原子力顯微鏡實(shí)時觀測磷脂膜上糖脂簇誘導(dǎo)Aβ的聚集

邵賀云， 張明曦*， 沈 雷， 夏 君， 李 勇， 孫濤壘*,

(1.武漢理工大學(xué)材料復(fù)合新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070； 2.武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430070； 3.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430074)

β淀粉樣蛋白(Amyloidβ，Aβ)和許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)[1 - 2]，研究者在阿爾茲海默癥病人的大腦老年斑上發(fā)現(xiàn)了聚集的Aβ，而其聚集對阿爾茲海默癥的發(fā)病有著重要的影響[3]?；铙w生物細(xì)胞中，Aβ(1-40)的生理學(xué)濃度是10-8mol/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其臨界自聚集濃度(17.5～100 μmol/L)[4 - 5]，然而在病理?xiàng)l件下Aβ(1-40)仍然可以發(fā)生聚集，表明生物體內(nèi)很有可能存在某種機(jī)理或某種元素可以降低Aβ(1-40)在聚集過程中所需要的能壘，進(jìn)而促成Aβ(1-40)的纖維化[6]。相比于體外溶液，Aβ實(shí)際存在于有著高濃度蛋白、脂質(zhì)膜、糖的活體細(xì)胞環(huán)境中，并易在由糖脂、鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)和膽固醇(Cholesterol，Chol)組成的高度有序的脂質(zhì)微區(qū)上聚集[7]，通過吸附到分子界面上，尤其是吸附到細(xì)胞膜上，Aβ的有效濃度會被極大增強(qiáng)。越來越多的證據(jù)顯示活體分子界面[8]，例如活體細(xì)胞膜對蛋白聚集具有重要影響，并且細(xì)胞界面的組成元素和結(jié)構(gòu)也極大影響著淀粉纖維形成的動力學(xué)進(jìn)程[9 - 10]。生物化學(xué)研究中經(jīng)常用支撐脂質(zhì)雙層膜(Supported Lipid Bilayers，SLBs)模擬細(xì)胞膜，探究生物膜的性質(zhì)和生物進(jìn)程，例如分子識別、膜融合、纖維形成等[11]。這些表面能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)提供連接位點(diǎn)，增大蛋白質(zhì)的濃度和分子鏈的彼此作用，加速蛋白纖維化。

神經(jīng)節(jié)苷脂是鞘糖脂的一種，分布在脊椎動物等離子體膜的外層。其中單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂糖脂(Monosialoganglioside,GM1)被很多學(xué)者認(rèn)為和Aβ的聚集有關(guān)[12 - 13]。研究發(fā)現(xiàn)，正常人體腦脊液中GM1的濃度是30 nmol/L，高于阿爾茲海默癥患者腦脊液中GM1的濃度(10 nmol/L)，考慮到很有可能是患病的細(xì)胞釋放了GM1[14]，研究人員便提出GM1可能作為膠束核引發(fā)Aβ的聚集[15]。Yanagisawa等[16]在阿爾茲海默癥患者的腦中檢測到Aβ-GM1的混合物，表明兩者的結(jié)合物很有可能是引發(fā)Aβ聚集的種子。Matsuzaki等人[17 - 18]也提出GM1團(tuán)簇對Aβ的聚集有著至關(guān)重要的作用，指出Aβ易于和GM1團(tuán)簇連接[19]。Fernández-Pérez等人[20]通過研究發(fā)現(xiàn)GM1對Aβ和膜的連接至關(guān)重要。與此同時，Matsubara等人對Aβ在糖脂膜上的聚集進(jìn)行原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy，AFM)表征[21]。然而現(xiàn)在的研究并未對GM1團(tuán)簇如何引發(fā)Aβ聚集進(jìn)行原位、高分辨的觀察。本文利用AFM，在液相模式下對SLBs上GM1簇誘導(dǎo)Aβ(1-40)纖維化進(jìn)行了實(shí)時高分辨成像，發(fā)現(xiàn)Aβ會在GM1簇上發(fā)生聚集，并且Aβ纖維以GM1簇為聯(lián)結(jié)位點(diǎn)生長。通過AFM觀測Aβ如何在GM1簇上聚集，將會幫助我們更為直觀深入的了解蛋白纖維化，促進(jìn)阿爾茲海默癥病理的研究，為阿爾茲海默癥的治療提供更多的可能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器及試劑

FastScan原子力顯微鏡(德國，Bruker公司)；納米粒度及Zeta電位分析儀(德國，Malvern公司)；Jasco J-1500 圓二色譜儀(日本，分光公司)；610020迷你擠出機(jī)(美國，Avanti Polar Lipid公司)。

鞘磷脂(SM，美國Avanti Polar Lipid)，純度>99%；膽固醇(Chol，美國Avanti Polar Lipid)，純度>99%；單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1(美國Sigma)，純度>95%；β淀粉樣肽(1-40)(美國Invitrogen)，純度>99%。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1脂質(zhì)體的制備脂質(zhì)體溶液是制備支撐平面雙層膜的前提，而脂質(zhì)體粒徑大小和粒徑分布狀態(tài)對后續(xù)的脂質(zhì)膜制備將會產(chǎn)生很重要的影響。脂質(zhì)體的制備方法有很多種，本實(shí)驗(yàn)利用先超聲法后擠出法制備脂質(zhì)體。將脂質(zhì)組分(SM、Chol和GM1)分別溶解于氯仿-乙醇(2∶1，V/V)溶劑中，最終濃度分別為1 mg/mL、1 mg/mL和0.5 mg/mL，并將溶解好的溶液置于冰箱-20 ℃保存，待用。

取上述400 μL的SM溶液、200 μL的Chol溶液和126 μL的GM1溶液注入圓底燒瓶中，用N2吹干。將圓底燒瓶置于真空干燥箱中，于33 ℃下抽真空2 h，再將其密封，放置過夜。取5 mL 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)于燒瓶中，加入磁子，在60 ℃的恒溫油浴中磁力攪拌2 h，調(diào)整油浴鍋轉(zhuǎn)速1 500 r/min，隨后冷水浴超聲30 min。取上述懸浮液在擠出機(jī)上進(jìn)行擠出，設(shè)置擠出溫度為60 ℃，擠出次數(shù)在16次以上。

1.2.2含有GM1簇的SLBs的制備SLBs以云母作為基底，采用脂質(zhì)體直接融合技術(shù)制備。滴加制備好的100 μL的脂質(zhì)體懸浮液到新鮮剝離的云母基底上，并在60 ℃條件下加熱孵育60 min。將樣品緩慢冷卻至室溫，再用緩沖溶液去除多余的脂質(zhì)體，邊用緩沖溶液沖洗云母片邊吸取沖洗下的未溶解的脂質(zhì)體溶液，重復(fù)以上萃取操作5次以上。將沖洗過后的樣品放置在樣品臺上，并加緩沖溶液于樣品表面，防止樣品去濕。

1.2.3AFM樣品的制備洗滌萃取程序后，將上述制備的含有GM1簇的SLBs放置在濃度為1 μmol/L的Aβ溶液中進(jìn)行孵育，孵育溫度37 ℃，標(biāo)定好時間，隨后對孵育過的樣品進(jìn)行實(shí)時液相觀察。成像前，樣品要在PBS中平衡15～25 min，先在低分辨率下觀察，再在高分辨率下觀察。

1.2.4AFM液相觀察在室溫下使用AFM以液相流體模式對樣品進(jìn)行原位觀測。通過使用具有0.35N/m 的額定彈簧常數(shù)的氮化硅DNP探針，以1～2 Hz的掃描速率在ScanAsyst模式下記錄圖像。懸臂振蕩頻率為2 kHz，掃描力被調(diào)整到最小值(0.5 nN)。所有圖像在512×512像素掃描下采集，并通過Nanoscope -Ⅲ軟件分析。

1.2.5納米力學(xué)性質(zhì)測量楊氏模量數(shù)據(jù)通過PeakForce QNM(Quantitative Nanomechanical Property Mapping)定量納米力學(xué)性質(zhì)成像模式獲得，該模式能在對樣品成像同時映射DMT(Derjaguin，Muller，Toropov)模量。其中反映樣品硬度的楊氏模量與DMT模量有關(guān)，可以按照公式(1)計(jì)算[10]。

(1)

其中，e0是DMT模量，e1和e2分別代表樣品和針尖的楊氏模量，v1和v2分別代表樣品和針尖的泊松比，令e2=395 GPa，v1=0.5，v2=0.27。實(shí)驗(yàn)樣品中不同的相會具有不同的剛度，因此可以根據(jù)楊氏模量的大小來表征和鑒定樣品中不同相的形成。

產(chǎn)品質(zhì)量保障能力是企業(yè)對產(chǎn)品質(zhì)量和質(zhì)量事故監(jiān)測，以及質(zhì)量事故和風(fēng)險(xiǎn)控制的能力。從產(chǎn)品質(zhì)量生產(chǎn)過程和售后服務(wù)角度來看，即企業(yè)是否建立相應(yīng)保障機(jī)制，監(jiān)測質(zhì)量狀況和識別質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，及時解決潛在的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，對已經(jīng)發(fā)生的事故進(jìn)行分析，避免類似批次性質(zhì)量問題的再發(fā)生。由此可見，產(chǎn)品質(zhì)量保障能力包括計(jì)量管理水平、認(rèn)證管理水平、質(zhì)監(jiān)部門監(jiān)督抽查狀況、質(zhì)量事故記錄情況、市場反饋及投訴記錄情況、產(chǎn)品質(zhì)量獲獎情況等內(nèi)容。

1.2.6CD測量將Aβ(1-40)溶液分別和SM/Chol/GM1懸浮液、SM/Chol懸浮液混合，混合液中的Aβ(1-40)的濃度為10 μmol/L)，37 ℃孵育，隨后進(jìn)行CD測量。CD測量溫度為37 ℃，為了將由緩沖溶液組分引起的光吸收最小化，本實(shí)驗(yàn)使用1 mm石英池；緩沖溶液的空白譜圖作為背景被扣除；每個樣品平均掃描8次。

2 結(jié)果與討論

2.1 SLBs上GM1簇的生成

圖1展示的是GM1簇在制備的SLBs(SM/Chol/GM1)上形成的AFM圖像。其中SM/Chol二元體系脂質(zhì)體溶液粒徑和SM/Chol/GM1三元體系脂質(zhì)體溶液粒徑分別為68.2 nm、78.8 nm。如圖1a和圖1c所示，可以看到利用SM/Chol脂質(zhì)體溶液和SM/Chol/GM1脂質(zhì)體溶液制備脂質(zhì)膜，兩者都形成了液相有序膜，SLBs的厚度為4.3±0.3 nm(圖1b和圖1d)，并且在SM/Chol/GM1三元混合體系制備的脂質(zhì)膜上，明顯出現(xiàn)了大小不等的圓形GM1簇(圖1c)，圓形簇的高度為1.2～2.5 nm，粒徑41～290 nm(圖1d)。

圖1 (a)SLBs(SM/Chol)的AFM圖像；(b)對應(yīng)于圖a白線處的橫截面圖；(c)SLBs(SM/Chol/GM1)的AFM圖像；(d)對應(yīng)于圖c白線處的橫截面圖Fig.1 (a)AFM image of SLBs(SM/Chol);(b)Cross-sectional profile along the white line in(a);(c)AFM image of SLBs(SM/Chol/GM1);(d)Cross-sectional profile along the white line in(c)Scale bar is 200 nm.

圖2 (a)SLBs(SM/Chol/GM1)的AFM圖像；(b)對應(yīng)的DMT模量圖；(c)標(biāo)注1處的楊氏模量；(d)標(biāo)注2處的楊氏模量Fig.2 (a)AFM image of SLBs(SM/Chol/GM1);(b)Corresponding DMT modulus mapping image；(c)Calculated Young’s modulus of region 1;(d)Calculated Young’s modulus of region 2The scale bar is 200 nm.

為了進(jìn)一步證明GM1簇的形成，對加入GM1后的脂質(zhì)膜進(jìn)行了DMT模量的測量，隨后進(jìn)行了楊氏模量的計(jì)算。楊氏模量的表征結(jié)果如圖2所示，通過圖2a我們可以清楚的看到GM1簇較好的分散在脂質(zhì)膜上，分別選擇兩個區(qū)域，區(qū)域1(SLBs)和區(qū)域2(GM1簇)，并通過DMT模量對這兩個區(qū)域的楊氏模量進(jìn)行換算，計(jì)算結(jié)果如圖2c和2d所示。結(jié)果顯示區(qū)域1(SLBs)楊氏模量為1.892 MPa，區(qū)域2(GM1簇)的楊氏模量為1.084 MPa，可以明顯的看出GM1簇的楊氏模量不同于SLBs的楊氏模量，說明SLBs上確實(shí)有新的結(jié)構(gòu)即GM1簇生成。驅(qū)使GM1形成團(tuán)簇的作用力主要是GM1分子內(nèi)部的氫鍵受體和供體之間的相互作用，包括GalNAc、Neu5Ac和Gal，通過這些頭部基團(tuán)的彼此作用，越來越多的GM1聯(lián)合在一起，最終形成不同于SLBs區(qū)域的團(tuán)簇狀GM1簇[22 - 23]。SLBs是通過復(fù)雜疏水作用形成的高度有序結(jié)構(gòu)，而構(gòu)成GM1簇的主要作用力是氫鍵作用力，相比而言GM1簇形成的作用力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于構(gòu)成SLBs的作用力，因此GM1簇的楊氏模量小于脂質(zhì)雙層膜的楊氏模量。

2.2 Aβ纖維化的形成

2.2.1CD譜分析為了檢測GM1對Aβ的影響，利用CD測試了Aβ(1-40)與脂質(zhì)體懸浮液在37 ℃孵育一定時間后的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。圖3a和圖3b，對應(yīng)的是濃度為10 μmol/L的Aβ(1-40)分別與脂質(zhì)體懸浮液(SM/Chol/GM1)、脂質(zhì)體懸浮液(SM/Chol)在37 ℃孵育后的CD譜圖。我們可以清楚的看到，在脂質(zhì)體懸浮液(SM/Chol/GM1)中，最初Aβ(1-40)分子出現(xiàn)典型的峰值在208 nm處的α螺旋峰(圖3a曲線1)，隨著孵育時間延長至25 h，α螺旋峰消失，隨之在218 nm附近出現(xiàn)了峰(圖3a曲線4)，表明Aβ(1-40)逐漸從α螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)變成β片層構(gòu)象；然而Aβ(1-40)與脂質(zhì)體懸浮液(SM/Chol)孵育后卻沒有出現(xiàn)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象(圖3b)，孵育25 h后的CD譜曲線基本和起初的曲線相似，始終沒有出現(xiàn)β片層構(gòu)象。這樣的結(jié)果表明GM1的確能夠加速Aβ(1-40)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。

圖3 10 μmol/L Aβ和脂質(zhì)體懸浮液SM/Chol/GM1(a)及脂質(zhì)體懸浮液SM/Chol(b)在37 ℃ 孵育后的CD譜圖 Fig.3 CD spectra of 10 μmol/L Aβ incubated with SM/Chol/GM1(a) and SM/Chol(b) at 37 ℃

2.2.2AFM圖像分析圖4展示的是由SM/Chol/GM1制備的SLBs(圖4a)和由SM/Chol制備的SLBs(圖4b)，分別在濃度為1 μmol/L的Aβ溶液中孵育30 h后的AFM圖像，通過觀察可以發(fā)現(xiàn)，將SLBs(SM/Chol/GM1)孵育在濃度為1 μmol/L的Aβ(1-40)溶液中30 h后，有長條Aβ纖維形成，該Aβ纖維貫穿幾個GM1簇，并且纖維只形成在有GM1簇的區(qū)域，然而將SLBs(SM/Chol)孵育在1 μmol/L的Aβ(1-40)溶液中30 h，卻并沒有觀察到任何纖維化的狀態(tài)，由此可以看出GM1簇對Aβ的纖維化有著至關(guān)重要的作用，GM1簇的存在是Aβ纖維化的關(guān)鍵。

圖4 1 μmol/L Aβ(1-40) 溶液與SM/Chol/GM1(a)及SM/Chol(b)37 ℃ 恒溫孵育30 h的AFM圖 Fig.4 AFM images of Aβ(1-40) incubated with SM/Chol/GM (a) and SM/Chol (b) at 37 ℃ for 30 h The scale bar:200 nm.

2.3 Aβ纖維化的影響因素

2.3.1孵育時間圖5展示了液相下Aβ(1-40)在SLBs上的纖維化進(jìn)程，其中圖a～e展示的是不同時間點(diǎn)Aβ纖維化的AFM圖像，圖f展示的是對應(yīng)不同時間點(diǎn)觀察到的纖維長度。通過觀察可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)孵育時間為17 h時(圖5a)，支撐脂質(zhì)膜上并沒有Aβ纖維；但是當(dāng)孵育時間延長至20 h時，支撐脂質(zhì)膜上便出現(xiàn)了豆芽狀的Aβ纖維，并且該纖維以GM1簇為形成位點(diǎn)，如圖5b所示，此時纖維長度約81 nm；當(dāng)孵育時間為22 h時，纖維進(jìn)一步長大，長約130 nm(圖5c)；當(dāng)孵育時間為25 h時纖維長大成棒狀，貫穿1～2個GM1簇(圖5d)，此時纖維長度約520 nm；隨著孵育時間延長至32 h，Aβ纖維的長度進(jìn)一步增大至1350 nm，并且此時Aβ纖維貫穿的GM1簇的數(shù)目也進(jìn)一步增多(圖5e)。上述結(jié)果表明，Aβ纖維化的進(jìn)行需要相對長的時間在GM1簇上開始聚集，一旦開始發(fā)生聚集，纖維便迅速生長。Aβ纖維只出現(xiàn)在含有GM1簇的位點(diǎn)上，并且以GM1簇位點(diǎn)為生長點(diǎn)，隨著Aβ纖維的長大，Aβ纖維貫穿的GM1簇的數(shù)目也隨之增多。

圖5 SLBs(SM/Chol/GM1)在1 μmol/L Aβ(1-40)溶液中在37 ℃孵育后的AFM圖像及不同時間Aβ長度Fig.5 AFM images of SLBs(SM/Chol/GM1) after incubated in 1 μmol/L Aβ(1-40) at 37 ℃ for 17 h(a),20 h(b),22 h(c),25 h(d),32 h(e) and (f) the length of Aβ fibrils at different time The scale bar is 200 nm.

2.3.2GM1簇的密度通過實(shí)驗(yàn)我們還發(fā)現(xiàn)，除了孵育時間，SLBs上GM1簇的密度同樣會影響Aβ纖維化的進(jìn)程。如圖6所示，將SLBs和Aβ(1-40)在37 ℃溫度條件下孵育30 h，通過觀察SLBs的不同區(qū)域，我們發(fā)現(xiàn)Aβ纖維的長度和GM1簇的密度緊密相關(guān)。當(dāng)SLBs上GM1簇的數(shù)量很少時，幾乎不能觀察到纖維的形成，如圖6a；隨著SLBs上GM1簇密度的增大，形成的Aβ纖維的長度也隨之增大，如圖6b和6c所示，可以明顯地看到在GM1簇密度較大的區(qū)域，Aβ纖維貫穿多個GM1簇生長，說明GM1簇密度會影響Aβ的生長長度。當(dāng)SLBs上GM1簇的密度較大時，充足的GM1簇很有可能增大了Aβ和GM1簇相互作用的機(jī)率，因而SLBs上越多GM1簇存在的區(qū)域，形成的纖維就越長。

圖6 SLBs(SM/Chol/GM1) 在1 μmol/L Aβ(1-40) 溶液中在37 ℃ 孵育30 h后不同區(qū)域AFM圖像Fig.6 AFM images of different areas of SLBs(SM/Chol/GM1) after incubated in 1 μmol/L Aβ(1-40) at 37 ℃ for 30 hThe scale bar is 200 nm.

通過觀察AFM圖片還可以發(fā)現(xiàn)，Aβ纖維并不是隨機(jī)的分布在SLBs上，而是串聯(lián)通過多個GM1簇，即GM1簇不僅能夠促進(jìn)Aβ分子發(fā)生聚集，同樣能夠作為Aβ纖維增長的聯(lián)結(jié)位點(diǎn)。

2.3.3SLBs的面積通過討論GM1簇的密度對Aβ纖維化的影響，我們知道GM1簇能夠引發(fā)Aβ分子發(fā)生聚集并作為Aβ纖維增長的聯(lián)結(jié)位點(diǎn)，因此可以猜想影響GM1簇生成的因素很有可能間接的影響Aβ纖維化。通過觀察圖7，我們可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)云母基底膜覆蓋率較低時，GM1簇的生成率也會下降，圖7b和7c展示的分別為出現(xiàn)少量的GM1簇、未出現(xiàn)GM1簇的支撐脂質(zhì)膜的AFM圖像，圖7b、c相比于圖7a，脂質(zhì)膜覆蓋率較低，而只有脂質(zhì)膜覆蓋率高的圖7a出現(xiàn)了較多的GM1簇和Aβ纖維。

圖7 覆蓋率不同SLBs(SM/Chol/GM1)在1 μmol/LAβ(1-40)溶液中在37 ℃孵育30 h后的AFM圖像Fig.7 AFM images of SLBs (SM/Chol/GM1) with different coverage after incubating in 1 μmol/L Aβ(1-40) at 37 ℃ for 30 hThe coverage of SLBs in Fig.7a,7b,7c is high,medium,and low,respectively.The scale bar is 600 nm.

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以猜測，SLBs的大小會對纖維的形成產(chǎn)生影響，很有可能是通過影響GM1簇的形成引起的，較大的膜面積在一定程度上增大了GM1分子和脂質(zhì)膜的組分接觸的機(jī)會，增大了GM1簇在膜上形成的可能性，結(jié)合圖6我們已經(jīng)知道GM1簇的密度會影響纖維的形成和長度，因此可以說SLBs面積的大小對纖維的形成會產(chǎn)生間接的影響。

3 結(jié)論

本文在生成GM1簇的脂質(zhì)膜體系(SM/Chol/GM1)中加入Aβ，觀察到了Aβ纖維化現(xiàn)象。通過AFM實(shí)時高分辨的觀測發(fā)現(xiàn)，Aβ的纖維化不是隨機(jī)發(fā)生，而是以GM1簇為聯(lián)結(jié)位點(diǎn)進(jìn)行增長；通過CD確認(rèn)了GM1能夠加速Aβ的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，進(jìn)而誘導(dǎo)Aβ分子的聚集，促進(jìn)纖維化的進(jìn)行；此外，Aβ的纖維化與孵育時間、GM1簇的密度、SLBs的大小密切相關(guān)，其中Aβ纖維出現(xiàn)的時間大約為20 h，且隨著孵育時間的增加，纖維長度逐漸增長，最后纖維可貫穿多個GM1簇，并且GM1簇的密度會影響Aβ纖維的生長和長度。以上工作將有助于我們更直觀的了解蛋白纖維化的方式，啟發(fā)我們可以通過阻止GM1簇的形成，進(jìn)而控制Aβ的纖維化，為阿爾茲海默癥的預(yù)防和治療提供更多的可能。