HPLC法測定果蔬中維生素C含量

孫 晶，張曉莉，師敬敬，郭婷婷

（河南廣電計量檢測有限公司，河南鄭州 450000）

維生素C又名抗壞血酸（Ascorbic Acid），對人體的生長發(fā)育十分重要，能促進代謝及合成膠原蛋白，還能保護細胞膜不受損害，有解毒功效，能有效減少患癌的風險[1-2]。在實際的疾病治療上，常被作為輔助藥物治療糖尿病和甲狀腺機能亢進[3]。在人體內(nèi)，維生素C是高效的抗氧化劑，可減輕抗壞血酸過氧化物酶的氧化應(yīng)激，參與體內(nèi)多種重要的生物合成。由于自身不能合成，人們往往從食物中獲取維生素C，因此研究果蔬中維生素C的含量有重要意義。

目前維生素C的常用檢測方法有高效液相色譜法、紫外分光光度法、2,6-二氯靛酚鈉鹽滴定法、鉬藍比色法等[4]，其中高效液相色譜法具有分離效率高，穩(wěn)定性好，高靈敏度等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于食品藥品中各類維生素的檢測[5]。GB 5009.86—2016將樣品中維生素C用偏磷酸溶液超聲提取后，以離子對試劑為流動相，利用HPLC法測定。由于偏磷酸有劇毒，離子對試劑的使用降低了柱子的耐用性。為解決此問題，本文采用2%乙酸溶液代替偏磷酸溶液為提取液，以甲醇-0.2%乙酸溶液（2∶98，V/V）為流動相，有效解決了該問題。本實驗建立了一種精確、簡單、快速測定果蔬中維生素C含量的方法，為果蔬中維生素C的測定提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗中水果和蔬菜均采購于超市。

1.2 儀器與試劑

賽默飛U3000高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器；色譜柱：C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），超聲波清洗器；L(＋)-抗壞血酸，D(-)-抗壞血酸，BePure公司；實驗所用水均為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 色譜測定條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相0.2%乙酸：甲醇（98∶2），檢測波長：245 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃。進樣量20 μL，在上述色譜條件下，L(＋)-抗壞血酸的保留時間約為4.243 min，D(-)-抗壞血酸的保留時間約為4.430 min。分離度良好，且峰型佳。

1.4 維生素C標準儲備液配制

準確稱取對照品L(＋)-抗壞血酸，D(-)-抗壞血酸5.0 mg，用2%乙酸溶液溶解L(＋)-抗壞血酸和D(-)-抗壞血酸，定容至10 mL的棕色容量瓶中，其濃度為0.5 mg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。標線采用0.2%乙酸進行配制，線性范圍為0.1 ～ 10 μg/mL。

1.5 樣品的制備

稱取2.0 g果蔬樣品至50 mL棕色容量瓶中，加入20 mL 2%乙酸溶液提取，超聲冰浴提取15 min后，4 000 r/min離心3 min，轉(zhuǎn)移至另一50 mL棕色容量瓶中，下層殘渣中再加入20 mL 2%乙酸溶液重復(fù)提取，轉(zhuǎn)移入同一容量瓶中定容至刻度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜（尼龍）過濾后，經(jīng)HPLC分析。樣品含量超線性時稀釋至標線范圍內(nèi)上機。標準溶液和樣品中抗壞血酸的色譜圖分別見圖1和圖2。

圖1 維生素C標準品色譜峰

圖2 樣品中維生素C色譜峰

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

監(jiān)視了245 nm和254 nm兩種波長下的L(＋)-抗壞血酸和D(-)-抗壞血酸的響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種波長下的響應(yīng)差異不明顯，且GB 5009.86—2016中抗壞血酸的檢測波長為245 nm，故最終選擇245 nm作為抗壞血酸的檢測波長。樣品的檢測時間在8 min后沒有雜質(zhì)峰，基線趨于平穩(wěn)，故選擇檢測時間為8 min。

2.2 L(＋)-抗壞血酸和D(-)-抗壞血酸的線性

測 定 了 濃 度 為 0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL 和 10.0 μg/mL 時L(＋ )-抗壞血酸和D(-)-抗壞血酸的響應(yīng)，結(jié)果表明在線性范圍0.1～10 μg/mL范圍內(nèi)L(＋)-抗壞血酸和D(-)-抗壞血酸的線性關(guān)良好。相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，見圖3和圖4。

圖3 L(＋)-抗壞血酸線性

圖4 D(-)-抗壞血酸線性

2.3 提取溶液的選擇

分別選擇0.2%、2.0%、5.0%的乙酸作為提取液，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，選用0.2%的乙酸溶液作為提取液時，樣品的基質(zhì)峰出峰時間過長，目標峰在基質(zhì)峰曲線上，基線不平，如圖5所示。選用5.0%的乙酸溶液作為提取液與2.0%的乙酸溶液作為提取液時的樣品的響應(yīng)相差不大，峰型接近，但是5.0%乙酸的酸性相對較大，考慮到柱子的酸堿耐受性，最終選擇2.0%的乙酸作為提取液。

圖5 0.2%乙酸提取時樣品中L(＋)-抗壞血酸

2.4 提取次數(shù)的選擇

分別對11類果蔬樣品進行了3次提取并測定抗壞血酸的含量。結(jié)果表明，一次提取的值相對較低，二次提取與3次提取的值相差不大，如圖6所示。由于抗壞血酸易分解，故長時間的前處理也不易于實驗的準確性，所以選擇兩次提取做為該實驗的最佳提取次數(shù)。

圖6 不同提取次數(shù)下11種果蔬中維生素C含量

2.5 樣品中維生素C的含量

經(jīng)過試驗，測定出的11種果蔬中的維生素C的含量如圖7所示。

圖7 11種果蔬中L(+)-抗壞血酸的含量

由圖7可知，西紅柿、豌豆芽、菠菜、胡蘿卜、辣椒、黃瓜、西瓜、臍橙、皇帝柑、砂糖橘和紅心蜜柚中L(+)-抗壞血酸的含量分別為10.9 mg/100 g、9.77 mg/100 g、73.3 mg/100 g、1.68 mg/100 g、3.08 mg/100 g、6.37 mg/100 g、8.25 mg/100 g、43.4 mg/100 g、23.4 mg/100 g、16.3 mg/100 g和29.4 mg/100 g。

2.6 加標回收實驗L(＋)-抗壞血酸的含量

分別選擇了西紅柿、胡蘿卜、西瓜進行了加標實驗，加標量分別為 1 μg/mL、2 μg/mL 和 5 μg/mL。L(＋ )- 抗壞血酸和D(-)-抗壞血酸的回收率如表1所示。如表1所示，在不同的添加水平下L(＋)-抗壞血酸和D(＋)-抗壞血酸的回收率均在90%以上，且不同類別的果蔬產(chǎn)品中所含的抗壞血酸均為L(＋)-抗壞血酸，因為D(-)-抗壞血酸的穩(wěn)定性不強，特別容易分解。西紅柿中的L(＋)-抗壞血酸回收率在98.0%～103.0%，胡蘿卜中的抗壞血酸L(＋)-抗壞血酸回收率在91.7%～98.3%，西瓜中L(＋)-抗壞血酸回收率在99.2%～101.0%，D(-)-抗壞血酸的回收率均在98%以上。

表1 西紅柿、胡蘿卜、西瓜中L(＋)-抗壞血酸和D(-)-抗壞血酸回收率

3 結(jié)論

維生素C屬于見光易分解的物質(zhì)，所以在配制標線以及樣品處理過程中用到是棕色容量瓶和進樣瓶，標準溶液配置需在準備上機前再進行配制；醋酸的濃度越高其處理后樣品的色譜峰越干凈，所以酸度對峰型、分離度等有一定的影響。本方法采用高效液相色譜－紫外檢測器法對果蔬中的維生素C含量進行分析，確定了果蔬中維生素C的測定方法為樣品經(jīng)過2%乙酸提取兩次后經(jīng)HPLC測定，檢測波長為245 nm，流動相比例為0.2%的乙酸∶甲醇（98∶2）。該方法回收率高，檢測方法方便快捷。