桑葉多酚氧化酶活性研究

袁婭利 胡玥嬋 郭麗彬 柳 娜 田國政

（湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000）

自然界中，大多數(shù)植物經(jīng)常會發(fā)生褐變，引起植物褐變的原因是多酚氧化酶（PolyphenolOxidase,PPO）與底物接觸發(fā)生氧化還原反應(yīng)，在有氧的條件下催化酚類物質(zhì)形成醌類物質(zhì)，從而生成黑色素，引起植物褐變，在食品行業(yè)里PPO易導(dǎo)致食品產(chǎn)品質(zhì)量惡化。1894年Betrand首次研究了PPO，發(fā)現(xiàn)它是一種酶蛋白。1937年Kubowitz在Warburg實(shí)驗(yàn)室中第1次分離出PPO[1、2]。研究發(fā)現(xiàn)，PPO不僅對植物的褐變產(chǎn)生影響，還會影響植物的抗病性，參與植物的次生代謝，產(chǎn)生毒性物質(zhì)殺死病原菌，PPO活性高會加強(qiáng)嫁接傷口處呼吸作用，加速傷口木質(zhì)化，從而降低成活率[3]，PPO有防御昆蟲[4]的功能。PPO的作用有利有弊。

桑葉是?？浦参锷＃∕orus.aLba.L.）的葉，約占桑樹地上部產(chǎn)量的64%，不僅用作養(yǎng)蠶飼料，且為藥食同源類植物[5]，富含有生物堿、黃酮和多糖類化合物以及多種酶類物質(zhì)，對糖尿病、高血糖和高血壓等疾病的預(yù)防和治療療效顯著[6]。目前，對桑葉PPO的研究較少，對桑葉PPO活性[7]、桑葉PPO引起植物褐變的機(jī)理[8]、桑葉PPO的分離提純[9]等研究有報道，但有很大的局限性。通過對恩施地區(qū)桑葉PPO的深入研究有利于桑葉的深度開發(fā)，充分利用桑葉PPO的性質(zhì)，應(yīng)用到農(nóng)業(yè)、食品等行業(yè)中，提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)價值，降低因植物褐變引起的損失。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

試驗(yàn)材料：幼嫩桑葉采摘于湖北民族學(xué)院綜合實(shí)驗(yàn)樓后山。

試驗(yàn)儀器：AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司上海）、UV-2550紫外可見光分光光度計（尤尼柯儀器有限公司上海）、CR21高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司）、Seven Easy pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司上海）、-80℃超低溫冰箱（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理。取幼嫩的新鮮桑葉，貯存于-80℃超低溫冰箱。取1g桑葉，加入2g二氧化硅及5mL 0.01 moL/L磷酸緩沖液（pH值6）冰浴研磨。收集研磨液定容至50mL在4℃下12000 r/min離心30 min，上清液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 桑葉PPO活性測定方法。在3.9mL磷酸緩沖溶液（pH值7.0）中，加入1.0mL 0.02moL/L焦性沒食子酸溶液及0.1mLPPO粗酶提取液，混勻作為反應(yīng)體系。以0.1mL磷酸緩沖液（pH值7.0）代替粗酶提取液的溶液加入反應(yīng)體系作為空白對照，在420nm波長下吸光度值A(chǔ)[10]。A值每1min內(nèi)變化0.01為1個酶活力單位（U）。則比酶活力計算公式如下：

比酶活力=U/V=100A/V

式中：U=總酶活力，V=粗酶提取液體積，A=吸光度值變化。

1.2.3 pH值影響桑葉PPO活性的測定方法。在3.9mL磷酸緩沖溶液（pH 值 5.0，6.0，6.5，7.0，7.2，7.5，8.0，9.0）中，加入1.0mL 0.02moL/L焦性沒食子酸溶液及0.1mL PPO粗酶提取液，混勻作為反應(yīng)體系，溶液置于室溫下反應(yīng)5min后測定酶的殘留活性。

1.2.4 pH值對桑葉PPO活性穩(wěn)定性測試。在3.9mL PB溶液（pH 值 5.0，6.0，6.5，7.0，7.2，7.5，8.0）中，加入 0.1mL PPO粗酶提取液，混勻作為反應(yīng)體系，將溶液置于4℃冷藏48h后加入1.0mL 0.02moL/L焦性沒食子酸溶液，測定酶的殘留活性。

1.2.5 溫度影響桑葉PPO活性的試驗(yàn)方法。在3.9mL pH值7.0的PB溶液中，加入1.0mL 0.02moL/L的焦性沒食子酸溶液和0.1mL的桑葉PPO酶液，混勻后分別在20、30、40、50、60、70℃下反應(yīng)5min，在420nm下測定酶的殘留活性，前6min每1min測1次，6min后每2min測1次，直至反應(yīng)穩(wěn)定。

1.2.6 溫度對桑葉PPO活性穩(wěn)定性測試。將定量的酶液分別在 20、30、40、50、60、70℃的水浴中加熱 10min。后在 3.9mLpH值7.0的PB溶液中，加入1.0mL 0.02moL/L的焦性沒食子酸溶液，分別在20～70℃水浴中加熱的桑葉PPO酶液0.1mL，混勻后在420nm下測定酶的殘留活性，前6min每1min測1次，6min后每2min測1次，直至反應(yīng)穩(wěn)定。

1.2.7 激活劑、抑制劑影響桑葉PPO活性的試驗(yàn)方法。在3.9mLpH值7.0的PB溶液中，加入1.0mL 0.02moL/L的焦性沒食子酸溶液、0.1mL的桑葉PPO酶液和1mL不同濃度的試劑，混勻后在室溫下測定酶活性。具體試驗(yàn)方案見表1。

表1 不同激活劑、抑制劑對桑葉PPO活性的影響

1.2.8 底物濃度影響桑葉PPO活性的試驗(yàn)方法。在3.9mLpH值7.0的PB溶液中，加入0.1mL的桑葉PPO酶液和1.0mL不同濃度（0.006moL/L、0.008moL/L、0.01moL/L、0.02moL/L、0.04moL/L、0.06moL/L、0.08moL/L）的焦性沒食子酸溶液，混勻后在室溫下測定酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對桑葉PPO活性的影響

如圖1可知，桑葉PPO的最適pH值為6.0，當(dāng)pH值5.0～6.0時，隨著pH值的升高桑葉的PPO活性上升，上升幅度達(dá)到了66%；當(dāng)pH值6.0～9.0時，隨著pH值的上升桑葉PPO活性下降，至pH值9.0時，酶活性降至0.049U，降低幅度達(dá)到了88%。

圖1 pH值對桑葉PPO活性的影響

2.2 溫度對桑葉PPO活性的影響

如圖2可知，桑葉PPO的最適溫度為40℃，當(dāng)20～40℃時，隨著溫度的升高桑葉的PPO活性上升，上升幅度達(dá)到了53%；當(dāng)40～70℃時，桑葉PPO活性慢慢下降，下降了92%，溫度為70℃時酶活性降至0.019U。故最適溫度為40℃。

圖2 溫度對桑葉PPO活性的影響

2.3 桑葉PPO活性的穩(wěn)定性

2.3.1 溫度對桑葉PPO活性的穩(wěn)定性測試。由圖3可得，為保證在最短的時間內(nèi)最大限度地抑制桑葉中酶的活性，以減少高溫對營養(yǎng)活性PPO的活性保留率隨著溫度的升高而逐漸下降，其在20℃的條件下處理10 min后穩(wěn)定性最強(qiáng)。溫度分別為30、40、50、60、70℃時，可以有效抑制PPO活性。另外，70℃下桑葉的PPO的活性損失非常嚴(yán)重，幾乎無保留。

圖3 溫度對桑葉PPO活性的穩(wěn)定性測試

2.3.2 pH值對桑葉PPO活性的穩(wěn)定性測試。如圖4可知，桑葉PPO的最適pH值為6.0，當(dāng)pH值5.0～7.0時，桑葉PPO活性隨著pH值得升高而升高，呈現(xiàn)一個上升趨勢，上升了20%；當(dāng)pH值7.0～8.0時，桑葉PPO活性慢慢下降，下降了55%，pH值為8.0時酶活性降至0.0145U。

圖4 pH值對桑葉PPO活性的穩(wěn)定性測試

2.4 抑制劑對桑葉PPO活性的影響

2.4.1 抗壞血酸對桑葉PPO活性的影響。由圖5可知，抗壞血酸對桑葉PPO抑制作用明顯，當(dāng)抗壞血酸的濃度在0.2～0.6mmoL/L范圍內(nèi)，隨著抑制劑濃度的增加，酶的活性降低，抗壞血酸的濃度從0.6mmoL/L對桑葉PPO抑制作用開始緩慢，抗壞血酸的濃度在0.6mmoL/L是抑制率達(dá)到了86%。

圖5 抗壞血酸對桑葉PPO活性的影響

2.4.2 檸檬酸、亞硫酸鈉對桑葉PPO活性的影響。由圖6可知，檸檬酸、亞硫酸鈉對桑葉PPO都有一定的抑制作用，亞硫酸鈉的抑制作用較檸檬酸明顯，當(dāng)亞硫酸鈉和檸檬酸的濃度在0.01～0.1mmoL/L范圍內(nèi)，隨著抑制劑濃度的增加，酶的活性降低較快，亞硫酸鈉的濃度在0.1mmol/L時，抑制率達(dá)到87%，檸檬酸的濃度在0.1mmoL/L時，抑制率達(dá)到80%。當(dāng)抑制劑濃度超過0.1mmoL/L以后，抑制作用變緩。

圖6 檸檬酸、亞硫酸鈉對桑葉PPO活性的影響

2.5 激活劑對桑葉PPO活性的影響

2.5.1 蔗糖、硼酸和硝酸鋁對桑葉PPO活性的影響。由圖7可知，蔗糖、硼酸和硝酸鋁對桑葉PPO都有一定的激活作用，蔗糖的激活作用較硼酸和硝酸鋁明顯，當(dāng)三者的濃度在0.01～0.1mmoL/L范圍內(nèi)，隨著激活劑濃度的增加，酶的活性增加較快，硼酸的濃度在0.1mmoL/L時激活率達(dá)到88%，蔗糖的濃度在0.1mmoL/L時激活率達(dá)到75%，硝酸鋁的濃度在0.1mmoL/L時激活率達(dá)到73%。當(dāng)激活濃度超過0.1mmoL/L以后，激活作用變緩。

圖7 蔗糖、硼酸和硝酸鋁對桑葉PPO活性的影響

圖8 底物濃度對桑葉PPO的影響

2.6 底物濃度對桑葉PPO活性的影響

由圖8可知，從0.006～0.02moL/L時，桑葉PPO活性隨著濃度上升而之間上升，呈現(xiàn)一個正比的趨勢，上升了78%；從0.02～0.08moL/L時，桑葉PPO活性隨著濃度上升而逐漸下降，下降了50%。所以最適的底物濃度為0.02moL/L的焦性沒食子酸。

3 結(jié)論

通過對桑葉多酚氧化酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，不同條件下對桑葉PPO活性的影響不同，PPO活性的最適溫度為40℃，當(dāng)溫度升高至70℃處理2min能明顯抑制酶的活性，可把70℃作為控制發(fā)生酶促褐變的關(guān)鍵因素和溫控指標(biāo)；pH值對桑葉PPO活性的影響比較明顯，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值可抑制桑葉酶促褐變的發(fā)生，其酶活性最適的pH值為6.0，升高或降低pH均降低酶的活性；最適底物濃度為0.02moL/L的焦性沒食子酸；在桑葉PPO活性的穩(wěn)定性測試中，當(dāng)pH值＜6.5、pH值＞7.2時，桑葉PPO的活性明顯受到抑制；在對桑葉PPO活性的穩(wěn)定性測試中，短時間高溫（70℃）處理明顯地抑制桑葉PPO的活性；進(jìn)一步研究表明，蔗糖、硫酸鋁和硼酸溶液對桑葉PPO活性有一定激活作用，硼酸的濃度在0.1mmoL/L時激活率達(dá)到88%，蔗糖的濃度在0.1mmoL/L時激活率達(dá)到75%，硝酸鋁的濃度在0.1mmoL/L時激活率達(dá)到73%；抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸鈉對桑葉PPO活性有一定抑制作用，亞硫酸鈉的濃度在0.1mmoL/L時抑制率達(dá)到87%，檸檬酸的濃度在0.1mmoL/L時抑制率達(dá)到80%，抗壞血酸的濃度在0.6mmoL/L是抑制率達(dá)到了86%。抑制劑和激活劑有明顯影響酶的活性，且存有明顯的劑量效應(yīng)。本研究為桑葉的開發(fā)以及桑葉PPO的利用提供了依據(jù)。