多光子皮膚成像技術及其應用

應亞宸，張廣杰*，賈薈琳，陸政元，石玉潔，席 鵬

(1.北京大學 工學院 生物醫(yī)學工程系，北京 100871；2．北京大學 元培學院，北京 100871)

1 引 言

組織成像能為組織病理診斷提供直觀的依據(jù)，在醫(yī)學病理檢查中有著重要的地位。傳統(tǒng)的醫(yī)學病理檢測通常需要切取一定大小的病變組織，其制作病理切片，最后用顯微鏡進一步檢測病變組織，檢測過程耗時較長，并且會為患者帶來額外的痛苦。近幾十年來，有大量的研究者致力于開發(fā)新型組織成像技術，活體光學成像由于具有無創(chuàng)性、成像實時性、可對統(tǒng)一組織區(qū)域進行長時間監(jiān)測等優(yōu)勢[1]，成為研究的熱點?，F(xiàn)在常見的組織光學成像技術有熒光成像、光聲成像[2]、光學相干層析成像(OCT)[3]等。

1990年，Winfried Denk[4]等人創(chuàng)造性地提出了雙光子熒光顯微的概念，繼而發(fā)展出多光子熒光成像技術，為活體組織光學成像提供了新的思路。相較于傳統(tǒng)的單光子共聚焦熒光成像技術，多光子熒光成像具有以下優(yōu)勢：(1)激發(fā)光波長更長，在組織中的散射系數(shù)較小，具有很好的組織穿透性，能夠探測到更深的組織結構；(2)多光子成像的聚焦性好，焦平面外的熒光分子幾乎不被激發(fā)；(3)多光子技術的激發(fā)光光子能量更低，細胞毒性小，對組織的損傷更少，具有很好的安全性[1]。因此，多光子技術在活體組織成像，尤其是皮膚組織的成像中得到了廣泛的使用。近年來，該技術也取得了產(chǎn)業(yè)化的成果：JenLab[5]已經(jīng)推出基于多光子層析成像的皮膚檢測系統(tǒng)，在早期皮膚癌癥診斷、皮膚衰老檢測等方面均有著應用。本文將介紹多光子皮膚檢測系統(tǒng)的主要技術原理，以及其在皮膚組織病理性檢測中的一些應用，并簡要探討這項技術的優(yōu)勢與未來的發(fā)展趨勢。

2 多光子皮膚檢測系統(tǒng)的構成

多光子皮膚檢測系統(tǒng)基于雙光子自發(fā)熒光、二次諧波成像、熒光壽命成像等技術，可以實現(xiàn)皮膚組織結構與功能上的成像[6]。同時，相干反斯托克斯-拉曼散射光譜成像技術也被應用到該檢測系統(tǒng)中，以實現(xiàn)皮膚組織中非熒光物質(zhì)(如脂質(zhì))的成像[7]。

2.1 雙光子自發(fā)熒光

雙光子自發(fā)熒光指基態(tài)熒光分子或原子吸收兩個光子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后恢復到基態(tài)并發(fā)出熒光的過程。熒光分子在吸收第一個光子后，將躍遷至一個虛態(tài)，需要第二個光子在幾飛秒內(nèi)與處于虛態(tài)的熒光分子作用，熒光分子才能從虛態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)[4]。

圖1 主要內(nèi)源熒光分子的(a)激發(fā)光譜；(b)發(fā)射光譜[10] Fig.1 (a)Excitation spectra; (b)emission spectra of primary endogenous fluorophores[10]

自發(fā)熒光物質(zhì)是指生物細胞與組織內(nèi)固有的熒光物質(zhì)。當被合適波長的光激發(fā)時，一些細胞和組織的內(nèi)容物能夠發(fā)出穩(wěn)定的熒光信號，它們也因此被稱為內(nèi)源熒光團[8]。一些內(nèi)源熒光團分子(圖1)廣泛分布于細胞和組織之中，例如NAD(P)H、卟啉類化合物、黃素、黑色素等。皮膚組織中NAD(P)H的含量與皮膚組織細胞內(nèi)氧化還原與新陳代謝水平相關，可作為皮膚衰老檢測的分子標志物[9]；皮膚黑色素瘤會使黑色素細胞的形態(tài)與邊界發(fā)生變化。因此，可以用多光子無標記成像實現(xiàn)對于皮膚疾病的早期探測以及對皮膚衰老的檢測。

在多光子皮膚檢測中，用于成像的主要內(nèi)源熒光團有角質(zhì)層中的角質(zhì)蛋白、顆粒層中的NAD(P)H、基底層中的黑色素、真皮層中的膠原蛋白與彈性蛋白等。由于多光子技術具有很好的共聚焦效應，使用該技術可以獲得不同深度的皮膚組織自發(fā)熒光成像(圖2)。上述熒光團的單光子激發(fā)光波長大多位于紫外光波段(340～400 nm)，會對皮膚組織造成很大的損傷；而使用雙光子激發(fā)則只需近紅外光(700～850 nm)，光子能量較低，大大減小了對活體組織的傷害[11]，也降低了光漂白對熒光成像的影響。同時，自發(fā)熒光成像技術使得皮膚組織在成像時不需要外源熒光團的標記，在臨床應用上更加方便、安全。

圖2 健康人體皮膚活體成像，激發(fā)光波長760 nm：(a)角質(zhì)層，0 μm深：角蛋白自發(fā)熒光信號；(b)顆粒層，20 μm深：角質(zhì)細胞中的透明角質(zhì)顆粒、NADPH、角蛋白自發(fā)熒光信號；(c)棘層，30 μm深：角質(zhì)細胞密度增大；激發(fā)光波長800 nm; (d)真皮層，85 μm深：膠原蛋白、彈性蛋白自發(fā)熒光信號[11] Fig.2 In vivo healthy human skin imaging with excitation wavelength of 760 nm:(a)Stratum corneum, 0 μm depth: auto-fluorescence signal of keratin; (b)Stratum granulosum, 20 μm depth: auto-fluorescence signal of keratohyalin granules, NADPH, and keratin in keratinocytes; (c)Stratum spinosum, 30 μm depth: increased cellular density of keratinocytes; 800 nm excitation wavelength: (d)Dermis, 85 μm depth: auto-fluorescence signal of collagen and elastin[11]

圖3 (a)雙光子激發(fā)熒光(2PEF)和(b)二次諧波成像(SHG)的Jablonski圖[12] Fig.3 Jablonski image of (a)two-photon excitation fluorescence(2PEF) and (b)second harmonic generation(SHG)[12]

2.2 二次諧波成像

二次諧波成像是一種非線性的光學過程，在此過程中，兩個相同頻率光子與非對稱介質(zhì)發(fā)生相互作用，將其從基態(tài)激發(fā)至虛態(tài)。在從虛態(tài)恢復到基態(tài)的過程中，釋放頻率增倍、波長減半的光子(圖3)。由于其可將物質(zhì)自發(fā)激發(fā)至虛態(tài)的特性，二次諧波成像不需要熒光標記，因此不會受到光漂白或光毒性的影響。與雙光子熒光激發(fā)不同的是，二次諧波成像中，被激發(fā)物體吸收的能量和放出的能量大小相同，因此，若對同一物質(zhì)進行雙光子熒光成像與二次諧波成像，所得的成像信號會出現(xiàn)在不同的頻率范圍。

圖4 真皮層中膠原蛋白纖維的SHG信號(藍)與彈性蛋白纖維的自發(fā)熒光信號(綠)[14] Fig.4 SHG signal of collagen fibers(blue) and autofluorescence signal of elastic fibers(green) in the dermis(Scale bar:20 μm)[14]

在生物體中，SHG成像多發(fā)生在細胞的非對稱結構上，如膠原蛋白、微管蛋白等。在皮膚活體成像中，SHG成像也有著重要的應用。通常使用波長為800 nm左右的激發(fā)光，對如真皮層中的膠原蛋白和彈性蛋白網(wǎng)絡進行成像[4]。如圖4所示，綠色熒光信號是真皮層中彈性蛋白的自發(fā)熒光信號，藍色熒光信號是膠原蛋白纖維的SHG信號。與自發(fā)熒光相同的是，這些蛋白的微結構與皮膚疾病的發(fā)展密切相關，有研究表明，在皮膚表淺性基底細胞癌中，膠原蛋白纖維的排布狀態(tài)與正常皮膚不同[13]。因此SHG提供了另外一種監(jiān)測疾病的成像模態(tài)。

2.3 熒光壽命成像

熒光壽命指分子受光脈沖激發(fā)后返回基態(tài)之前在激發(fā)態(tài)平均停留的時間，即激發(fā)停止后，分子的熒光強度降到激發(fā)時最大強度的1/e所需的時間。由于多光子成像需要采用脈沖飛秒激光器，因此特別適合于提取熒光壽命信號。熒光壽命與熒光的初始強度無關，而和熒光分子所處的微環(huán)境有關。熒光壽命通常使用時間相關單光子計數(shù)(TCSPC)技術來測量，可以達到皮秒級的分辨率[1]。熒光壽命成像就是將不同熒光壽命進行可視化區(qū)別的技術。由于熒光壽命和熒光分子所處的微環(huán)境條件、與蛋白的結合、輔酶的代謝能力等一系列組織生理因素有關，熒光壽命成像技術為組織生理情況的檢測(如是否可能患有癌癥)提供了可能[15]。例如，Yuri Dancik[16]等人結合多光子斷層成像與熒光壽命等技術，對亞洲與非洲人種的皮膚顆粒層與基底層進行成像(圖5)，發(fā)現(xiàn)亞洲人種皮膚顆粒層的分子熒光壽命顯著高于基底層以及非洲人種，研究者此后也分析了色素含量與熒光壽命以及熒光強度的相關性，并由此計算出了亞洲人種與非洲人種不同皮膚組織深度中黑色素含量的關系，即非洲人皮膚中的黑色度含量約為亞洲人的4～5倍。

圖5 不同深度皮膚組織自發(fā)熒光強度影像與熒光壽命影像對比. 亞洲志愿者的：(a)顆粒層、(b)基底層；非洲志愿者的：(c)顆粒層、(d)基底層[16] Fig.5 Contrast of auto-fluorescence intensity maps and lifetime color maps:Asian volunteer′s (a)stratum granulosum; (b)stratum basal; African volunteer′s (c)stratum granulosum; (d)stratum basal[16]

2.4 相干反斯托克斯-拉曼散射成像

前面提到的雙光子自發(fā)熒光技術、二次諧波成像技術和熒光壽命成像技術在對某些非熒光物質(zhì)，如脂質(zhì)等的成像中存在一定的限制?；诶⑸涞某上窦夹g能夠提供這些非熒光物質(zhì)的信息，并且具有很好的分子識別度[7]。

相干反斯托克斯-拉曼成像是一個三階非線性光學過程，需要抽運激光束、斯托克斯激光束以及探測激光束等3種激光束與同一樣品發(fā)生作用，最后產(chǎn)生相干光學信號(圖6)。由于共振激發(fā)作用，相干反斯托克斯-拉曼(CARS)能夠比線性拉曼過程提供更強的信號[7]；同時，CARS信號波長相對激發(fā)光有明顯藍移，因此，這項技術具有高峰值、高靈敏度的特點。CARS已經(jīng)應用于皮膚活體成像系統(tǒng)中，主要提供皮膚組織中脂質(zhì)分布的成像(圖7)。鱗狀細胞癌(SCC)能夠使皮膚細胞形態(tài)發(fā)生變化，在CARS成像中無法觀察到清晰的細胞邊界，與正常的皮膚組織成像存在區(qū)別，因此CARS成像可作為SCC的一種輔助診斷方式[17]。

圖6 相干反斯托克斯-拉曼(CARS)的Jablonski圖:(a)拉曼散射; (b)受激拉曼散射; (c)相干反斯托克斯-拉曼 Fig.6 Jablonski image of coherent anti-Stokes Raman scattering(CARS):(a)Raman Scattering; (b)Stimulated Raman Scattering; (c)Coherent Anti-Stokes Raman Scattering

圖7 健康人體皮膚活體成像:(a)CARS成像信號; (b)雙光子激發(fā)熒光/SHG成像信號; (c)CARS-雙光子激發(fā)熒光/SHG成像信號疊加[7] Fig.7 In vivo skin imaging of healthy people:(a)CARS imaging signal; (b)two-photon excitation fluorescence/SHG imaging signal; (c)signal overlay of CARS- two-photon excitation fluorescence/SHG imaging[7]

3 產(chǎn)業(yè)化及應用

圖8 JenLab的多光子皮膚檢測系統(tǒng)MPTflex[5] Fig.8 Multi-photon skin screen system of JenLab—MPTflex[5]

德國JenLab公司已經(jīng)實現(xiàn)了多光子皮膚檢測技術的產(chǎn)業(yè)化(圖 8)。其產(chǎn)品使用近紅外飛秒激光脈沖對皮膚組織進行照射，可得到自發(fā)熒光、SHG、CARS的3種成像信號，形成對皮膚組織結構成分的圖像；同時，利用熒光壽命成像技術能夠得到皮膚組織的微環(huán)境信息，以分析活體組織的生理、病理性狀況[3]。由于雙光子技術具有很好的共聚焦效應，且長波長光具有較小的吸收和散射系數(shù)，這一系統(tǒng)能夠得到深度范圍較大(能夠達到幾百微米級別)的光學層析成像，因此能夠檢測分析皮膚組織各個層次的結構與生理情況。同時，近紅外光對生物組織和熒光團的損傷均極小[1]，因此這一系統(tǒng)具有很好的安全性與無創(chuàng)性，并大大減輕了光漂白對熒光成像的影響。

多光子皮膚檢測系統(tǒng)在早期皮膚癌癥影像診斷、皮膚衰老檢測等方面均發(fā)揮著一定的作用[18]，下面以檢測皮膚衰老為例，簡要介紹該檢測系統(tǒng)的應用。

在人體皮膚衰老的過程中，真皮層中的膠原蛋白纖維與彈性蛋白纖維的形態(tài)、網(wǎng)絡結構會發(fā)生改變。同時，膠原蛋白纖維與彈性蛋白纖維的分布也會發(fā)生改變[11]。圖9展示了在多光子層析成像中，纖維形態(tài)與伸展的不同狀態(tài)，SHG信號由膠原蛋白纖維產(chǎn)生，自發(fā)熒光信號由彈性蛋白纖維產(chǎn)生。

圖9 不同纖維形態(tài)的多光子層析成像圖對比(左：SHG信號；右：自發(fā)熒光信號)[19] Fig.9 Contrast of different fiber morphology MPT images (left: SHG signal; right: auto-fluorescence signal)[19]

在SHG成像中，衰老皮膚真皮層的膠原蛋白纖維呈絲狀(圖9(a1))，而年輕皮膚的膠原蛋白纖維卻是不定型的(圖9(a2))。這可能是由于年輕皮膚真皮層中的膠原蛋白纖維含量豐富，纖維組織緊實致密，因而呈現(xiàn)出不定型的外表；而衰老皮膚中的膠原蛋白含量減少，排列較為稀疏，因此呈現(xiàn)出絲狀。同時，衰老皮膚真皮層中的膠原蛋白表現(xiàn)為彎曲伸展(圖9(c2))，中年皮膚的膠原蛋白表現(xiàn)為直線伸展(圖9(c1))，而年輕皮膚的膠原蛋白纖維排列致密，難以分辨伸展情況。在自發(fā)熒光成像中，衰老皮膚真皮層中的彈性蛋白纖維排列結構混亂(圖9(b2))，并且彎曲伸展(圖9(d2))；而年輕皮膚中的彈性纖維具有良好的網(wǎng)絡結構(圖9(b1))，且直線伸展(圖9(d1))[19]。對于膠原蛋白纖維和彈性蛋白纖維的分布，年輕皮膚真皮層中兩者信號呈均勻的散狀分布，而在衰老皮膚真皮層中，彈性蛋白纖維信號大大增強，而膠原蛋白信號僅能在基底膜下很小的區(qū)域被檢測到[20]。這也與隨著皮膚衰老，膠原蛋白纖維減少而彈性蛋白纖維增多的組織學結論相符合[10]。

4 結 論

多光子皮膚檢測技術具有諸多優(yōu)點。首先，多光子技術具有很好的共聚焦特性，因此能夠?qū)ζつw組織進行較好的層析成像；其次，雙光子熒光技術需要的激發(fā)光波長為普通單光子激發(fā)波長的兩倍，能量較低，對組織的損傷小，使安全的活體檢測成為可能；同時，較長波長的光具有較小的散射與吸收系數(shù)，相比一般的共聚焦技術，能夠探測到更深的組織結構；最后，該技術將熒光強度的探測成像與熒光壽命的探測成像結合起來，不僅能夠?qū)M織內(nèi)部物質(zhì)的形態(tài)進行成像，也能分析組織的物質(zhì)組成、代謝以及生理病理情況，實現(xiàn)多種模態(tài)的結合，使得檢測結果更具有應用價值。

當然，此技術也存在一些不足。由于熒光壽命成像相對傳統(tǒng)熒光成像而言所需的時間較長，在成像期間，被檢測者必須保持完全靜止不動才能獲得較好質(zhì)量的圖像[11]。因此，縮短成像的時間能改善圖像質(zhì)量，并提高患者的就醫(yī)體驗。同時，此系統(tǒng)的單次成像區(qū)域相對臨床上實際待檢區(qū)域(例如皮膚損傷區(qū)域)而言面積較小，若能開發(fā)算法實現(xiàn)圖像的連續(xù)獲取與自動整合，實現(xiàn)較大區(qū)域范圍內(nèi)的皮膚成像[11]，將對臨床診斷大有裨益。

多光子皮膚檢測系統(tǒng)也可通過結合其他種類的影像技術，實現(xiàn)更多模態(tài)的檢測。例如中國科學院深圳先進技術研究院醫(yī)工所生物醫(yī)學光學與分子影像研究室在2016年實現(xiàn)了光聲、雙光子、二次諧波成像3種技術的集成，成功對皮膚組織的微血管、細胞、膠原纖維進行了無標記在體成像[21]，為皮膚組織的臨床檢測提供更全面的生理信息。此外，該系統(tǒng)也可通過進一步集成皮膚血管血流量、血氧檢測等手段，為病理檢測提供關鍵的生物特征信息。最后，在智能醫(yī)療快速發(fā)展的今天，將此多光子皮膚檢測系統(tǒng)與機器學習、圖像自動分割相結合，實現(xiàn)一些病灶的自動檢出，輔助醫(yī)生進行診斷，不失為此類醫(yī)學影像系統(tǒng)的未來發(fā)展方向之一。