N末端改造提高GH11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性的研究進(jìn)展

侯 潔，蔣玥鳳，熊 科，楊 然，李秀婷,*

（1.北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048；3.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048）

木聚糖是半纖維素的主要組成成分，廣泛存在于植物細(xì)胞壁中，是自然界最豐富的生物質(zhì)資源之一[1]。木聚糖酶（EC 3.2.1.8）是一組能夠?qū)⒛揪厶墙到鉃榈途勰咎呛湍咎堑膹?fù)合水解酶，主要包括β-1,4-D-外切木聚糖酶、β-1,4-D-內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶；其中，β-1,4-D-內(nèi)切木聚糖酶作用于主鏈內(nèi)部的木糖苷鍵，起主要降解作用[2-3]。木聚糖酶可分為GH5、7、8、10、11和GH43等家族[4]，根據(jù)其結(jié)構(gòu)組成以及理化性質(zhì)的不同，主要分為GH10和GH11家族[5]。

近年來，木聚糖酶廣泛應(yīng)用于造紙、飼料、食品等行業(yè)[6]。由于許多工業(yè)生產(chǎn)過程需要在高溫條件下進(jìn)行，熱穩(wěn)定性差成為大多數(shù)天然木聚糖酶在工業(yè)應(yīng)用上的瓶頸。與GH10族木聚糖酶相比，GH11家族木聚糖酶具有催化效率高、底物專一性好等優(yōu)點(diǎn)，引起了研究者的廣泛關(guān)注。為了使酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的GH11家族木聚糖酶在高溫條件下的應(yīng)用不受限制，越來越多的研究人員致力于GH11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性的改善。大量研究表明N末端區(qū)域序列對(duì)于GH11家族木聚糖酶的耐熱性具有重要作用[7-9]；因此，許多研究者通過N端改造的方法成功提升了GH11家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。本文從GH11家族木聚糖酶分子的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)特點(diǎn)、影響其熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素、N末端改造提升木聚糖酶耐熱性的技術(shù)和方法，以及耐熱木聚糖酶的應(yīng)用領(lǐng)域方面進(jìn)行綜述，以期為GH11家族木聚糖酶的耐熱性研究提供一定的參考。

1 GH11家族木聚糖酶

GH11家族木聚糖酶由2 個(gè)反向平行的β-折疊和1 個(gè)α-螺旋構(gòu)成，空間結(jié)構(gòu)如圖1所示，呈“右手半握狀”，β-折疊的一側(cè)扭轉(zhuǎn)與另一側(cè)形成裂縫，活性中心位于裂縫的凹槽處[10]。木聚糖酶的催化機(jī)制與其他糖苷水解酶類似，為雙替換機(jī)制[3]。其中一個(gè)氨基酸作為酸堿催化劑使底物質(zhì)子化，另一個(gè)氨基酸作為親核體對(duì)底物進(jìn)行親核攻擊，產(chǎn)生的糖片段與活性中心分離，促進(jìn)酶-糖基共價(jià)中間體的形成，而后水分子上的羥基結(jié)合至正碳離子，質(zhì)子結(jié)合至親核基團(tuán)，反應(yīng)結(jié)束[11]。由于GH11家族木聚糖酶底物結(jié)合位點(diǎn)位于較深的裂縫中，與GH10家族相比，與底物結(jié)合更緊密，從而具有較強(qiáng)的底物專一性，水解產(chǎn)物中低聚木糖的含量較多，單糖較少，且具有廣泛的酸堿適應(yīng)性[12-13]。

GH11家族的木聚糖酶的分子質(zhì)量一般小于30 kDa，多為單一結(jié)構(gòu)域。雖然GH11家族的木聚糖酶具有優(yōu)良的酶學(xué)特性，但是大多屬于中溫木聚糖酶，熱穩(wěn)定性較差。表1為部分GH11家族木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，最適反應(yīng)溫度均低于50 ℃，溫度高于55 ℃時(shí)不穩(wěn)定。

圖1 GH11家族木聚糖酶空間結(jié)構(gòu)Fig.1 Spatial structure of GH11 xylanases

表1 GH11族木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)Table1 Enzymatic properties of GH11 xylanases

2 影響GH11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性的因素

生物信息學(xué)分析手段以及基因工程技術(shù)的發(fā)展，使得木聚糖酶熱穩(wěn)定性相關(guān)機(jī)制的研究更加透徹。在研究的過程中發(fā)現(xiàn)許多因素都會(huì)對(duì)木聚糖酶的耐熱性造成重要影響，其中比較重要的因素包括氫鍵和鹽橋的數(shù)量與位置、氨基酸的組成與比例、二硫鍵和疏水相互作用等。

2.1 氫鍵和鹽橋

氫原子與一些電負(fù)性強(qiáng)的原子形成偶極矩較大的基團(tuán)，導(dǎo)致電子云偏向帶負(fù)電的原子，當(dāng)裸露的氫核遇到其他電負(fù)性強(qiáng)的原子時(shí)，產(chǎn)生靜電相互作用，即氫鍵。氫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力。Purmonen[21]、Vieira[22]等的研究發(fā)現(xiàn)耐熱木聚糖酶氫鍵的數(shù)量一般要高于中溫木聚糖酶。另外，蛋白質(zhì)分子與水之間也可以形成氫鍵。大多數(shù)蛋白質(zhì)分子趨向于主肽鏈之間形成的氫鍵數(shù)量最多，同時(shí)應(yīng)盡可能保證側(cè)鏈與介質(zhì)水之間的相互作用，這種相互作用有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[23]。

鹽橋是指帶電荷氨基酸側(cè)鏈的正負(fù)基團(tuán)相互接近時(shí)，形成的靜電相互作用。鹽橋的形成對(duì)保持蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象產(chǎn)生積極影響，有助于改善蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性[24]。Xue Huping等[25]對(duì)Neocallimastigales rumen來源的木聚糖酶進(jìn)行突變后，突變體XynR8的熱變性溫度Tm值與野生型相比升高約9 ℃。根據(jù)三維建模結(jié)果推測(cè)，氨基酸突變后鹽橋的形成可能是其耐熱性提高的重要原因。

2.2 氨基酸的組成和比例

通過比較GH11家族中溫木聚糖酶和耐熱木聚糖酶的序列和結(jié)構(gòu)信息，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中所含氨基酸殘基的種類對(duì)耐熱性具有一定的作用。Sriprang等[26]在對(duì)黑曲霉BCC14405木聚糖酶XylB的改造過程中，用精氨酸殘基替換蛋白質(zhì)分子表面的絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基后，所形成的突變株ST4和ST5在50 ℃的半衰期比野生型提高了18～20 倍。精氨酸為堿性氨基酸，位于分子表面時(shí)，可以通過與介質(zhì)水之間發(fā)生偶極-電荷作用形成水化層，增加蛋白分子的穩(wěn)定性。

脯氨酸的N原子位于吡咯環(huán)上，使前一個(gè)氨基酸與其形成肽鍵（CaüN）時(shí)不能自由轉(zhuǎn)動(dòng)，有利于增強(qiáng)蛋白的剛性。同時(shí)，吡咯環(huán)也具有疏水性，以上特性導(dǎo)致脯氨酸的構(gòu)形熵小于其他氨基酸，所連接的β-折疊股比較穩(wěn)定[27-28]。采用脯氨酸替換中溫木聚糖酶中某些分子自由度高的氨基酸，有望提升其耐熱性。但替換單一氨基酸的效果可能并不明顯，Yang Wenhan等[29]在替換脯氨酸的同時(shí)引入一個(gè)二硫鍵，突變體在60 ℃的半衰期提升了22 倍。

芳香族氨基酸含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，包括酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。芳香族氨基酸的相互作用對(duì)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定具有重要貢獻(xiàn)。Georis等[30]在中溫木聚糖酶Xyl1中引入芳香族氨基酸酪氨酸，使其最適反應(yīng)溫度提高了10 ℃，結(jié)構(gòu)分析顯示Y11及Y16氨基酸分別存在于β-折疊B1和B2鏈上，這兩個(gè)芳香族氨基酸的相互作用提高了木聚糖酶N末端的穩(wěn)定性。組氨酸的咪唑環(huán)與芳香族氨基酸的苯環(huán)的相互作用也有助于酶分子的穩(wěn)定。

此外，氨基酸的比例也對(duì)GH11家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定性具有一定影響。Hakulinen等[31]發(fā)現(xiàn)在耐熱木聚糖酶中，蘇氨酸/絲氨酸的比值較高。

2.3 二硫鍵

二硫鍵是蛋白分子空間結(jié)構(gòu)上位置相鄰的兩個(gè)半胱氨酸殘基的巰基基團(tuán)發(fā)生氧化反應(yīng)形成的共價(jià)鍵。二硫鍵與蛋白質(zhì)的折疊過程密切相關(guān)，其鍵能遠(yuǎn)大于其他次級(jí)鍵，在維持高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面具有十分重要的作用。研究表明，二硫鍵通過降低蛋白質(zhì)解折疊狀態(tài)的熵值，從而穩(wěn)定酶分子的構(gòu)象[32]。在GH11家族天然的木聚糖酶中，發(fā)現(xiàn)少數(shù)耐熱酶含有一個(gè)二硫鍵，存在于β-折疊股B9和α-螺旋之間[33]。雖然，在GH11家族野生型木聚糖酶的N末端一般不存在二硫鍵，但是在與其結(jié)構(gòu)相似的GH12家族葡聚糖酶中，大多N末端區(qū)域存在二硫鍵。并且，經(jīng)過定向進(jìn)化隨機(jī)突變獲得的超耐熱木聚糖酶Evxyn11TS的N末端也形成了一個(gè)二硫鍵，使木聚糖酶分子的結(jié)構(gòu)更加緊湊。因此，通過在GH11家族木聚糖酶合適的位置引入二硫鍵，有利于改善蛋白酶的熱穩(wěn)定性。

2.4 疏水作用

疏水作用是指蛋白在水介質(zhì)中形成折疊時(shí)，大部分疏水殘基傾向于被埋藏在分子的內(nèi)部。由于木聚糖酶分子內(nèi)部為典型的疏水結(jié)構(gòu)，疏水相互作用的增強(qiáng)可以促進(jìn)疏水核心的有效包埋。通過分析比較耐熱酶與中溫酶的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)耐熱酶趨向于通過包裝效應(yīng)形成更密實(shí)的空腔，從而使分子結(jié)構(gòu)更加緊湊和穩(wěn)定。Kim等[34]發(fā)現(xiàn)了更有利于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的疏水結(jié)構(gòu)簇構(gòu)象，通過定點(diǎn)突變（W58F、G64A、K95L、H156V、M158L和V168I）將其整合到環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶分子內(nèi)，使木聚糖酶的局部結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，突變體半衰期提高了78 倍，Tm值提高了8.8 ℃。You Chun等[35]構(gòu)建突變體G201C和C60A-G201C，Tm與野生型相比分別提高約10 ℃和12 ℃；同源建模結(jié)果顯示，突變酶中氨基酸殘基C50、C60與C201在空間相近，但是硫醇滴定結(jié)果排除了二硫鍵的存在；進(jìn)一步分析表明氨基酸殘基C50和C201在空間結(jié)構(gòu)上形成疏水基團(tuán)相互作用。由此可知，半胱氨酸除了形成二硫鍵使蛋白酶分子結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，也可以通過疏水相互作用來提升蛋白酶分子的熱穩(wěn)定性。

3 N末端區(qū)域的改造策略

N末端區(qū)域是GH11家族木聚糖酶分子解折疊的起始區(qū)域，與GH11家族木聚糖酶的耐熱性密切相關(guān)[36]。Lee等[37]對(duì)耐熱木聚糖酶XynA的N末端區(qū)域進(jìn)行刪除突變，突變體的熱穩(wěn)定性喪失但酶活性保持不變，從而確定了N末端是其熱穩(wěn)定區(qū)。也有研究表明，GH11家族的耐熱木聚糖酶與中溫木聚糖酶相比大多存在較長(zhǎng)的N端，這部分序列趨向于形成1 個(gè)β-折疊片段，而中溫木聚糖酶N末端區(qū)域的相應(yīng)位置主要為一段無規(guī)卷曲序列[38]。在二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無規(guī)卷曲的柔性較大，與α-螺旋和β-折疊相比穩(wěn)定性較差。因此，通過對(duì)中溫木聚糖酶的N端序列進(jìn)行分析和改造，有助于提升GH11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性，更好地發(fā)揮其應(yīng)用價(jià)值，N末端區(qū)域改造的主要策略示意圖見圖2。

圖2 N末端區(qū)域改造策略示意圖Fig.2 Schematic illustration of N-terminal modif i cation

3.1 N末端替換

研究表明，利用耐熱木聚糖酶的N末端替換中溫木聚糖酶的N末端，可以一定程度提高中溫木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。

首先需要選擇合適的耐熱木聚糖酶N末端片段。通過對(duì)耐熱木聚糖酶與中溫木聚糖酶的序列同源性進(jìn)行比對(duì)和分析，判斷所研究的中溫木聚糖酶熱穩(wěn)定性差的根本原因是否與其N末端序列相關(guān)，選擇全序列同源性較高且N末端同源性較低的耐熱木聚糖酶作為替換模板，使得整體序列的差異性較小，有利于融合突變體的成功表達(dá)。Evxyn11TS和TfxA屬于目前發(fā)現(xiàn)的較少數(shù)GH11家族的耐熱木聚糖酶，由于其N末端均被證實(shí)對(duì)熱穩(wěn)定性有突出貢獻(xiàn)，經(jīng)常被研究者作為替換模板。其中，木聚糖酶Evxyn11TS是通過定向進(jìn)化獲得的重組酶，且在7 個(gè)突變位點(diǎn)中，6 個(gè)存在于N端，其Tm值為101 ℃，在85 ℃保溫15 min后，剩余酶活力仍為85%[42]。TfxA屬于天然未經(jīng)改造的重組酶，在75 ℃下保溫18 h仍有96%的剩余酶活力[37]。

其次還需要確定替換片段的長(zhǎng)度，根據(jù)序列比對(duì)分析及分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法，確定合適的替換位置，能夠在提升熱穩(wěn)定性的同時(shí)，保持中溫木聚糖酶的本身優(yōu)良性質(zhì)。Yin Xin等[43]將Aspergillus oryzae來源的中溫木聚糖酶AoXyn11N末端的57 個(gè)氨基酸替換成耐熱酶Evxyn11TS的相應(yīng)序列，重組酶NhXyn1157最適反應(yīng)溫度提高了25 ℃，熱穩(wěn)定性由40 ℃提升至60 ℃。Zhang Huimin等[39]也采用Evxyn11TSN末端的38 個(gè)氨基酸替換了中溫木聚糖酶Auxyn11AN末端的33 個(gè)氨基酸，重組酶AEXynM的Tm提升了34 ℃，進(jìn)一步的研究表明，氨基酸Cys5、Pro9、和His14對(duì)重組酶熱穩(wěn)定性的提升起主要作用。Sun Jianyi[44]、楊浩萌[45]等均選擇耐熱木聚糖酶TfxA的N末端，分別替換中溫酶AnxA及XYNB的N末端，最適反應(yīng)溫度均提高了10 ℃。

分析耐熱N末端突變體的結(jié)構(gòu)特征及氨基酸相互作用，與突變前木聚糖酶分子進(jìn)行同源建模比較，找到影響耐熱性提升的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，可以為其他改造策略中突變位點(diǎn)的選擇提供更廣闊的思路。

3.2 N末端引入部分氨基酸

木聚糖酶的來源廣泛，不同來源的GH11家族木聚糖酶，序列具有一定的差異性，因此通過突變大量氨基酸提升熱穩(wěn)定性的方法存在一定限制。N末端整體替換的策略涉及較多的氨基酸改變，可能會(huì)對(duì)突變體的酶學(xué)性質(zhì)造成消極影響。Song Letian等[46]所構(gòu)建的N末端延伸了17個(gè)氨基酸的突變體Ntfus，熱穩(wěn)定性和熱變性溫度均稍有下降，而催化效率有所提高。Zhang Shan等[40]通過對(duì)耐熱突變體STxAB的N末端區(qū)域進(jìn)行分段研究，確定了5 個(gè)突變位點(diǎn)（T11Y、N12H、N13D、F15Y、Y16F）對(duì)該酶耐熱性的提升起到主要作用；在此基礎(chǔ)上，又結(jié)合定點(diǎn)突變N32G和S33P，進(jìn)一步提升了其熱穩(wěn)定性[47]。由此可知，N末端區(qū)域引入部分氨基酸，可以對(duì)GH11家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定性起到良好的改善作用。

為了減小對(duì)酶分子空間結(jié)構(gòu)的影響，考慮采用N末端引入部分氨基酸而非N端全部替換的方式進(jìn)行耐熱性改造。目前木聚糖酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理已知，可以使用生物信息學(xué)手段進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)，選擇合適的突變位點(diǎn)。楊浩萌等[48]在橄欖綠鏈霉菌Streptomyces olivaceoviridis木聚糖酶XYNB的N末端區(qū)域分別引入點(diǎn)突變N13D和S40E，在70 ℃處理5 min后，與野生型相比，突變體的熱穩(wěn)定性分別提高了24.76%和14.46%。柏文琴等[49]通過理性設(shè)計(jì)在GH11家族堿性木聚糖酶Xyn11A-LC的N末端區(qū)域同時(shí)引入芳香族氨基酸T9Y和D14F，突變體的Tm值由55.3 ℃提升至67.9 ℃。Watanabe等[50]結(jié)合多序列比對(duì)結(jié)果，在GH11家族中溫木聚糖酶XylC的N末端區(qū)域選擇9 個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，變性溫度顯著提升20 ℃，且仍保持較高的酶活力。通過對(duì)突變體進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)N末端區(qū)域結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，推測(cè)N末端區(qū)域的變化是突變體耐熱性改善的原因。

熱穩(wěn)定性的大幅度提升往往需要多個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)突變，而突變氨基酸數(shù)目和位置影響酶分子的空間結(jié)構(gòu)。近年來，有研究表明N末端區(qū)域與底物結(jié)合方式及催化效率相關(guān)[51-52]。因此，應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)在N末端區(qū)域改造木聚糖酶熱穩(wěn)定性時(shí)，需要深入分析并充分了解目標(biāo)木聚糖酶的序列特點(diǎn)，避免酶活力的損失。

3.3 N末端構(gòu)建二硫鍵

大量研究表明，N末端二硫鍵的存在是GH11家族木聚糖酶Evxyn11TS耐熱的重要原因，將相應(yīng)位置的半胱氨酸突變?yōu)樘K氨酸，突變體的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性均有明顯下降[53]。以Evxyn11TS為模板進(jìn)行N末端替換，對(duì)耐熱突變體AoXyn11A[54]和SyXyn11[55]采用定點(diǎn)突變的方法去除二硫鍵后，耐熱性均降低。許多研究者也已經(jīng)通過在GH11家族中溫木聚糖酶的N末端區(qū)域引入二硫鍵改善其熱穩(wěn)定性。Fenel等[41]通過構(gòu)建二硫鍵T2C-T28獲得的突變體，在65 ℃下的半衰期由40 s延長(zhǎng)至20 min。N末端二硫鍵Q1C-Q24C的引入，使GH11家族木聚糖酶TLX的最適溫度和熱變性溫度均提升了10 ℃[56]。因此，在N末端區(qū)域引入二硫鍵，對(duì)熱穩(wěn)定性的提升具有重要作用。

形成二硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸殘基，一般空間距離很近，而序列距離可能很遠(yuǎn)。通常條件下，二硫鍵的形成受周圍氨基酸環(huán)境的影響和限制。若要成功地在GH11家族木聚糖酶分子中構(gòu)建二硫鍵，首先需要根據(jù)三維建模結(jié)果，結(jié)合二硫鍵預(yù)測(cè)軟件（Disulfide by Design），找到可以突變形成二硫鍵的氨基酸對(duì)，與已知含二硫鍵的耐熱木聚糖酶序列進(jìn)行比對(duì)分析，從而確定引入二硫鍵的最優(yōu)位置構(gòu)建突變體，然后再驗(yàn)證二硫鍵是否形成。通過比較斷開二硫鍵前后突變體在聚丙烯酰胺凝膠電泳的遷移率，可以初步判斷二硫鍵是否構(gòu)建成功[57]。采用Ellman試劑測(cè)定加入還原劑前后的巰基含量，同樣可以檢測(cè)二硫鍵的存在并估算其數(shù)量。一般而言，若要確認(rèn)二硫鍵形成的具體位置，還需要經(jīng)過酶解-質(zhì)譜法進(jìn)行驗(yàn)證和分析。

鑒于在GH11家族少量的耐熱木聚糖酶中，發(fā)現(xiàn)分子內(nèi)部α-螺旋與β-折疊之間存在二硫鍵，有研究者在與其序列相似度高的木聚糖酶分子的相應(yīng)位置引入二硫鍵，成功構(gòu)建了熱穩(wěn)定性提升的突變體[58-59]，證實(shí)了二硫鍵對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要作用。與分子內(nèi)引入二硫鍵相比，在N末端構(gòu)建二硫鍵更有利于蛋白質(zhì)新生肽鏈的延伸，可減少錯(cuò)誤折疊的可能性。

4 耐熱木聚糖酶的應(yīng)用

木聚糖酶作為一種綠色高效的生物催化劑，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、造紙、醫(yī)藥、能源等領(lǐng)域。不同領(lǐng)域?qū)τ谀揪厶敲傅男枨蟛煌?，?duì)應(yīng)酶的酶學(xué)性質(zhì)具有差異。GH11家族木聚糖酶由于催化效率高、底物專一性強(qiáng)，具有良好的應(yīng)用潛力。然而，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，經(jīng)常會(huì)遇到高溫環(huán)境。例如在食品工業(yè)中，較高的溫度可以提升底物的溶解性并防止雜菌污染[60]；造紙工業(yè)中需在高溫下對(duì)紙漿進(jìn)行漂白處理[61]；在飼料工業(yè)中同樣存在短暫高溫制粒過程[62]。因此，耐熱木聚糖酶具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。

4.1 食品工業(yè)

阿拉伯木聚糖是小麥面粉中非淀粉多糖的主要成分，其中水不溶性阿拉伯木聚糖含量與面團(tuán)流變性和面制品口感密切相關(guān)。在面粉中添加適量的木聚糖酶可以使不溶性阿拉伯木聚糖增溶，提高面團(tuán)的柔軟度和拉力，從而改善面制品品質(zhì)。在面包等焙烤食品中加入木聚糖酶，可以顯著增大面包體積，改善面包心質(zhì)地，降低面包的老化速率，延長(zhǎng)貨架期[63-64]。在果蔬汁的生產(chǎn)過程中，木聚糖酶能夠使果汁澄清，同時(shí)釋放寡糖和單糖，并提升口感[65]。釀酒工業(yè)中，木聚糖酶可以通過破壞原料細(xì)胞結(jié)構(gòu)，降低啤酒的黏度，增強(qiáng)麥芽汁的濾過性能，達(dá)到提高產(chǎn)率的目的[66]。

木聚糖的水解產(chǎn)物中含有低聚木糖，能夠作為益生元提高雙歧桿菌活性、改善腸道環(huán)境、幫助消化、增強(qiáng)人體免疫力；同時(shí)也可以代替蔗糖作為低能量甜味劑，避免人體血糖水平大幅度波動(dòng)，適于生產(chǎn)糖尿病人所需的低糖食品。

4.2 飼料工業(yè)

在飼料工業(yè)領(lǐng)域中，木聚糖酶能夠破碎植物細(xì)胞壁，作用于飼料中的非淀粉多糖，消除其抗?fàn)I養(yǎng)作用，從而提高蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉等養(yǎng)分的消化吸收。研究表明，在小麥日糧中添加木聚糖酶能夠提高家禽的養(yǎng)分消化率和日糧代謝能值[67]。木聚糖酶通過降解飼料中的黏性木聚糖成分，可以降低食糜黏性，提高消化酶對(duì)底物的作用效率，因此廣泛應(yīng)用于飼料添加劑中。Hernández等[68]將木聚糖酶與釀酒酵母混合作為飼料添加劑，有效降低了反芻動(dòng)物腸道溫室氣體的排放量，對(duì)環(huán)境保護(hù)具有重要意義。根據(jù)動(dòng)物消化道pH值較低的特點(diǎn)，飼料添加劑中選取酸性木聚糖酶更加合適[69]。

5 結(jié) 語

隨著GH11家族木聚糖酶耐熱機(jī)制研究的逐步深入，N末端區(qū)域被認(rèn)為是影響GH11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵區(qū)域。許多研究人員通過N末端整體替換、定點(diǎn)突變，以及在此區(qū)域引入二硫鍵等方式大幅度提升了GH11家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。不同來源的木聚糖酶蛋白序列具有一定差異；因此在選擇N末端改造策略時(shí)，首先要對(duì)待改造的木聚糖酶基因進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，通過結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等方法，找到對(duì)熱穩(wěn)定性有重要作用的關(guān)鍵區(qū)域或氨基酸位點(diǎn)，而后采用合適的策略進(jìn)行耐熱性改造。此外，GH11家族木聚糖酶分子的α-螺旋區(qū)域同樣對(duì)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要。近年來，也有研究者將N末端改造與分子內(nèi)部改造相結(jié)合進(jìn)行復(fù)合突變，進(jìn)一步提升了GH11家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定性[55]。

木聚糖酶熱穩(wěn)定性的研究有助于降低工業(yè)生產(chǎn)成本和市場(chǎng)應(yīng)用的推廣。雖然目前已經(jīng)在分子水平上對(duì)木聚糖酶的結(jié)構(gòu)信息和耐熱機(jī)制進(jìn)行了一定的了解，也通過蛋白質(zhì)工程成功構(gòu)建了熱穩(wěn)定性提升的突變體，但是與超耐熱的蛋白酶分子相比仍有差距。因此，GH11家族木聚糖酶耐熱性的提升還存在一定發(fā)展空間，有望通過更加先進(jìn)的結(jié)構(gòu)技術(shù)進(jìn)一步深入和系統(tǒng)地研究，從而取得突破性進(jìn)展。