結(jié)核分枝桿菌Rv1626的原核表達及其免疫功能研究

袁偉 許禮發(fā) 王曉春 張京燕 朱心怡

摘要：目的? 擬靶向結(jié)核分枝桿菌（M.tb）感染后的分泌期抗原Rv1626，構(gòu)建其原核表達質(zhì)粒pPROEX-Rv1626并表達純化，通過人群和動物實驗評價其免疫原性。方法? 構(gòu)建重組載體pPROEX-Rv1626，以全血干擾素釋放分析技術(shù)（WBIA）檢測其是否能被山西省長治市M.tb感染者的T細胞特異性識別;同時免疫小鼠，檢測其特異性誘導脾細胞分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-2水平及抗體水平。結(jié)果? ①成功構(gòu)建重組載體pPROEX-Rv1626，并成功誘導表達、純化和鑒定;②rRv1626蛋白誘導M.tb感染者外周血中淋巴細胞產(chǎn)生的IFN-γ水平均顯著高于健康者對照者（P<0.001），ATB患者外周血中淋巴細胞分泌IFN-γ水平顯著高于LTBI人群（P<0.001）;③BCG+Rv1626/DMT組產(chǎn)生的特異性相關(guān)抗體滴度顯著高于Rv1626/DMT組及BCG組（P<0.01）;Rv1626/DMT組和BCG+Rv1626/DMT組的IgG2a/IgG1比值顯著高于DMT組和BCG組（F=33.69），且前兩組IgG2a /IgG1>1，傾向于Th1型細胞免疫應答;④不同免疫組小鼠無論是PPD或rRv1626蛋白刺激，BCG+Rv1626/DMT組均分泌最高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α，其次為BCG組、Rv1626/DMT組，PBS組為最低。同時Rv1626/DMT組顯著高于DMT組（P<0.01）。結(jié)論? rRv1626能被M.tb感染者T細胞所識別，免疫小鼠能誘導抗原特異性Th1型細胞免疫應答，可能與其提供的免疫保護力密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌;Rv1626;原核表達;免疫原性;結(jié)核病

中圖分類號：R378.91+1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.022

文章編號：1006-1959（2019）01-0065-04

Prokaryotic Expression and Immune Function of Mycobacterium Tuberculosis Rv1626

YUAN Wei1，XU Li-fa1，WANG Xiao-chun1，ZHANG Jing-yan2，ZHU Xin-yi3

（1.School of Medicine，Anhui University of Science and Technology，Huainan 232001，Anhui，China;

2.Department of Clinical Laboratory，Affiliated Heping Hospital，Changzhi Medical College，Changzhi 046000，Shanxi，China）

Abstract：Objective? To target the secretory antigen Rv1626 after Mycobacterium tuberculosis （M.tb） infection， construct its prokaryotic expression plasmid pPROEX-Rv1626 and express it for purification. The immunogenicity was evaluated by human and animal experiments. Methods? The recombinant vector pPROEX-Rv1626 was constructed and tested by whole blood interferon release assay （WBIA） to detect T cells specifically recognized by M.tb infected patients in Changzhi City， Shanxi Province. Simultaneous immunization of mice was used to detect their specific induction. The levels of IFN-γ， TNF-α and IL-2 secreted by spleen cells and antibody levels. Results? ①The recombinant vector pPROEX-Rv1626 was successfully constructed and successfully expressed， purified and identified. ②rRv1626 protein induced IFN-γ levels in peripheral blood of M.tb infected patients was significantly higher than healthy controls （P<0.0001）. At the same time， the level of IFN-γ secreted by lymphocytes in peripheral blood of ATB patients was significantly higher than that of LTBI （P<0.0005）;③The specific antibody titers produced by BCG+Rv1626/DMT group were significantly higher than those of Rv1626/DMT group and BCG group （P<0.01）.The ratio of IgG2a/IgG1 in Rv1626/DMT group and BCG+Rv1626/DMT group was significantly higher than that in DMT group and BCG group （F=33.69）， and the former two groups of IgG2a/IgG1>1 tended to Th1 type cellular immune response; ④Different The mice in the immunized group were stimulated with PPD or rRv1626 protein， and the highest levels of IL-2， IFN-γ and TNF-α were secreted in the BCG+Rv1626/DMT group， followed by the BCG group and the Rv1626/DMT group， and the PBS group was the lowest. At the same time， the Rv1626/DMT group was significantly higher than the DMT group （P<0.005）. Conclusion? rRv1626 can be recognized by T cells infected by M.tb. Immunized mice can induce antigen-specific Th1-type cellular immune responses， which may be closely related to the immune protection provided by them.

Key words：Mycobacterium tuberculosis;Rv1626;Prokaryotic expression;Immunogenicity;Tuberculosis

結(jié)核?。═B）由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染引發(fā)，與獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）、瘧疾（malaria）并稱為世界上三大主要的傳染性疾病。全球約有1/4人群感染M.tb，2016年全球TB新發(fā)病例約為1040萬，其中金磚五國占其總數(shù)的50%以上，中國的TB發(fā)病率和死亡率均在22個TB高負擔的國家位居前列[1]。盡管卡介苗（BCG）在全球接種覆蓋率超過90%，但對接種者的保護效應僅能持續(xù)約5～10年，這可能是由于世界各地BCG培養(yǎng)和免疫策略不同，進而導致基因型的改變[2]。由于BCG無法對成人TB提供足夠的免疫保護力，尤其對M.tb潛伏感染人群（LTBI）效果有限，故亟需更高效的結(jié)核病預防和治療性疫苗。本課題基于篩選和構(gòu)建M.tb感染分泌期高表達抗原Rv1626，以體外人群和體內(nèi)動物實驗檢測其免疫原性，旨在為新型結(jié)核疫苗的研究提供有效的候選靶抗原。

1 材料與方法

1.1實驗材料? E.coli DH5α株、E.coli BL21（DE3）株購自Tiangen生物公司;SPF級C57BL/6小鼠購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心;Ni-NTA 蛋白純化系統(tǒng)購自GE公司;人、鼠相關(guān)細胞因子ELISA kit檢測試劑盒均購自深圳Dakewe公司。二甲基三十六烷基銨（DDA）、單磷酰脂質(zhì)A（MPL）和海藻糖6，6'-二分枝菌酸（TDB）購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計? 分析pPROEX載體上的多克隆位點及Rv1626全序列酶切位點，設(shè)計特異性引物（P1： TTCGGATCC ACCGGCCCCACCACCGACG，P2： ATCTCGAG GGTGTCTTTGGGTGTTCCGAGGGTT）。PCR擴增條件：95 ℃，5 min，94 ℃，50 s，65 ℃，50 s，72 ℃，40 s，30 cycles，72 ℃，10 min。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建表達、純化? 以分子克隆法將Rv1626基因片段導入原核表達載體pPROEX中，構(gòu)建重組載體pPRO-Rv1626，以BamHⅠ和XhoⅠ行雙酶切鑒定。過夜培養(yǎng)后，經(jīng)CaCl2和熱休克法轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，以終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導表達，再以Ni-NTA純化蛋白，4 ℃梯度透析36 h后以內(nèi)毒素清除試劑盒除去內(nèi)毒素（<0.1 EU/ml）。以15% SDS-PAGE及Western blotting分析鑒定蛋白，再以BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.3 IGRA檢測不同人群外周血抗原特異性IFN-γ水平? 委托山西長治醫(yī)院檢驗科，病史采集、問卷調(diào)查及全身體檢，隨機選取感染者和健康者共40例，同時依據(jù)臨床診斷標準對受試人群進行初篩。感染者（包括ATB和LTBIs）：存在（或無）明顯TB感染癥狀、有與TB患者接觸史、痰涂片或痰培養(yǎng)陽性（或陰性）、胸部X光出現(xiàn)可疑陰影（或正常），以及結(jié)核菌素試驗（TST）檢測陽性（TST≥5 mm）;健康對照者：無與TB感染者密切接觸史、TST檢測陰性（TST<5 mm）。

采集受試者的全血，以0.5 ml/孔加入無菌24孔板，并以5 μg/孔rRv1626蛋白進行刺激，置37 ℃溫箱孵24 h。同時分別以等體積的PBS和PHA分別為陰性和陽性對照，收集血漿以人IFN-γ ELISA試劑盒檢測各孔IFN-γ濃度，并得出各孔最終值=實際測得值-PBS刺激的本底值。

1.2.4實驗動物分組及免疫方式? 6周齡雌性C57BL/6小鼠共30只，分為PBS組、BCG組、佐劑DMT（DDA、TDB、MPL）組、Rv1626/DMT組和BCG+Rv1626/DMT組，6只/組。具體免疫方式如下：①PBS組：200 μl PBS /只;②BCG組：200 μl /只（含菌1.2×106 CFU）BCG免疫1次;③DMT組：100 μl DMT混合100 μl PBS /只;④Rv1626/DMT組：含40 μg rRv1626蛋白溶液100 μl混合100 μl DMT /只;⑤BCG+Rv1626/DMT組：先以200 μl/只（含菌1.2×106 CFU）BCG免疫1次，3周后以Rv1626/DMT（含40 μg rRv1626蛋白溶液100 μl混合100 μl DMT /只）增強免疫2次，間隔3周。注射方式：PBS組和BCG組分別為0周注射1次;DMT和Rv1626/DMT組免疫共3次，每3周注射1次;BCG+Rv1626/DMT組0周時先以BCG注射1次，3周后，以Rv1626/DMT增強2次，每3周1次。

1.2.5小鼠血清中抗原性特異性抗體水平檢測? 免疫9周后，對各組小鼠摘眶取血，收集各組小鼠血清，應用間接ELISA法檢測抗原特異性IgG、IgG1、IgG2a滴度（以陽性結(jié)果最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示），以IgG2a和IgG1實際測得的稀釋倍數(shù)計算IgG2a：IgG1。

1.2.6 ELISA檢測脾細胞培養(yǎng)上清中抗原特異性IFN-γ、TNF-α和IL-2 水平? 無菌分離出小鼠脾細胞并定量，將100μl的2.5×106 /孔的脾細胞加入24孔板中，陽性對照組為PPD（10μg /孔）;陰性對照組為RPMI1640培養(yǎng)基;實驗組為Rv1626蛋白（10μg /孔）。37 ℃培養(yǎng)24～72 h后，離心并收集上清，用鼠ELISA試劑盒檢測相應細胞因子分泌水平。

1.3統(tǒng)計學分析? 以SPSS18.0進行數(shù)據(jù)分析，IGRA法檢測不同人群IFN-γ濃度水平，采用非參數(shù)U檢驗，各組小鼠免疫原性相關(guān)指標比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義，P<0.001為統(tǒng)計學意義極顯著。

2 結(jié)果

2.1 pPROEX-Rv1626原核表達載體的構(gòu)建、表達純化和免疫印跡分析? 經(jīng)PCR擴增出大小為612 bp的序列片段，插入pPROEX后，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pPROEX-Rv1626。經(jīng)XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切及測序鑒定無誤（見圖1A、B）。rRv1626蛋白誘導表達并經(jīng)Ni-NTA柱以變性條件純化后，獲得分子量為22.4 kD蛋白產(chǎn)物，與預期符合（見圖1C、D）;經(jīng)Western blotting鑒定其成功表達。BCA試劑盒測定蛋白濃度為1.6 mg/ml，蛋白總表達量為4.5 mg。在Bio-Rad凝膠成像儀經(jīng)圖像分析測得蛋白純度為92.2%。

2.2 rRv1626刺激受試者產(chǎn)生特異性IFN-γ水平比較? 委托山西長治醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科篩選出符合臨床診斷標準的受試者共40例，其中健康對照者、ATB患者和LTBI受試者及分別為10例、14例和16例。rRv1626蛋白誘導M.tb感染者外周血中淋巴細胞產(chǎn)生的IFN-γ水平均顯著高于健康者對照者（P<0.001），同時誘導ATB人群外周血中淋巴細胞分泌IFN-γ水平顯著高于LTBI人群（P<0.001），見圖2A。非特異性刺激物PHA誘導受試者外周血中淋巴細胞產(chǎn)生的IFN-γ水平無統(tǒng)計學差異（P>0.01），見圖2B。

2.3 Rv1626/DMT免疫小鼠誘導高水平的特異性IgG抗體? TMD組產(chǎn)生的IgG抗體及其亞類無顯著的特異性;BCG+Rv1626/DMT組產(chǎn)生的特異性相關(guān)抗體滴度顯著高于Rv1626/DMT組及BCG組（P<0.01）;Rv1626/DMT組和BCG+Rv1626/DMT組的IgG2a/IgG1比值顯著高于DMT組和BCG組（F=33.69），且前兩組IgG2a /IgG1>1，傾向于Th1型細胞免疫應答，見圖3。

2.4 Rv1626/DMT免疫小鼠脾細胞分泌高水平特異性Th1型細胞因子? 不同免疫組小鼠無論是PPD或rRv1626蛋白刺激，BCG+Rv1626/DMT組均分泌最高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α，其次為BCG組、Rv1626/DMT組，PBS組為最低。同時Rv1626/DMT組顯著高于DMT組（P<0.01）。PPD刺激時，BCG組水平顯著高于Rv1626/DMT組、rRv1626刺激時則反之（P<0.01）;各組表達的IL-4水平均較低且無顯著差異，見圖4。

3 討論

篩選M.tb感染后多個不同時期優(yōu)勢表達抗原，并以之為候選靶抗原構(gòu)建TB亞單位疫苗，已成為當今新型結(jié)核疫苗研究的重要策略之一。目前，絕大多數(shù)的新型結(jié)核亞單位疫苗仍聚焦于復制期優(yōu)勢表達抗原，如Ag85A、Ag85B和Rv3619等被廣泛用于TB疫苗研究中，且均證實具有較好的免疫保護效果[3]。近年來，已有12條疫苗進入臨床試驗階段，涉及表達單個或多個靶抗原的不同形式的疫苗有7種，其中亞單位疫苗有4種，尤其以單表達分泌期優(yōu)勢抗原為重要研究靶點。本課題的重要意義在于通過人群和動物實驗篩選出具有潛力的分泌期靶抗原。

Rv1626是M.tb感染復制期分泌的重要抗原[4]。Derrick SC等[5]在2013年使用結(jié)核分枝桿菌攻擊小鼠模型測試了16種抗原，實驗結(jié)果顯示，Rv1626可顯著降低實驗感染動物的肺、脾臟的荷菌量，能誘導強烈的Th1型細胞免疫，刺激分泌IL-2、TNF-α、INF-γ等細胞因子。通過上調(diào)INF-γ激活巨噬細胞，增強其吞噬能力和加工提呈抗原能力，最終有效地殺死M.tb，以及升高IL-2水平以保護宿主抵抗M.tb的感染?？梢奟v1626可能是潛在的免疫原性較強的靶抗原，可刺激機體分泌較高水平的抗原特異性Th1型細胞因子。

本研究首次構(gòu)建并成功克隆表達原核質(zhì)粒pPROEX-Rv1626，通過人群實驗，證實Rv1626誘導ATB者產(chǎn)生的IFN-γ水平顯著高于LTBI者，同時刺激ATB和LTBI受試者產(chǎn)生的特異性IFN-γ水平顯著高于健康者，提示了Rv1626是可被M.tb 感染人群T細胞所識別的特異性抗原，是具有潛力的疫苗靶抗原。在免疫小鼠9周后以及以BCG初免、Rv1626增強免疫后，均誘導了較高水平的TNF-α、IL-2和IFN-γ，同時Rv1626/DMT組和BCG+Rv1626/DMT組小鼠血清IgG2a /IgG1>1，傾向于Th1型細胞免疫應答。

綜上所述，本研究證實了Rv1626可被山西長治市M.tb感染人群T細胞特異性識別。在動物免疫原性實驗中檢測到實驗組抗原特異性Th1型細胞因子水平低于BCG組，可能與Rv1626僅為單個靶抗原、刺激水平不夠有關(guān);這也在BCG+Rv1626/DMT組誘導的相關(guān)細胞因子水平均顯著高于BCG組和Rv1626/DMT組得到了驗證。rRv1626可被TB感染人群T細胞所識別、具有較好的免疫原性，為研制M.tb感染人群（尤其是LTBIs）的預防及治療型疫苗提供了候選靶抗原。本課題研究篩選并構(gòu)建了M.tb感染復制期優(yōu)勢表達抗原，并對其免疫原性進行了深入分析，為構(gòu)建包含多階段抗原的融合疫苗、有效提高其抗M.tb感染的保護性研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Schmit KM，Wansaula Z，Pratt R，et al.Tuberculosis - United States，2016[J].Mmwr Morbidity & Mortality Weekly Report，2017，66（11）：289-294.

[2]Singhal N，Bisht D，Joshi B.Immunoprophylaxis of tuberculosis： an update of emerging trends[J].Arch Immunol Ther Exp，2010，58（2）：97-106.

[3]Evans TG，Schrager L，Thole J.Status of vaccine research and development of vaccines for tuberculosis[J].Vaccine，2016，34（26）：2911-2914.

[4]Reyes PR，Parlane NA，Wedlock DN，et al.Immunogencity of antigens from Mycobacterium tuberculosis， self-assembled as particulate vaccines[J].International Journal of Medical Microbiology，2016，306（8）：624-632.

[5]Derrick SC，Yabe IM，Yang A，et al.Immunogenicity and protective efficacy of novel Mycobacterium tuberculosis antigens[J].Vaccine，2013，31（41）：4641-4646.