基于氣相色譜-質(zhì)譜法和隨機(jī)森林算法的不同產(chǎn)地香菇指紋圖譜研究

王 升， 陳 林， 周融融， 張水寒， 余 意， 王 凌*

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心,北京 100700； 2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所,湖南長沙 410013； 3.長春中醫(yī)藥大學(xué),吉林長春 130117； 4.無限極(中國)有限公司,廣東廣州 510663)

香菇(Lentinusedodes，Shiitake)在我國是一種久負(fù)盛名的食用菌[1 - 3]，屬擔(dān)子菌綱(Basidaiomycetes)、傘菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomatacete)、香菇屬(Lentinus)，又稱香蕈、冬菇、花菇等，其口味鮮美，營養(yǎng)價(jià)值高，且又具有顯著的藥用和滋補(bǔ)作用，是著名的藥食兩用真菌。近年來，香菇在亞洲、歐洲也越來越受喜愛，應(yīng)歸功于其獨(dú)特的香味以及富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、必需氨基酸等多種營養(yǎng)成分。相關(guān)研究表明，香菇活性成分還具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、保肝多種功效[4 - 6]。

氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)日臻完善，其高效的分離能力以及良好的重現(xiàn)性，使得該方法廣泛應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離與鑒定，已應(yīng)用于食物、藥材、茶葉等產(chǎn)品的成分分析和質(zhì)量控制研究[7 - 9]。GC-MS法的另一個(gè)重要優(yōu)勢在于其強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫(NIST庫)，其中容括豐富的化學(xué)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜信息，而通過數(shù)據(jù)搜索、匹配技術(shù)能夠有效地幫助對(duì)活性物質(zhì)的解析和鑒定。因而，本文提出利用GC-MS方法對(duì)來自不同產(chǎn)地香菇樣品進(jìn)行分析，構(gòu)建其特征指紋圖譜；進(jìn)一步采用隨機(jī)森林算法對(duì)指紋圖譜進(jìn)行判別分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)香菇產(chǎn)品產(chǎn)地的判定，有望為香菇的質(zhì)量控制提供新的評(píng)價(jià)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)和方法

1.1 儀器與設(shè)備

2010 plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本,島津集團(tuán))；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑和樣品

內(nèi)標(biāo)：乙酸苯乙酯，二氯甲烷(分析純，Merck)；來自不同產(chǎn)地的49個(gè)香菇樣品(9個(gè)樣品來自浙江產(chǎn)地，15個(gè)樣品來自湖北產(chǎn)地，25個(gè)樣品來自其他?。呵嗪?、吉林、山西、安徽等省)由無限極有限責(zé)任公司提供。

1.3 樣品前處理

取干香菇樣品適量，粉碎，過60目篩，精確稱取8.0 g樣品，加入二氯甲烷100 mL，超聲提取30 min。過濾，濾液濃縮至2 mL，待測。

1.4 GC-MS條件

色譜條件：Rxi-1MS彈性石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm；日本島津集團(tuán))。升溫程序：初始溫度160 ℃，保持2 min；以4 ℃/min 升溫至210 ℃，保持2 min；以4 ℃/min 升溫至260 ℃，保持10 min；以3 ℃/min 升溫至280 ℃；保持10 min；進(jìn)樣口溫度230 ℃；載氣為高純He氣(純度99.999%)；柱流量1.0 mL/min；進(jìn)樣分流比30∶1；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式:EI；電子能量:70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；四極桿溫度150 ℃；全掃描采集模式；掃描質(zhì)量范圍:m/z10～500。溶劑延遲時(shí)間:4.0 min。

1.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)方法

1.5.1色譜預(yù)處理方法(1)自適應(yīng)迭代懲罰最小二乘法法(airPLS):airPLS是結(jié)合懲罰最小二乘法和自適應(yīng)迭代重加權(quán)兩種方法[10]。利用懲罰最小二乘進(jìn)行背景扣除的核心就是在權(quán)重向量w中根據(jù)峰位置信號(hào)對(duì)其加權(quán)，進(jìn)一步通過迭代改變擬合基線與原始信號(hào)之間的總體方差權(quán)重，而該權(quán)重的自適應(yīng)是使用前擬合基線與原始信號(hào)的差異得到。該算法相當(dāng)于連續(xù)多次調(diào)用加權(quán)懲罰最小二乘算法。在airPLS過程中，迭代和重新加權(quán)不斷地自動(dòng)執(zhí)行。該技術(shù)采用了稀疏矩陣技術(shù)，能夠在短時(shí)間內(nèi)有效地完成高通量的色譜數(shù)據(jù)背景扣除。(2)多尺度色譜峰校準(zhǔn):多尺度色譜峰校準(zhǔn)是一種逐漸從小范圍到大范圍，不改變色譜峰的峰形的色譜峰方法[11]。首先，采用持續(xù)小波轉(zhuǎn)換將色譜圖中檢測到的色譜峰轉(zhuǎn)化到小波段空間。接著計(jì)算每個(gè)檢測到的色譜峰的Shannon信息量，將每段的色譜峰Shannon信息量最小的迭代分割，或者剔除有更小段的小段。然后，利用傅里葉快速轉(zhuǎn)換交互檢驗(yàn)計(jì)算可以快速發(fā)現(xiàn)每小段的移動(dòng)，通過結(jié)合鄰近的片段移動(dòng)確定每一部分的最佳移動(dòng)范圍使其相關(guān)系數(shù)最大。最后，利用線性插值方法移除非色譜峰部分。此方法逐步迭代直到所有色譜峰都得到校準(zhǔn)。多尺度算法具有參數(shù)直觀、易于調(diào)節(jié)、校準(zhǔn)結(jié)果準(zhǔn)確、性能好、不改變峰形狀與面積、對(duì)噪音和背景不敏感等優(yōu)點(diǎn)。

1.5.2隨機(jī)森林判別分析隨機(jī)森林算法是由Leo Breiman提出的一種基于分類回歸樹的集成算法，該算法是將Bagging采樣和隨機(jī)變量選擇[12]兩大方法相融合。Bagging算法是通過bootstrap(鞋帶法)有放回的采樣，以構(gòu)建多個(gè)訓(xùn)練集，而最終的預(yù)測結(jié)果由所有構(gòu)建的訓(xùn)練分類器進(jìn)行投票。隨機(jī)森林算法具有以下幾個(gè)優(yōu)勢：(1)隨機(jī)森林算法是一個(gè)多類分類算法，能夠?qū)Χ鄠€(gè)類別的樣本同時(shí)進(jìn)行判別分析；(2)隨機(jī)森林算法是一個(gè)集成算法，通過對(duì)多個(gè)弱分類器進(jìn)行集成分析得到最終結(jié)果，使得模型的建模精確度得到保障；(3)在建模的過程中可以得到每類樣本間的相似性矩陣，利用該相似性能夠可視化的體現(xiàn)樣本間的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1不同提取溶劑的選擇本文利用乙酸乙酯和二氯甲烷對(duì)香菇樣品進(jìn)行提取，并比較兩種方法得到的物質(zhì)信息。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯提取得到的物質(zhì)極性偏大，出峰時(shí)間在40 min以后，而二氯甲烷提取的物質(zhì)較適合GC-MS分析，測試時(shí)間也較好。因此，本文利用二氯甲烷對(duì)香菇樣品進(jìn)行提取。

2.1.2GC-MS分析條件優(yōu)化分別試驗(yàn)了Rxi-SMS(130 m×0.25 mm×0.25 μm)和Rxi-1MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)兩種色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者峰形和分離效果較好?？疾炝朔至鞅?、程序升溫和進(jìn)樣量等分離參數(shù)，發(fā)現(xiàn)分流比固定的情況下，進(jìn)樣量越大，拖尾現(xiàn)象越嚴(yán)重；固定進(jìn)樣量，分流比為50∶1時(shí)，樣品中個(gè)別物質(zhì)含量較低，故最終確定最優(yōu)分離條件為：進(jìn)樣分流比為30∶1；進(jìn)樣量為1 μL。優(yōu)化GC-MS條件見1.4節(jié)。

2.2 香菇中揮發(fā)性成分的測定

在上述最優(yōu)GC-MS條件下，對(duì)來自不同產(chǎn)地的香菇樣品進(jìn)行分析得到其色譜圖。利用airPLS法和多尺度色譜峰校準(zhǔn)方法對(duì)原始譜圖進(jìn)行預(yù)處理后，進(jìn)一步通過NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫搜索和匹配，對(duì)香菇中的特征性物質(zhì)進(jìn)行定性分析，共鑒定出脂肪酸、有機(jī)酸、酯類等40種物質(zhì)(相似度均大于80%)。以保留時(shí)間定性，以所鑒定物質(zhì)色譜峰與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積之比定量。不同產(chǎn)地香菇定性定量結(jié)果見表1。表中列出了不同產(chǎn)地香菇樣品的特征性物質(zhì)及其相對(duì)含量，數(shù)據(jù)形式為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表1 不同產(chǎn)地香菇樣品定性定量分析

(續(xù)表1)

2.3 不同產(chǎn)地香菇樣品的分辨

圖1 不同產(chǎn)地香菇樣品區(qū)分圖Fig.1 Classification results of different original Lentinus edodes samples

本文采用的隨機(jī)森林算法是一類基于分類回歸樹的集成算法，已廣泛用于食品、工業(yè)產(chǎn)品等領(lǐng)域的研究。在算法運(yùn)行的過程中，可利用多維特征尺度變換(MSD)，將這些香菇的特征譜映射到數(shù)值空間，以找到樣品間的相互關(guān)系(相似或相近程度)。香菇樣品的聚類分析結(jié)果見圖1，可見來至不同產(chǎn)地的香菇分別聚集在各自的區(qū)域，體現(xiàn)了每個(gè)產(chǎn)地的香菇都具有其各自的特征。可見南北方的香菇還是存在差異，體現(xiàn)在浙江省和湖北省的香菇產(chǎn)品明顯有別于其他省的產(chǎn)品。

判別分析過程分為以下幾步：首先，從所有香菇樣品中選出80%的產(chǎn)品作為訓(xùn)練集，20%的產(chǎn)品作為獨(dú)立測試集。利用隨機(jī)森林算法對(duì)訓(xùn)練集進(jìn)行訓(xùn)練構(gòu)建預(yù)測模型，其交互驗(yàn)證的預(yù)測準(zhǔn)確率為94.87%，說明隨機(jī)森林算法具有較強(qiáng)的分類能力，能夠有效區(qū)分來自不同產(chǎn)地的香菇樣品。基于構(gòu)建的訓(xùn)練模型，對(duì)剩下的20%的獨(dú)立測試集進(jìn)行分類預(yù)測，其預(yù)測準(zhǔn)確率為90.00%，具體的分類預(yù)測結(jié)果見表2。

表2 對(duì)來至不同產(chǎn)地的香菇樣品分類預(yù)測結(jié)果

3 結(jié)論

本文利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)和隨機(jī)森林等法對(duì)來至不同產(chǎn)地的香菇樣本進(jìn)行分析，能有效區(qū)分不同產(chǎn)地的樣品。該方法的提出是對(duì)現(xiàn)有方法的有效補(bǔ)充，隨機(jī)森林算法更加適合多類數(shù)據(jù)的分類分析，能夠?yàn)橄愎降馁|(zhì)量評(píng)估提供新的方法和參考。