改良QuEChERS/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)蔬菜中14種喹諾酮類抗生素殘留

劉 暢

(哈爾濱市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江哈爾濱 150000)

喹諾酮類又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是一類合成抗菌藥，主要作用于革蘭陰性菌[1]。由于其具有價(jià)格低廉、高效低毒、抗菌廣譜等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于防治動(dòng)物疫病、提高養(yǎng)殖效益、保障公共衛(wèi)生安全等方面。但是近年來，獸藥抗生素的濫用以及國(guó)內(nèi)一些蔬菜產(chǎn)區(qū)的抗生素超標(biāo)情況多有報(bào)道[2 - 4]。蔬菜生長(zhǎng)環(huán)境中的土壤、灌溉水、地下水、作為農(nóng)田有機(jī)肥的動(dòng)物糞便中均存在抗生素檢出甚至是超標(biāo)的情況[5 - 7]。段曉潔[8]的研究表明，生長(zhǎng)環(huán)境中的抗生素會(huì)在植物體內(nèi)遷移；葉菜對(duì)喹諾酮類抗生素的富集程度要比根莖類高；受污染的小白菜不同部位的喹諾酮類抗生素含量差異明顯，依次為葉>根>莖。

目前，在受污染環(huán)境中收獲的蔬菜的安全情況得不到根本保證，所以建立一種檢測(cè)蔬菜中抗生素多殘留的方法尤為重要。吳小蓮等[9]使用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蔬菜中4種喹諾酮類抗生素的殘留，但該方法操作復(fù)雜，成本高，需要操作人員接觸過多有機(jī)試劑，不適合大批量樣品的同時(shí)檢測(cè)。QuEChERS方法具有回收率高、操作簡(jiǎn)單等眾多優(yōu)點(diǎn)，并在動(dòng)物源性食品中的抗生素殘留檢測(cè)中也有較多應(yīng)用[10 - 11]。傳統(tǒng)QuEChERS方法使用MgSO4和NaAc作為萃取鹽，使用乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)作為凈化試劑，考慮到喹諾酮藥物結(jié)構(gòu)中的官能團(tuán)會(huì)與這些萃取鹽發(fā)生反應(yīng)，以及在凈化過程中除去多余水分，保證PSA凈化效果達(dá)到最佳這兩個(gè)因素，本文將QuEChERS前處理方法加以改良，選擇了新的萃取鹽和凈化試劑，適用于蔬菜中喹諾酮類抗生素多殘留的提取，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，為蔬菜中喹諾酮類抗生素多殘留的定量分析和安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)，Waters)；MS3渦旋振蕩器(德國(guó)，IKA)；3K15高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)，SIGMA)；MULTIVAP-30位氮吹儀(美國(guó)，Organomation)；梅特勒ME204分析天平(感量0.0001 g)；Milli-Q高純水發(fā)生器(美國(guó)，Millipore)；梅特勒PL4002電子天平(感量0.01 g)。

近年來，青海省借助與西亞、中亞等國(guó)家的地緣優(yōu)勢(shì)和文化優(yōu)勢(shì)，加快了民族服飾制作、清真食品加工、藏毯藏藥生產(chǎn)等企業(yè)“走出去”的步伐?！肮_克斯坦——中國(guó)商品展覽會(huì)”、“名優(yōu)商品推介會(huì)”等活動(dòng)的舉辦增強(qiáng)了青海特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)與“一帶一路”沿線國(guó)家的貿(mào)易往來。憑借著在開發(fā)電力、制作建材等領(lǐng)域上的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，青海在東南亞等國(guó)家先后開展了境外工業(yè)園區(qū)建設(shè)和資源基地開發(fā)等項(xiàng)目。

諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、依諾沙星(ENO)、培氟沙星(PEF)、氧氟沙星(OFL)、氟羅沙星(FLX)、洛美沙星(LOM)、奧比沙星(ORB)、沙拉沙星(SAR)、雙氟沙星(DIF)、司帕沙星(SPA)、惡喹酸(OA)、氟甲喹(FLU)、諾氟沙星-d5、恩諾沙星-d5、環(huán)丙沙星-d8，純度均≥99.0%(德國(guó)Dr Ehrenstofer)；HAc(分析純，常州通誠(chéng)化工有限公司)；乙腈(優(yōu)級(jí)純，山東紫翔化工有限公司)；無(wú)水Na2SO4(優(yōu)級(jí)純，沈陽(yáng)寧軒化工有限公司)；乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher Scientific)；甲酸(色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(色譜純，天津博納艾杰爾)。

1.2.2液相色譜分析條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm,1.7 μm)，柱溫：40 ℃。流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液，流速：0.30 mL/min，進(jìn)樣體積：5.0 μL。梯度洗脫程序：0～2 min，10%～25%A；2～3 min，25%～45%A；3～4 min，45%～90%A；4～5.5 min，90%A；5.5～5.6 min，90%～10%A。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1樣品前處理準(zhǔn)確稱取黃瓜樣品10.00 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加入1%乙酸乙腈10 mL，再加入10 g無(wú)水Na2SO4，立即渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min。提取上清液8 mL于裝有150 mg PSA和1 g無(wú)水Na2SO4的凈化管中，用力搖勻凈化管30 s，8 000 r/min離心5 min。吸取經(jīng)過凈化的液體5 mL于40 ℃下氮?dú)獯蹈伞堅(jiān)?00 μL乙腈、800 μL水溶解，0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜-質(zhì)譜質(zhì)測(cè)定。

1.2.3質(zhì)譜分析條件多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；電噴霧離子源(ESI+)，離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣流速750 L/h；脫溶劑氣溫度400 ℃；毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔氣速50 L/h。14種喹諾酮類抗生素定性定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)碰撞氣能量見表1。

近些年，隨著國(guó)家大力倡導(dǎo)低碳經(jīng)濟(jì)發(fā)展模式，碳會(huì)計(jì)信息披露得到了更多企業(yè)的重視，但在具體披露過程中，無(wú)論是資金技術(shù)實(shí)力強(qiáng)大的500強(qiáng)企業(yè)還是中小型上市公司，都面臨著披露內(nèi)容規(guī)范性、披露主體重視性、法律制度完善性以及理論知識(shí)實(shí)用性等諸多方面的挑戰(zhàn)。

當(dāng)今世界，不同的國(guó)家面臨著不同的國(guó)情。即使在同一國(guó)家乃至同一地區(qū)，也會(huì)呈現(xiàn)出民族、文化、每個(gè)人所處的具體社會(huì)地位的多樣性，由此也引發(fā)了利益分歧的多樣性，尤其是價(jià)值觀念的多樣性。而價(jià)值觀，是以一定文化的內(nèi)核乃至核心的形式呈現(xiàn)出來的。在此意義上，這種多樣性的價(jià)值觀念，為各個(gè)國(guó)家和地區(qū)開展協(xié)商民主、達(dá)致多元共識(shí)提供了重要的文化條件。這也正如當(dāng)代美國(guó)協(xié)商民主研究領(lǐng)域的知名學(xué)者詹姆斯·博曼所言:“多樣性甚至能夠促進(jìn)理性的公共運(yùn)用，并使民主生活更加充滿活力?！边@一觀點(diǎn)，不僅揭示了價(jià)值觀念的多樣性同民主特別是協(xié)商民主之間的內(nèi)在聯(lián)系，也表征了西方學(xué)界對(duì)于二者關(guān)系具有代表性的認(rèn)知。

表1 14種喹諾酮類抗生素定性定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)碰撞氣能量

*Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了不同種類和用量的凈化劑對(duì)待測(cè)物回收率的影響，以獲得最優(yōu)的凈化條件。在農(nóng)產(chǎn)品分析中，PSA經(jīng)常被用于去除基質(zhì)中的一些干擾物質(zhì)，如碳水化合物、脂肪酸、有機(jī)酸、酚類、色素等。為了避免多余水分影響PSA的凈化效果，這一步還需增加除水劑以確保凈化效果。對(duì)于色素干擾不嚴(yán)重的基質(zhì)如黃瓜等，分別設(shè)計(jì)PSA+Na2SO4(50 mg+1 g)；PSA+Na2SO4(150 mg+1 g)；PSA+Na2SO4(250 mg+1 g)；PSA+Na2SO4(150 mg+500 mg)；PSA+Na2SO4(150 mg+1.5 g) 5組試驗(yàn)來考察PSA和無(wú)水NaSO4的最佳用量。在添加濃度為30 μg/kg水平下，選取PSA+Na2SO4(150 mg+1 g)為凈化劑的一組，喹諾酮的回收率在73.8%～114.3%范圍內(nèi)且重復(fù)性好；其他組喹諾酮的回收率數(shù)值相差較大，甚至依諾沙星、司帕沙星沒有回收，所以選擇PSA+Na2SO4(150 mg+1 g)為凈化劑。對(duì)于色素干擾嚴(yán)重的基質(zhì)，可添加適量石墨化碳黑(GCB)排除色素干擾，但由于GCB對(duì)于平面結(jié)構(gòu)的藥物吸附作用極強(qiáng)，為保證回收率添加量宜少不宜多。以白菜為例，GCB的添加量在60 mg時(shí)，14種獸藥的回收率基本能夠保持在較好范圍內(nèi)。

傳統(tǒng)的QuEChERS方法使用MgSO4和NaAc作為萃取鹽，使目標(biāo)物進(jìn)入有機(jī)相。在本實(shí)驗(yàn)中使用這兩種萃取鹽后，14種喹諾酮中有8種沒有回收，其余幾種回收率也僅在40%左右。這可能是由于喹諾酮分子結(jié)構(gòu)中的3-羧基和4-羰基可與Mg2+等金屬離子螯合[13]，進(jìn)而造成了目標(biāo)物回收率低。改用中性的不與目標(biāo)物發(fā)生反應(yīng)且吸水量更大的無(wú)水Na2SO4作為萃取鹽，得到了較好的回收率。對(duì)于黃瓜這種含水量較高的蔬菜無(wú)水Na2SO4的用量要達(dá)到10 g才能充分吸收水分，為后續(xù)使用PSA凈化創(chuàng)造良好條件；而對(duì)于含水量不如黃瓜的茄子等基質(zhì)來說，為減少過多雜質(zhì)干擾，無(wú)水Na2SO4的用量以6～8 g為宜。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除入組時(shí)根據(jù)病史采集情況，已經(jīng)患有冠心病、心絞痛、心肌梗死、腦出血，腦梗死，腦栓塞的人群。

基質(zhì)效應(yīng)(ME)可以用提取后加標(biāo)法定量測(cè)定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)強(qiáng)度的比值來評(píng)價(jià)，即ME=B/A。其中A表示目標(biāo)物在空白基質(zhì)溶液中的響應(yīng)值，B表示目標(biāo)物在純?nèi)軇┤芤褐械捻憫?yīng)值。如果ME>1，說明產(chǎn)生基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；ME<1，說明產(chǎn)生基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME=1，說明不存在基質(zhì)效應(yīng)[14]。以黃瓜為基質(zhì)，使用凈化試劑前后的基質(zhì)效應(yīng)變化情況見圖2。結(jié)果表明，14種喹諾酮類抗生素中只有3種呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，其余均表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。在使用凈化劑后，大多數(shù)目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)得到抑制。

2.2 凈化試劑的選擇

煙臺(tái)市通過大力實(shí)施生態(tài)建設(shè)工程，不斷加大環(huán)境保護(hù)力度，加強(qiáng)重點(diǎn)流域濕地建設(shè)，推動(dòng)森林和濕地資源實(shí)現(xiàn)穩(wěn)步增長(zhǎng)。今年以來，煙臺(tái)市完成造林11.68萬(wàn)畝，森林撫育20萬(wàn)畝，濕地保護(hù)與修復(fù)7.6萬(wàn)畝，生態(tài)環(huán)境持續(xù)改善。

圖1 不同濃度乙酸乙腈提取效果的比較Fig.1 The comparison of three different concentrations of acetic acid-acetonitriles in extraction efficiencies

圖2 凈化過程對(duì)14種抗生素基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.2 The influence purification process on the matrix effect of 14 antibiotics

喹諾酮是兩性化合物，在酸性環(huán)境下更容易提取。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12]，本實(shí)驗(yàn)選擇0.1%、1.0%、4.0% 3個(gè)濃度的乙酸乙腈作為提取液來考察目標(biāo)物的提取效果。在添加濃度為30 μg/kg水平下，不同濃度的提取液對(duì)14種喹諾酮類化合物的提取情況見圖1。由圖1可知，使用0.1%乙酸乙腈作為提取液時(shí)，目標(biāo)物提取率過低，數(shù)據(jù)波動(dòng)范圍大，精確度差；使用1.0%乙酸乙腈作為提取液時(shí)，各目標(biāo)物的提取率在較好的范圍內(nèi)，平行數(shù)據(jù)波動(dòng)不明顯、精確度良好；隨著乙酸濃度增加，有個(gè)別化合物的提取率達(dá)到120%以上，呈現(xiàn)出明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，且精確度最差。因此，選用1.0%乙酸乙腈作為提取液。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

使用空白樣品的提取液，分別配制濃度為0,1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，氟羅沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星以諾氟沙星-d5為內(nèi)標(biāo)；洛美沙星、奧比沙星、雙氟沙星、環(huán)丙沙星以環(huán)丙沙星-d8為內(nèi)標(biāo)；恩諾沙星、沙拉沙星、司帕沙星、惡喹酸、氟甲喹以恩諾沙星-d5為內(nèi)標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，14種目標(biāo)物在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性方程和相關(guān)系數(shù)列于表2。用信號(hào)強(qiáng)度和噪聲的比值(S/N=3)計(jì)算檢出限(LOD)，以S/N=10時(shí)對(duì)應(yīng)的含量為定量限(LOQ)(表2)。以黃瓜為基質(zhì)，考察方法的準(zhǔn)確度，在3個(gè)添加濃度下，14種喹諾酮類抗生素的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)具體數(shù)據(jù)見表2。

將本方法與已被報(bào)道的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]和分散液液微萃取-高效液相色譜法[15]進(jìn)行對(duì)比，具體情況見表3。

表2 黃瓜中14種喹諾酮類抗生素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限及不同添加濃度下的回收率、精密度

表3 本方法與其他文獻(xiàn)方法的比較

從表3中可以看出，本方法能夠同時(shí)檢測(cè)的喹諾酮類參數(shù)更多；前處理過程考慮的影響因素更少。在能夠滿足檢測(cè)需求，以及達(dá)到同等檢測(cè)水平的情況下，本方法操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高且適用于大批量樣品多參數(shù)的同時(shí)檢測(cè)。

2.4 實(shí)際應(yīng)用

以此方法檢測(cè)了市場(chǎng)上不同種類蔬菜中喹諾酮類抗生素的殘留情況。隨機(jī)抽取白菜、黃瓜、茄子、甘藍(lán)等4種蔬菜共12份樣品，均未檢出上述14種抗生素殘留?？赡艿脑蛴校罕痉椒ㄖ粰z測(cè)了蔬菜的可食用部分，其他部分是否有喹諾酮類抗生素殘留的情況未知，按照段曉潔[8]的研究結(jié)果，抗生素是否遷移到蔬菜其他部位有待研究。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了可同時(shí)檢測(cè)蔬菜中14種喹諾酮類藥物多殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，并優(yōu)化了QuEChERS方法前處理步驟。將這兩種方法相結(jié)合，同時(shí)利用同位素內(nèi)標(biāo)法降低基質(zhì)效應(yīng)，使方法的準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度、重現(xiàn)性均能滿足分析要求，節(jié)省了經(jīng)濟(jì)成本、人員成本和時(shí)間成本，能獲得多種參數(shù)的同時(shí)檢測(cè)。