枯草芽孢桿菌芽孢皮層裂解酶CwlJ基因的克隆及酶生物信息學(xué)分析

馬慧嬌，曾朝瑋，郭洪偉，郭家俊，章 中*

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川750021）

細(xì)菌芽孢對殺菌處理的極端抗性，是造成食品安全問題和食品腐敗的重要原因[1]。芽孢極端抗性與其特有結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，其從外到里有七層結(jié)構(gòu)，分別是孢外壁、芽孢衣、外膜、皮層、細(xì)胞壁、內(nèi)膜、核心[2]。芽孢皮層是維持芽孢休眠狀態(tài)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，主要由肽聚糖構(gòu)成，是芽孢抗壓性的一層關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。在芽孢萌發(fā)而轉(zhuǎn)變成營養(yǎng)體的過程中，皮層裂解酶可將芽孢皮層水解，使得芽孢失去休眠特性[3-6]。皮層裂解酶是芽孢所特有的專一水解皮層肽聚糖的酶，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中有許多皮層裂解酶同系物的存在，CwlJ就是其中之一[7-8]。

高壓熱殺菌技術(shù)（high-pressure thermal sterilization，HPTS）是一種新興食品加工技術(shù)，該技術(shù)利用壓力和溫度的協(xié)同效應(yīng)，可有效殺滅芽孢，并較好地保持食品的營養(yǎng)和感官品質(zhì)[9-10]。前期研究發(fā)現(xiàn)HPTS下芽孢皮層肽聚糖發(fā)生了水解，有報道推測HPTS可能激活了皮層裂解酶而導(dǎo)致皮層肽聚糖水解[11-12]，那么證實(shí)推測并了解其水解機(jī)理就成為關(guān)鍵。

本研究對克隆所得的CwlJ基因采用美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）和ExPASy等網(wǎng)站中的各種信息分析工具，并結(jié)合DNAMAN軟件對其理化性質(zhì)、親/疏水性、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、可溶性等進(jìn)行生物信息預(yù)測和分析。該分析結(jié)果在揭示皮層裂解酶CwlJ結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的同時，也為后續(xù)皮層裂解酶CwlJ的表達(dá)、分離純化以及闡明HPTS下皮層肽聚糖水解機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 化學(xué)試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）As1.433：中國普通微生物菌種保藏管理中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC）；pET-28a（+）、DH5α：生工生物工程（上海）上海股份有限公司；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、核酸染料、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶：英國NEB公司；胰蛋白胨、酵母提取物：英國OXOID公司；瓊脂粉、氯化鈉：北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；卡那霉素：上海求德生物化工有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉5 g/L，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為7.0。LB固體培養(yǎng)基是在LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L的瓊脂粉。培養(yǎng)基的滅菌條件均為121 ℃、20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DSX-280B型高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LRH系列生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州潔凈技術(shù)研究所；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽：北京六一儀器廠；T100型梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel doc2000型凝膠成像儀：美國BIO-RAD公司；HH·SY21-Ni恒溫水浴器：北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 皮層裂解酶CwlJ基因的克隆

依據(jù)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProtKB中搜索到的來自Bacillus subtilis-P42249的皮層裂解酶CwlJ的氨基酸序列，通過NCBI序列比對獲得CwlJ的基因序列。由基因序列設(shè)計全長引物，其上游引物序列為YA0079-1N（5'-GACACCCATGGGCATGGCG-3）'；下游引物序列為YA0079-20N（5'-GTGTCCTCGAGAAATGTGTT-3）'（下劃線部分分別為限制性核酸內(nèi)切酶NcoI、XhoI的識別位點(diǎn)），按照95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性22 s，53 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，24個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行CwlJ全基因合成。合成產(chǎn)物CwlJ進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用回收試劑盒對目的條帶進(jìn)行切膠回收和純化。對質(zhì)粒pET-28a（+）和目的基因CwlJ同時使用NcoI和XhoI進(jìn)行雙酶切后用T4DNA連接酶于16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布在含100 g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，篩選陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并送至昆泰銳武漢生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行菌液測序。

1.3.2 皮層裂解酶CwlJ生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果經(jīng)translate工具轉(zhuǎn)換得到CwlJ基因編碼的蛋白序列，與蛋白數(shù)據(jù)庫中目標(biāo)序列比對后完全一致。利用ProtParam程序?qū)wlJ基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析；軟件SOPMA對皮層裂解酶CwlJ進(jìn)行螺旋卷曲分析；SWISS-MODEL對該酶進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測；DNAMAN軟件對該酶的親、疏水性和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行分析；TMHMM工具分析該酶是否有跨膜結(jié)構(gòu)；SignalP軟件分析該酶是否為分泌蛋白；TargetP工具對該酶進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測[13-14]；Harrison統(tǒng)計學(xué)模型預(yù)測該酶的可溶性。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮層裂解酶CwlJ基因的克隆

根據(jù)已知CwlJ氨基酸序列，合成目的基因CwlJ。合成產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。由圖1可知，所得產(chǎn)物大小約為450 bp，目的條帶上方出現(xiàn)的陰影可能是引物不特異或者退火溫度不合理等原因造成的。

圖1 CwlJ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Electrophoretogram of PCR amplification product of CwlJ gene

目的基因CwlJ克隆至質(zhì)粒pET-28a（+）后的雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖2。由圖2可知，顯示所切掉的片段和克隆序列大小一致，可確定CwlJ基因已經(jīng)插入質(zhì)粒pET-28a（+）中。

圖2 雙酶切鑒定結(jié)果Fig. 2 Results of double enzyme digestion identification

測序結(jié)果見圖3。由圖3可知，該克隆基因全長440 bp，與克隆序列一致，且開放閱讀框架正確。由此得出結(jié)論pET-28a（+）-CwlJ重組載體構(gòu)建成功[15]。

圖3 克隆基因CwlJ的測序峰圖Fig. 3 Sequencing peak map of cloned gene CwlJ

2.2 皮層裂解酶CwlJ生物信息學(xué)分析

2.2.1 皮層裂解酶CwlJ一級結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)分析

表1 皮層裂解酶CwlJ氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of cortex lytic enzyme CwlJ

運(yùn)用ProtParam程序在線分析芽孢皮層裂解酶CwlJ的理化特性，結(jié)果表明皮層裂解酶CwlJ的理論分子質(zhì)量為16.462 kDa，理論等電點(diǎn)為9.54，原子總數(shù)共2 276個，分子式為C731H1116N218O203S8；該酶的親水性平均系數(shù)（grand average of hydropathicity，GRAVY）值為-0.506，GRAVY值通常可以用來表征蛋白質(zhì)的親/疏水性，其范圍一般在-2～2之間，疏水蛋白的GRAVY 值為正值，親水蛋白的GRAVY值則為負(fù)值，所以皮層裂解酶CwlJ為親水蛋白；該酶的不穩(wěn)定系數(shù)為42.20，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)＞40時，蛋白不穩(wěn)定[16]，說明CwlJ為不穩(wěn)定蛋白；CwlJ共編碼142個氨基酸（見表1），其中含量最高的是丙氨酸（Ala）和精氨酸（Arg），共占氨基酸總含量的22.6%，含量最低的是色氨酸（Trp）和組氨酸（His），兩種氨基酸所占比例相同，各為2.1%，帶負(fù)電的氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為13個，帶正電的氨基酸殘基的總數(shù)（Arg+Lys）是20個。

2.2.2 皮層裂解酶CwlJ的二級結(jié)構(gòu)分析

軟件SOPMA可以正確預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占26.06%，β-折疊占21.83%，β-轉(zhuǎn)角占4.93%，無規(guī)則卷曲占47.18%。

圖4 皮層裂解酶CwlJ二級結(jié)構(gòu)分析Fig. 4 Analysis of secondary structure of cortex lytic enzyme CwlJ

2.2.3 皮層裂解酶CwlJ的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

SWISS-MODEL建模預(yù)測所得皮層裂解酶CwlJ三級結(jié)構(gòu)圖見圖5。

圖5 皮層裂解酶CwlJ三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 5 Prediction of tertiary structure of cortex lytic enzyme CwlJ

2.2.4 皮層裂解酶CwlJ的親/疏水性分析

采用DNAMAN 程序軟件分析皮層裂解酶CwlJ的親、疏水性，結(jié)果見圖6。由圖6可知，皮層裂解酶CwlJ的親、疏水性分值越高表明疏水性越強(qiáng)，分值越低表明親水性越強(qiáng)。分析結(jié)果顯示疏水性最強(qiáng)的區(qū)域?yàn)榈?0～35個氨基酸附近，親水性最強(qiáng)的區(qū)域?yàn)榈?5～104個氨基酸附近，經(jīng)預(yù)測該酶的氨基酸大多都是親水性較強(qiáng)，這也進(jìn)一步證實(shí)了ProtParam程序預(yù)測該酶為親水蛋白的結(jié)果。

圖6 皮層裂解酶CwlJ的氨基酸疏水性（A）和親水性（B）分析Fig. 6 Hydrophobicity (A) and hydrophilicity (B) analysis of amino acid of cortex lytic enzyme CwlJ

2.2.5 皮層裂解酶CwlJ的跨膜區(qū)分析

借助Expasy中的TMHMM工具對蛋白是否含膜蛋白進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果見圖7。

圖7 皮層裂解酶CwlJ的跨膜區(qū)預(yù)測Fig. 7 Prediction of transmembrane region of cortex lytic enzyme CwlJ

由圖7可知，蛋白質(zhì)序列的長度為142，預(yù)測的跨膜螺旋數(shù)為0；預(yù)期的膜內(nèi)螺旋氨基酸數(shù)量為0.006 44；蛋白質(zhì)的前60個氨基酸跨膜螺旋中預(yù)期的氨基酸數(shù)量為0.002 08；蛋白質(zhì)N端在細(xì)胞膜內(nèi)的可能性為0.340 59。如果outside與inside兩條線存在相交，則相交的部分為跨膜區(qū)。圖中這兩條線是平行不相交的，因此不存在跨膜區(qū)。通常預(yù)期的膜內(nèi)螺旋氨基酸數(shù)量如果數(shù)目＞18，則很可能該酶是跨膜蛋白，但本研究結(jié)果0.006 44明顯＜18，所以該酶無跨膜區(qū)，說明該酶不可能作為膜受體起作用，也不可能是膜錨定蛋白或離子通道蛋白。

2.2.6 皮層裂解酶CwlJ的信號肽分析

應(yīng)用SignalP預(yù)測CwlJ編碼的氨基酸序列中是否存在信號肽[17-18]。根據(jù)預(yù)測的蛋白質(zhì)來源選擇革蘭氏陽性菌。結(jié)果見圖8。

圖8 皮層裂解酶CwlJ的信號肽分析Fig. 8 Signal peptide analysis of cortex lytic enzyme CwlJ

由圖8可知，S-mean是從N端氨基酸開始到剪切位點(diǎn)處各氨基酸的平均值；D值是S-mean和Y-max的平均值，其對區(qū)分是否為分泌蛋白具有重要作用，對于非分泌蛋白，該行輸出的分?jǐn)?shù)值非常低（接近目標(biāo)值0.1）。預(yù)測結(jié)果中，信號肽（SP）結(jié)果為No，且D值非常接近0.1，說明CwlJ沒有信號肽，且不是分泌蛋白。

2.2.7 皮層裂解酶CwlJ的亞細(xì)胞定位

通過TargetP工具對CwlJ進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。結(jié)果見表2。

表2 亞細(xì)胞定位預(yù)測Table 2 Subcellular location prediction

由表2可知，mTP值越接近1.0，表明蛋白質(zhì)位于線粒體的可能性越大；SP值越接近1.0，表明有信號肽。其他表明蛋白很有可能位于其他地方。除此之外，其數(shù)值范圍從1到5，其中RC值越小，說明預(yù)測的可靠性越高，本次預(yù)測RC值為2，表明可靠性相對較高。結(jié)果表明，CwlJ位于線粒體的可能性僅為11.5%，位于其他地方的可能性更大，具體定位地方不確定，且含有信號肽的可能性極低，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了2.2.6的預(yù)測結(jié)果。

2.2.8 皮層裂解酶CwlJ重組蛋白的可溶性分析

參照WILKINSON D L等[19]兩參數(shù)預(yù)測模型，預(yù)測重組蛋白的可溶性。判斷的標(biāo)準(zhǔn)值（criterion of values，CV）及概率（probability，P）計算公式如下：

式中：CV 為判斷的標(biāo)準(zhǔn)值；CV'為校準(zhǔn)值，其為1.71；N、P、G、S、R、K、D、E分別代表天門冬酰胺、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、精氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸的數(shù)量，個；n代表CwlJ序列中全部氨基酸殘基的數(shù)量，個。

CV-CV'值可用來判斷CwlJ基因在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)的傾向。如果CV-CV'＜0，則該基因有可溶性表達(dá)的傾向；如果CV-CV'＞0，則該基因在表達(dá)時更傾向于形成包涵體；CV-CV'的絕對值越大，傾向性越明顯[20]?？扇苄裕ɑ虿豢扇苄裕㏄則是在體現(xiàn)該可能性的大小。通過計算，該酶中CV-CV'值約為0.76＞0，表明CwlJ基因在表達(dá)時易形成包涵體，且其概率P為68.11%，預(yù)測重組蛋白可溶性可能性較大。

2.2.9 來自不同菌種的皮層裂解酶CwlJ的系統(tǒng)進(jìn)化分析

用DNAMAN軟件對來自不同菌的皮層裂解酶CwlJ構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行同源序列聚類分析，結(jié)果見圖9。

圖9 皮層裂解酶CwlJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 9 Phylogenetic tree of cortex lytic enzyme CwlJ

由圖9可知，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）皮層裂解酶CwlJ與蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）CwlJ、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）Bt18247 CwlJ處于同一個小分支，表明在進(jìn)化過程中距離最近，親緣關(guān)系最為密切；與蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）CwlJ、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）CwlJ、炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）CwlJ、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）CwlJ、類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.P22）CwlJ同屬一個大分支，表明其具有較高的同源性，反之則親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論

通過克隆得到基因CwlJ，其編碼142個氨基酸，基因全長為440 bp。而且測序和雙酶切結(jié)果均表明重組表達(dá)載體pET-28（+）-CwlJ構(gòu)建成功，為后期表達(dá)純化CwlJ奠定了基礎(chǔ)。

生物信息學(xué)各軟件分析結(jié)果表明：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）皮層裂解酶CwlJ是一個分子量大小為16.462 kDa，親水性的堿性不穩(wěn)定蛋白；二級結(jié)構(gòu)分析表明α-螺旋占26.06%，β-延伸鏈占21.83%，β-轉(zhuǎn)角占4.93%，無規(guī)則卷曲占47.18%；DNAMAN 程序分析得該酶多以親水性氨基酸存在，為親水蛋白；TMHMM程序分析得CwlJ不是分泌性蛋白；亞細(xì)胞定位顯示在所預(yù)測范圍內(nèi)存在的可能性較小，可能位于其他地方；可溶性預(yù)測分析得知表達(dá)的酶蛋白傾向于形成包涵體，可能性為68.11%；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）皮層裂解酶CwlJ與蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）皮層裂解酶CwlJ、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）Bt18247皮層裂解酶CwlJ親緣關(guān)系較近。

克隆表達(dá)載體pET-28a（+）-CwlJ構(gòu)建成功，且通過生物信息學(xué)分析，了解了皮層裂解酶CwlJ的組成和結(jié)構(gòu)特性，為后續(xù)皮層裂解酶CwlJ大批量異源表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)與功能的研究提供了參考信息。