利用MALDI-TOF MS特異質(zhì)量峰對(duì)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌同源性的快速分型

余佳佳,劉婧嫻,李媛睿,劉 瑛

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092)

耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)是近年來受到廣泛關(guān)注的多重耐藥菌。2014年CHINET數(shù)據(jù)顯示，CRKP的檢出率達(dá)10%[1]，我院2017年耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示CRKP的檢出率已高達(dá)30%，呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，對(duì)臨床抗感染治療帶來極大挑戰(zhàn)，對(duì)患者的生命安全帶來極大威脅。流行病學(xué)分析是監(jiān)測(cè)感染暴發(fā)以及控制醫(yī)院感染的重要手段。近年來，隨著基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的研究[2-3]表明，MALDI-TOF MS在流行病學(xué)領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。利用MALDI-TOF MS進(jìn)行流行病學(xué)分析，方法主要包括直接利用質(zhì)譜儀器中配套的軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)和核心圖譜(main spectra profile, MSP)聚類分析[4-7]，以及對(duì)質(zhì)量圖譜進(jìn)行特異質(zhì)量峰篩選后再用于分型[8-9]。文獻(xiàn)報(bào)道，PCA聚類分析和MSP聚類分析可以鑒別區(qū)域流行[10-13]以及暴發(fā)感染的菌株[14-16]，但其分型效果與多位點(diǎn)序列分型(MLST)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)等分子分型結(jié)果符合度較差。對(duì)質(zhì)量圖譜進(jìn)行特異質(zhì)量峰篩選后再進(jìn)行聚類分析，可與分子分型結(jié)果達(dá)到較高的符合率[17-18]。而目前通過篩選特異質(zhì)量峰進(jìn)行分型的方法主要用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)的分子流行病學(xué)研究，而針對(duì)CRKP的研究目前還較少。本研究旨在建立一種方法——利用MALDI-TOF MS質(zhì)量圖譜中的特異質(zhì)量峰對(duì)CRKP進(jìn)行快速同源性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 選取上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室前期收集并已進(jìn)行MLST的69株CRKP，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院惠贈(zèng)的7株CRKP，共76株，其中52株用于特異質(zhì)量峰分型方法的建立，24株用于特異質(zhì)量峰分型方法的驗(yàn)證。

1.1.2 試劑與儀器 甲酸和乙腈購自美國Sigma-Aldrich公司，HCCA基質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白校準(zhǔn)品(protein calibration standard Ⅰ)購自德國Bruker Daltonik公司，血平板、麥康凱平板購自上海伊華生物技術(shù)有限公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，低速常溫離心機(jī)購自上海菲恰爾分析有限公司，MicroflexTM LT型質(zhì)譜儀、96孔金屬靶板、Flex control 3.0軟件、MicroFlexTM Biotyper 3.0鑒定分析軟件、Clinpro Tools 3.0軟件以及Flex analysis 3.0圖譜分析軟件均購自德國Bruker Daltonik公司，Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler PCR儀和微量移液器購自德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 特異質(zhì)量峰分型方法的建立

1.2.1.1 不同ST型別CRKP質(zhì)量圖譜的獲取 選取52株CRKP，共包括25個(gè)序列型(Sequence Type, ST)，分別為ST11(6株)、ST520(6株)、ST48(6株)、ST37(5株)、ST423(3株)、ST323(3株)、ST14(2株)、ST65(2株)、ST846(2株)、ST2168(2株)、ST29、ST76、ST147、ST278、ST438、ST478、ST571、ST1696、ST1721、ST1722、ST1723、ST1725、ST2169、ST2170和ST2171各1株。從-80℃冰箱取出保存菌種進(jìn)行復(fù)蘇，接種至麥康凱平板，35 ℃孵育過夜后取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種血平板，再次35 ℃孵育過夜，然后進(jìn)行MALDI-TOF MS分析：每株菌取3個(gè)單菌落分別加入到70%乙醇中，13 000 r/min離心5 min，去掉上清后加入5 μL甲酸∶乙腈(1∶1)裂解液，裂解后取1 μL加入96孔金屬靶板中，自然干燥后，加1 μL基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix, HCCA)，干燥后進(jìn)行檢測(cè)。校準(zhǔn)品是標(biāo)準(zhǔn)蛋白校準(zhǔn)品，參數(shù)設(shè)計(jì)m/z 2000-20000，shots:200，激光強(qiáng)度80%，每一個(gè)靶孔上在不同的位置獲取3個(gè)圖譜，則每株菌有9個(gè)質(zhì)量圖譜，將圖譜進(jìn)行軟件分析鑒定，當(dāng)鑒定分?jǐn)?shù)大于2.30時(shí)認(rèn)為該菌株被準(zhǔn)確鑒定至種水平，保存圖譜。將所有圖譜導(dǎo)入flexanalysis 3.0軟件，將質(zhì)量圖譜中所有質(zhì)量峰的基底拉至最低水平線，并對(duì)曲線進(jìn)行光滑處理。

1.2.1.2 特異質(zhì)量峰的篩選 本實(shí)驗(yàn)共包含25種ST型別CRKP，將所有菌株圖譜進(jìn)行分組，從而篩選出每種ST型別CRKP的特異質(zhì)量峰，具體流程為：所有CRKP質(zhì)量圖譜分成ST11型和非ST11型(包括除ST11型外的其他所有ST型)，兩組圖譜分別導(dǎo)入Clinpro Tools 3.0軟件，通過軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，獲得兩組間質(zhì)量峰的比較分析結(jié)果。同樣的方法將所有菌株圖譜分成ST520型和非ST520型(包括除ST520型外的其他所有ST型)，再次將兩組圖譜分別導(dǎo)入Clinpro Tools 3.0軟件，通過軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，獲得兩組間質(zhì)量峰的比較分析結(jié)果，以此類推獲得25個(gè)ST型的比較分析結(jié)果。然后根據(jù)分析的主要因素信噪比(signal/noise，S/N)，即細(xì)菌質(zhì)量峰信號(hào)強(qiáng)度和機(jī)器自身產(chǎn)生噪聲的比值；變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)，即質(zhì)量峰強(qiáng)度在同一組細(xì)菌當(dāng)中的離散程度；S/N比值，即不同分組間，質(zhì)量峰信噪比的比值，通過以上3個(gè)主要因素制定特異質(zhì)量峰篩選的標(biāo)準(zhǔn)。參照國外文獻(xiàn)中篩選特異質(zhì)量峰的方法(S/N≥5，S/N比值≥2)[8]，設(shè)置5個(gè)不同的特異質(zhì)量峰挑選標(biāo)準(zhǔn)，并按照不同的標(biāo)準(zhǔn)篩選各個(gè)ST型特異質(zhì)量峰。標(biāo)準(zhǔn)1：(1)S/N≥4，(2)S/N比值≥1.5，(3)CV≤50%；標(biāo)準(zhǔn)2：(1)S/N≥4，(2)S/N比值≥1.5，(3)CV≤40%；標(biāo)準(zhǔn)3：(1)S/N≥4，(2)S/N比值≥2，(3)CV≤50%；標(biāo)準(zhǔn)4：(1)S/N≥5，(2)S/N比值≥1.5，(3)CV≤50%；標(biāo)準(zhǔn)5：(1)S/N≥5，(2)S/N比值≥2，(3)CV≤40%。

1.2.1.3 最佳標(biāo)準(zhǔn)的確定 利用1.2.1.2中5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)篩選得到的特異質(zhì)量峰對(duì)52株CRKP中的29株菌(只選取包含3個(gè)或3個(gè)以上菌株的ST型別)進(jìn)行分型，菌株ST型別包括ST11、ST37、ST48、ST520、ST323和ST423，將這29株菌的圖譜導(dǎo)入flexanalysis 3.0軟件，對(duì)所有S/N值>4的質(zhì)量峰進(jìn)行挑選，若無特異質(zhì)量峰(S/N<4)，則賦值為0；若有特異質(zhì)量峰(S/N>4)，則賦值為1；若特異質(zhì)量峰S/N>10，則賦值為2。將獲得的數(shù)字信息導(dǎo)入SPSS軟件中，通過最遠(yuǎn)鄰元素聚類分析方法進(jìn)行聚類，并與MLST結(jié)果進(jìn)行比較，將與MLST結(jié)果符合率最高的標(biāo)準(zhǔn)確定為最佳標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 特異質(zhì)量峰分型方法的驗(yàn)證 另挑選24株包含5種常見ST型別的CRKP，分別為ST11(7株)、ST48(6株)、ST520(5株)、ST37(4株)以及ST423(2株)，對(duì)特異質(zhì)量峰分型方法進(jìn)行驗(yàn)證。按照1.2.1.1的步驟獲取質(zhì)量圖譜，按照最佳標(biāo)準(zhǔn)挑選出的特異質(zhì)量峰對(duì)24株CRKP的圖譜進(jìn)行分析并賦值，將獲得的數(shù)字信息導(dǎo)入SPSS軟件中，通過最遠(yuǎn)鄰元素聚類分析方法進(jìn)行聚類，并與MLST結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.3 分型方法的比較 MALDI-TOF MS中的Clinpro Tools 3.0和MALDI Biotyper 3.0軟件可根據(jù)菌株質(zhì)量圖譜對(duì)菌株進(jìn)行聚類分析，包括PCA聚類分析和MSP聚類分析，本研究利用這兩種方法同時(shí)對(duì)上述用于驗(yàn)證的24株CRKP進(jìn)行分型，并將其結(jié)果與特異質(zhì)量峰分型方法結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 特異質(zhì)量峰分型方法的建立 按照標(biāo)準(zhǔn)2，共篩選出45個(gè)特異質(zhì)量峰。按照特異質(zhì)量峰，對(duì)29株CRKP質(zhì)量圖譜的質(zhì)量峰進(jìn)行賦值并獲得數(shù)字列表。將數(shù)字導(dǎo)入SPSS軟件中，通過最遠(yuǎn)鄰元素的聚類分析方法獲得分型結(jié)果，見圖1。圖中黑色粗豎線(距離約為12)將31株CRKP分成7組，其中5株菌分組不符，分別為ST37-KP174、ST37-KP55、ST520-KP164、ST48-KP236和ST48-KP227，其余24株CRKP分型結(jié)果與MLST一致，符合率為82.8%(24/29)。按照標(biāo)準(zhǔn)1、標(biāo)準(zhǔn)3、標(biāo)準(zhǔn)4和標(biāo)準(zhǔn)5挑選出的特異質(zhì)量峰分型結(jié)果與MLST結(jié)果的符合率分別為72.4%、72.4%、72.4%和75.9%。綜合分析發(fā)現(xiàn)，按照標(biāo)準(zhǔn)2得到的質(zhì)量峰分型效果最好，故確定標(biāo)準(zhǔn)2為最佳標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 特異質(zhì)量峰分型方法的驗(yàn)證 將另外24株CRKP質(zhì)量圖譜導(dǎo)入Flexanalysis 3.0軟件中，對(duì)基于標(biāo)準(zhǔn)2篩選出的45個(gè)質(zhì)量峰進(jìn)行分析并賦值后導(dǎo)入SPSS軟件，通過最遠(yuǎn)鄰元素聚類分析方法獲得分型結(jié)果(圖2)。按照標(biāo)準(zhǔn)2的驗(yàn)證結(jié)果在距離為12處(黑色粗豎線)將24株CRKP分成5組，與MLST結(jié)果(ST11、ST37、ST48、ST423和ST520)一致，其中有4株CRKP分類結(jié)果與MLST結(jié)果不符，ST11-KP361、ST520-KP221、ST520-KP214和ST48-KP246和ST37型菌株分在同一組。該方法與MLST結(jié)果的符合率達(dá)83.3%。

注：KP為新華醫(yī)院菌株編號(hào)，JS為華山醫(yī)院菌株編號(hào)

圖2 24株驗(yàn)證菌株特異質(zhì)量峰分型的聚類分析結(jié)果

2.3 分型方法的比較 利用MALDI-TOF MS中的Clinpro Tools 3.0和MALDI Biotyper 3.0對(duì)24株CRKP進(jìn)行PCA聚類分析和MSP聚類分析。PCA聚類分析結(jié)果顯示，有8株細(xì)菌分組不符，其余16株CRKP分為5組，與MLST結(jié)果的符合率為66.7%。MSP聚類分析結(jié)果與MLST結(jié)果一致性較差，沒有明顯符合ST型的分組趨勢(shì)。見圖3、4。

圖3 Clinpro Tools 3.0軟件對(duì)24株CRKP進(jìn)行PCA聚類分析的結(jié)果

圖4 MALDI Biotyper 3.0軟件對(duì)24株CRKP進(jìn)行MSP聚類分析的結(jié)果

3 討論

目前，常用的分子流行病學(xué)方法主要有PFGE分型和MLST[19]。PFGE分型是通過限制性內(nèi)切酶將基因組切割后進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳分析，根據(jù)條帶的不同對(duì)菌株進(jìn)行分型，該方法是分子流行病學(xué)分析的金標(biāo)準(zhǔn)[20]，但是操作較為繁瑣，需要特殊的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員，不宜在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展；MLST是基于管家基因序列進(jìn)行分型的方法，通過PCR擴(kuò)增管家基因后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)后獲得菌株的ST型別[21]，該方法原理簡(jiǎn)單，操作方便，但耗時(shí)較長(zhǎng)，成本較高，難以對(duì)大樣本量的菌株進(jìn)行快速分析。而利用MALDI-TOF MS進(jìn)行流行病學(xué)分析的方法不需額外的費(fèi)用和復(fù)雜的操作，快速、簡(jiǎn)便，通過對(duì)質(zhì)量圖譜進(jìn)行分析便可獲取流行病學(xué)信息，為醫(yī)院感染防控和感染暴發(fā)監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

利用MALDI-TOF MS技術(shù)獲得的質(zhì)量圖譜中包含大量質(zhì)量峰信息，可直接用于流行病學(xué)分析，但同時(shí)也存在不足，其中噪聲、重復(fù)性低、不穩(wěn)定的質(zhì)量峰，以及種屬特異的質(zhì)量峰等都會(huì)對(duì)分型結(jié)果造成影響，因此，利用質(zhì)量圖譜進(jìn)行亞型區(qū)分時(shí)應(yīng)先按照一定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行特異質(zhì)量峰的篩選，并根據(jù)篩選出的特異質(zhì)量峰進(jìn)行后續(xù)的分型。S/N是特異質(zhì)量峰信號(hào)與噪聲的比值，比值越高表示特異質(zhì)量峰的強(qiáng)度越高，說明特異質(zhì)量峰對(duì)應(yīng)的是某種菌株蛋白而非機(jī)器噪聲。CV是變異系數(shù)，是指該特異質(zhì)量峰在同一ST型別多個(gè)菌株多個(gè)質(zhì)量圖譜中出現(xiàn)的穩(wěn)定性，CV值越小表明質(zhì)量峰越穩(wěn)定。S/N比值是某ST型菌株特異質(zhì)量峰與其他ST型菌株的同一m/z特異質(zhì)量峰的信噪比的比值，S/N比值越高，表明特異質(zhì)量峰與ST型的相關(guān)性越好。本研究根據(jù)S/N、CV系數(shù)及S/N比值設(shè)置了特異質(zhì)量峰的5個(gè)篩選標(biāo)準(zhǔn)，并確定最佳標(biāo)準(zhǔn)為：(1)S/N≥4，(2)S/N比值≥1.5，(3)CV≤40%，按照此標(biāo)準(zhǔn)共挑選出45個(gè)特異質(zhì)量峰，利用這些特異質(zhì)量峰對(duì)24株CRKP進(jìn)行分型，結(jié)果與MLST的符合率達(dá)83.3%，表明該方法具有較好的分型潛力。

特異質(zhì)量峰分型方法是在菌株鑒定圖譜的基礎(chǔ)上，通過觀察特異質(zhì)量峰，并根據(jù)特異質(zhì)量峰強(qiáng)度進(jìn)行的聚類分析。與PCA聚類分析和MSP聚類分析相比，該方法準(zhǔn)確率高，排除了質(zhì)量圖譜中CRKP種特異性質(zhì)量峰的干擾，從而提高了對(duì)CRKP亞型區(qū)分的能力。與MLST等分子分型的方法相比，該方法不需要額外的成本，更加快速、簡(jiǎn)便。在建立方法的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)人員只需獲得菌株的鑒定圖譜，即可通過分析獲得聚類結(jié)果，適合在臨床微生物室常規(guī)開展。本研究進(jìn)行特異質(zhì)量峰篩選時(shí)共選取了25個(gè)ST型的CRKP，并篩選出每個(gè)ST型的特異質(zhì)量峰，當(dāng)其中任何一種ST型發(fā)生暴發(fā)流行時(shí)，可通過篩選的特異質(zhì)量峰將暴發(fā)流行的菌株進(jìn)行聚類，從而快速獲悉其流行狀況。

利用MALDI-TOF MS菌株圖譜中特異質(zhì)量峰進(jìn)行細(xì)菌分型的方法也存在一定局限性，本研究包括CRKP的ST型別有限，但全球流行的ST型別多種多樣，特異質(zhì)量峰的篩選只針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室中包含的ST型別，所以篩選出的特異質(zhì)量峰只能對(duì)這些亞型進(jìn)行有效區(qū)分，而無法判斷是否能區(qū)分其他亞型。由于本實(shí)驗(yàn)中收集的存在流行趨勢(shì)CRKP的ST型較為局限，主要為ST11、ST520、ST37、ST48以及ST423，其他ST型CRKP菌株數(shù)量較少，無法用于特異質(zhì)量峰分型的驗(yàn)證，因此后續(xù)研究中需要繼續(xù)收集各ST型的CRKP，對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證。由于質(zhì)量峰容易受菌株培養(yǎng)條件，孵育時(shí)間以及操作手法等影響，而本試驗(yàn)室目前只是對(duì)特異質(zhì)量峰分型的方法做了初步的探索，建立方法時(shí)設(shè)置的各項(xiàng)參數(shù)可能只適合于本試驗(yàn)室，因此，其他實(shí)驗(yàn)室利用MALDI-TOF MS質(zhì)量峰進(jìn)行深入分析時(shí)，應(yīng)建立適合自己實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

本研究初步顯示，MALDI-TOF MS在醫(yī)院感染流行病學(xué)分析領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。隨著數(shù)據(jù)庫的不斷完善，軟件的日益更新，MALDI-TOF MS有望在不久的將來應(yīng)用于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速同源性分析，為暴發(fā)流行的監(jiān)測(cè)和醫(yī)院感染的控制提供依據(jù)。