0周（治療前）24.治療第24周；FU 12 、FU 24.治療結(jié)束后隨訪第12周、24周Figure 3 Changes of NK cells cytotoxicity and function in CHC patients treated with DCV/ASV in response to PMA +IONO stimulation

3 討 論

天然免疫是機體抗病毒感染的第一道防線，對控制病毒感染和有效啟動獲得性免疫至關重要。NK細胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成成分，在HCV感染的各階段均發(fā)揮著關鍵作用[7]。有研究表明，慢性HCV感染階段患者NK細胞的活化程度增高、細胞毒性增強，但分泌IFN-γ的能力受損，不利于病毒的清除[8-10]。

DAAs的出現(xiàn)使CHC患者得以治愈，但DAAs治療對機體免疫系統(tǒng)的影響目前仍不十分清楚。有研究顯示，DAAs介導的HCV清除伴隨有NK細胞免疫學功能的變化[11-15]。但亦有學者報道DAAs治療后，CHC患者NK細胞的免疫學變化尚不確定，仍須進一步討論[16]。

HCV 1b型是我國HCV感染最常見的基因型[17]，DCV/ASV作為國內(nèi)首個獲批的DAAs聯(lián)合治療方案，對HCV 1b型CHC患者治愈率高、安全性與耐受性良好。本研究發(fā)現(xiàn)13例CHC患者接受DCV/ASV治療24周后均獲得持續(xù)病毒學應答。對其免疫學特點進行分析發(fā)現(xiàn)，CHC患者治療前外周血NK細胞表達HLA-DR、CD38、NKP46、CD107a的水平顯著增高，表達IFN-γ的水平顯著降低，表明CHC患者外周血NK細胞活化程度增高，細胞毒性增強，但產(chǎn)生IFN-γ的能力減弱，這與既往研究報道一致[8-10]。此外，我們通過對DAAs治療的患者不同隨訪時間點的外周血NK細胞表型和功能特點進行比較，發(fā)現(xiàn)治療后患者NK細胞HLA-DR、NKP46、CD107a的表達水平顯著下降，同時IFN-γ的表達水平顯著升高，表明DAAs治愈的CHC患者外周血NK細胞的活化程度和細胞毒性降低，分泌IFN-γ的能力增強。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，CHC患者在接受DAAs治療前及治療過程中NK細胞表達NKP30和NKG2A的水平并未發(fā)生明顯改變，這與既往的研究結(jié)果不同，先前研究認為CHC患者治療前外周血NK細胞表達NKP30和NKG2A的水平顯著增高，且經(jīng)DAAs治療之后其表達水平均顯著下降[11-12，14]，造成這種差異的原因可能與入選病例的種族、治療經(jīng)歷、HCV基因型及采用DAAs治療方案的不同有關。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)DAAs在快速抑制CHC患者體內(nèi)HCV達到治愈水平的同時，伴隨NK細胞免疫功能的變化。然而，由于入組病例數(shù)較少，患者感染的HCV基因型及采用的DAAs治療策略單一，研究存在著一定的局限性，有關DAAs治療對機體免疫系統(tǒng)的影響及其具體機制有待進一步探索與驗證。