不同物理誘變方式對休哈塔假絲酵母產(chǎn)乙醇的影響

張云野，王軼男，凌宏志，宋 剛，平文祥，葛菁萍*

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱150080；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150080）

木糖的乙醇發(fā)酵是木質(zhì)纖維原料生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇的重要因素。以農(nóng)作物秸稈等農(nóng)業(yè)殘留物為代表的天然木質(zhì)纖維素原料中，木糖含量占很大比重，部分微生物可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。因此選育乙醇產(chǎn)量大的菌種，有助于農(nóng)業(yè)殘留物的回收利用并改善環(huán)境。

能利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的少數(shù)菌種包括休哈塔假絲酵母（Candida albicans），黃達明等[1]分別選取木糖、玉米秸稈和葡萄糖對Candida albicans進行單底物發(fā)酵，30 ℃發(fā)酵48 h后乙醇含量分別為15.35 g/L、12.38 g/L和21.06 g/L。江楓等[2]共培養(yǎng)Candida albicans及Saccharomyces cerevisiae，并對混合菌固定包埋；葡萄糖及木糖混合物為底物、30 ℃發(fā)酵24 h后的乙醇含量為14.89 g/L。李晴等[3]同樣共培養(yǎng)Candida albicans及Saccharomyces cerevisiae，葡萄糖及木糖混合物為底物、30 ℃發(fā)酵24 h后的乙醇含量為21.84 g/L。蔣發(fā)現(xiàn)等[4]在以葡萄糖及木糖混合物為底物的Candida albicans發(fā)酵培養(yǎng)基中添加玉米秸稈烯酸處理液，30 ℃發(fā)酵36 h后乙醇含量為22.5 g/L。余學(xué)軍等[5]以竹粉酶解液作為Candida albicans發(fā)酵底物，最優(yōu)發(fā)酵條件下，發(fā)酵60 h后的乙醇含量為11.56 g/L。余恒等[6]以甘蔗渣漿酶解液作為Candida albicans的發(fā)酵底物，30℃發(fā)酵18 h后的乙醇含量為22.98g/L。劉紅梅[7]以蔗糖渣酶水解液作為酵母菌發(fā)酵底物，Candida albicans在30 ℃發(fā)酵48 h后的乙醇含量為15.15 g/L，較Pichia stipits高78.24%。

休哈塔假絲酵母（Candida albicans）HDYXHT-01利用80 g/L木糖在30 ℃條件下發(fā)酵48 h，最多可得15.31 g/L乙醇。該菌株發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇能力有待加強，這就需要對菌株進行改造。物理誘變因操作簡單、易于環(huán)保及對人體傷害小等優(yōu)點得到廣泛應(yīng)用。物理誘變中常用的誘變方式是紫外線誘變，紫外線會使生物體DNA中兩個相鄰的嘧啶共價連接，形成嘧啶二聚體[8-9]。二聚體的出現(xiàn)會導(dǎo)致生物體DNA中堿基的非正常配對，從而導(dǎo)致突變。He-Ne激光誘變具有穩(wěn)定性好、無污染等優(yōu)點，因此也作為物理誘變方式之一[10]，低頻氦（He）-氖（Ne）激光照射微生物細胞，可使細胞發(fā)生形態(tài)及生理水平的改變[11]；段良和等[12]對Saccharomyces cerevisiae進行He-Ne激光誘變，篩得1株乙醇高產(chǎn)突變株，其乙醇產(chǎn)量較對照株提高7.40%。微波作為低頻電磁波，場力和轉(zhuǎn)化能的協(xié)同作用導(dǎo)致生物體突變是其作用機理。電磁波作用于生物體能夠產(chǎn)生強烈的生物響應(yīng)，導(dǎo)致生物體生理生化功能發(fā)生變化[13-15]。三種物理誘變方式從不同角度改變待測菌株的基因組成。因此，本研究利用3種誘變（紫外線、He-Ne激光和微波）方式，分別對出發(fā)菌株HDYXHT-01進行誘變，目的在于獲得高產(chǎn)乙醇菌株，并結(jié)合試驗結(jié)果比較不同物理誘變方式對修哈塔假絲酵母產(chǎn)乙醇的影響，最終確定出最佳物理誘變因子。為提高工作效率并進一步對菌株進行改良工作奠定基礎(chǔ)，同時對于將農(nóng)作物秸稈等農(nóng)業(yè)殘留物轉(zhuǎn)化為燃料乙醇具有重要的實際應(yīng)用及節(jié)能環(huán)保價值[16]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

休哈塔假絲酵母（Candida albicans）HDYXHT-01：由黑龍江大學(xué)微生物重點實驗室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

木糖（純度99%）：七臺河市美化木糖有限責(zé)任公司；酵母粉、蛋白胨（均為生化試劑）、磷酸二氫鉀（分析純）、（NH4）2SO4（分析純）、MgSO4·7H2O（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）：北京索萊寶科技有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：上海生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子液培養(yǎng)基：木糖10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，蒸餾水500 mL。

木糖發(fā)酵培養(yǎng)基[17]：木糖40 g/L，酵母粉2.5 g/L，磷酸二氫鉀1.34 g/L，（NH）42SO40.18 g/L，MgSO·47H2O 0.05 g/L，pH 4.8，蒸餾水500 mL。TTC下層培養(yǎng)基：木糖15 g/L，酵母粉2.5 g/L，磷酸二氫鉀1.34 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，（NH4）2SO40.18 g/L，瓊脂10 g/L，pH 4.8，蒸餾水500 mL。

TTC上層培養(yǎng)基：木糖0.25 g，TTC 0.025 g，瓊脂0.75 g，蒸餾水500 mL。

上述培養(yǎng)基均在108 ℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基均添加2%瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

JT-150 雙人超凈工作臺：沈陽醫(yī)用凈化設(shè)備廠；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：日本SANYO 公司；ZHWY-211C 全溫度恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；Beckman Coulter AllegarRX-15R 離心機：德國Bechman 公司；HH·Ⅱ420-S 恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；HPX-87H 色譜柱：美國BIO-RAD公司：SCL-10A 高效液相色譜：日本島津公司；He-Ne激光器：黑龍江大學(xué)電子工程學(xué)院自制。

1.3 方法

1.3.1 菌種及種子液的制備

菌種活化：接種環(huán)挑取4 ℃保藏的斜面菌種并轉(zhuǎn)接于種子液斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

種子液的制備：活化好的斜面菌種，接于種子液液體培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，于30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：種子液以10%接種量接于木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為80mL/250mL，于30℃、160r/min振蕩培養(yǎng)48h。

1.3.2 突變株產(chǎn)乙醇能力分析方法

（1）分析方法

發(fā)酵液中乙醇及木糖含量采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測[18-19]。取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，3 500 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液用無菌水稀釋100倍后，取1 mL樣本用于HPLC進樣測定，乙醇出峰時間為16.26min，木糖出峰時間為7.06min。測定結(jié)果需要換算成未稀釋發(fā)酵液成分含量。

HPLC條件：HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm），樣品上樣量20 μL，0.005 mol/L H2SO4作為流動相，流速0.8 mL/min，色譜柱、示差檢測器溫度分別為：65 ℃、40 ℃，分析時間20 min。

（2）物質(zhì)含量計算公式

式中：y1為乙醇含量，g/L；x1為乙醇峰面積；y2為木糖含量，g/L；x2為木糖峰面積；y3為乙醇得率，g/g；y4為木糖利用率，%。

1.3.3 誘變試驗方法

菌懸液制備：取50 mL對數(shù)生長中期的菌液3 500 r/min離心20 min，無菌0.9%NaCl溶液洗滌并重懸菌體，制成濃度為107個/mL的菌懸液。

（1）紫外誘變

在無菌條件下取3 mL菌懸液于直徑6 cm且放入無菌大頭針的無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿開蓋并置于磁力攪拌器上，15 W紫外燈下30 cm處放置磁力攪拌器。開啟磁力攪拌器并開始誘變。誘變時間梯度為0、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s。

（2）He-Ne 激光誘變

取1.5 mL菌懸液于離心管中，3 500 r/min離心20 min后，距離He-Ne激光誘變儀30 cm進行照射，誘變儀功率恒定為15W。照射時間梯度為0、10min、20min、30min、60min、90 min、120 min。

（3）微波誘變

在無菌試管中加入5 mL制備好的菌懸液，將其放入裝有蒸餾水的燒杯中，保證燒杯中的水位沒過試管中菌懸液的刻度。置于微波處理器（功率800 W、頻率2 450 MHz）中，處理時間梯度為0、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s、140 s、160 s。

誘變后的菌液，采用10倍稀釋法用無菌0.9%NaCl溶液稀釋至10-3，取該梯度的菌液100 μL涂布于種子培養(yǎng)基平板上（每個時間點做3組平行試驗），置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，統(tǒng)計平板上長出的菌落個數(shù)，計算致死率（紫外線誘變后的該步操作在避光條件下進行，避免光復(fù)活）。各物理誘變方式中正突變率最高的誘變時間確定為最適誘變時間。

1.3.4 突變株的篩選方法

初篩：采用TTC作為出發(fā)菌株產(chǎn)乙醇能力的顯色劑，待平板長出菌落后，將10 mL TTC上層培養(yǎng)基傾倒在其上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h[20]。挑取深紅色且菌落較大的突變菌株進行突變株復(fù)篩。

復(fù)篩：對初篩得到的突變株按1.3.1的方法進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵液3 500 r/min、4 ℃離心20 min后，稀釋100倍的上清液用于HPLC檢測乙醇及木糖含量。選擇乙醇含量及木糖利用率均較高的突變株作為目的菌株。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析按Duncan's新復(fù)極差檢測進行數(shù)據(jù)分析，不同字母表示處理間差異顯著；“*”代表t檢驗表明試驗組與對照組之間的差異顯著（P＜0.05），“**”代表t檢驗表明試驗組與對照組之間的差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變

不同紫外線誘變時間對菌株HDYXHT-01致死率的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，該菌株致死率隨紫外線照射時間的延長漸漸升高，在誘變30 s、60 s時菌株致死率分別為51.91%、89.82%，70～80 s時菌株致死率接近100%。

圖1 不同紫外線誘變時間對菌株HDYXHT-01致死率的影響Fig. 1 Effect of different ultraviolet mutagensis time on lethal rate of strain HDYXHT-01

不同紫外線誘變時間對菌株HDYXHT-01誘變效應(yīng)的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，誘變30～50 s過程中，正突變率漸漸加大，50 s時正突變率最大，為6.62%，50 s后突變株正突變率呈下降趨勢，70 s后正突變率為0。因此，確定紫外線對菌株HDYXHT-01的最佳誘變時間為50 s。

圖2 不同紫外線誘變時間對菌株HDYXHT-01誘變效應(yīng)的影響Fig. 2 Effect of different ultraviolet mutagenesis time on mutagenic effect of strain HDYXHT-01

圖3 不同紫外線誘變突變株的木糖利用率Fig. 3 Xylose utilization rate of different ultraviolet mutants

不同紫外線突變株的木糖利用率結(jié)果見圖3。由圖3可知，紫外線突變株的木糖利用率均有下降，下降范圍為0.38%～11.12%。

圖4 不同紫外線誘變突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）Fig. 4 Ethanol production (A) and yield (B) of different UV mutants

不同紫外線突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）結(jié)果見圖4。由圖4可知，紫外線突變株的乙醇產(chǎn)量及乙醇得率均有不同程度的上升，乙醇產(chǎn)量上升范圍在3.03%～12.88%，乙醇得率上升范圍在5.05%～20.09%。分析造成這種現(xiàn)象的原因是與Candida albicans代謝木糖產(chǎn)乙醇路徑中的關(guān)鍵酶酶活發(fā)生變化有關(guān)。木糖還原酶（xylosereduetase，XR）及木糖醇脫氫酶（xylitol dehydrogenase，XDH）被認為是Candida albicans木糖代謝途徑的兩種關(guān)鍵酶[21]。丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC）及乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）被認為是Candida albicans乙醇生成途徑的兩種關(guān)鍵酶。本試驗中，紫外線突變株的木糖利用率均有下降，表明突變菌株代謝木糖的能力減弱，進一步推測紫外線可能對Candida albicans木糖代謝途徑的兩種關(guān)鍵酶酶活具有削弱作用；紫外線突變株的乙醇產(chǎn)量及乙醇得率均有不同程度的上升，表明突變菌株生成乙醇能力加強，進一步推測紫外線可能對Candida albicans乙醇生成路徑中的兩種關(guān)鍵酶酶活具有增強作用。其中菌株ZW-6的乙醇產(chǎn)量最大，達9.29 g/L，乙醇得率為0.239 8 g/g，較原始菌株HDYXHT-01分別提高12.88%和17.78%。

2.2 He-Ne激光誘變

不同He-Ne激光誘變時間對HDYXHT-01致死率的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，前30 min內(nèi)誘變對菌株的致死效應(yīng)逐漸增大，致死率逐漸提高，由32.12%上升至46.36%。誘變30 min后，致死率減小，表明菌體恢復(fù)生長。隨著激光照射時間加長，原始菌株細胞恢復(fù)生長效果越發(fā)明顯，誘變90 min后致死率為負值，隨著照射時間進一步加長，原始菌株生長繁殖再次受到抑制，誘變120 min時致死率為-33.61%。結(jié)果表明，He-Ne激光可影響原始菌株的生理活性，加快或抑制其生長繁殖。

圖5 不同He-Ne激光誘變時間對HDYXHT-01致死率的影響Fig. 5 Effect of different He-Ne laser mutagenic time on lethal rate of strain HDYXHT-01

不同He-Ne激光誘變時間對HDYXHT-01誘變效應(yīng)的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，誘變前60 min，正突變率均較高，誘變10 min時正突變率為48.62%，誘變30 min時正突變率為37.61%，誘變60 min時正突變率為24.45%。由此可見，在He-Ne激光誘變的過程中，突變菌株正突變率普遍較高，可能是Candida albicans細胞內(nèi)乙醇生成路徑中關(guān)鍵酶的生理活性與激光劑量直接相關(guān)。

圖6 不同He-Ne激光誘變時間對HDYXHT-01誘變效應(yīng)的影響Fig. 6 Effect of different He-Ne laser mutagenesis time on mutagenic effects of strain HDYXHT-01

不同He-Ne激光誘變突變株的木糖利用率結(jié)果見圖7。由圖7可知，He-Ne激光誘變突變株，木糖利用率均有上升，上升范圍為1.69%～44.77%。表明突變株的木糖代謝能力增強，進一步推測造成這種現(xiàn)象的原因可能是He-Ne激光對原始菌株木糖代謝途徑的兩種關(guān)鍵酶酶活具有增強作用。

圖7 不同He-Ne激光誘變突變株的木糖利用率Fig. 7 Xylose utilization rate of different He-Ne laser mutagenized mutants

不同He-Ne激光誘變突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）結(jié)果見圖8。

圖8 不同He-Ne激光誘變突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）Fig. 8 Ethanol production (A) and yield (B) of different He-Ne laser mutagenized mutants

由圖8可知，突變菌株的乙醇產(chǎn)量及乙醇得率均有提高。提高最多的為菌株HN-3，乙醇產(chǎn)量達17.34 g/L，乙醇得率為0.351 8 g/g，較原始菌株分別提高39.61%和44.75%。

2.3 微波誘變

不同微波誘變處理時間對HDYXHT-01致死率的影響結(jié)果見圖9。由圖9可知，該菌株致死率隨誘變時間的增長漸漸加大。誘變40 s時致死率為44.94%，誘變80 s時致死率達67.29%；誘變140 s后致死率上升幅度減小且接近100%。

圖9 不同微波誘變處理時間對HDYXHT-01致死率的影響Fig. 9 Effect of different microwave mutagenesis time on lethal rate of strain HDYXHT-01

不同微波誘變時間對HDYXHT-01誘變效應(yīng)的影響結(jié)果見圖10。由圖10可知，誘變40～100 s過程中，正突變率漸漸加大，100 s時正突變率最大為20.44%。100 s后正突變率呈下降趨勢，160 s時正突變率達到最低為3.03%。因此，確定微波對菌株HDYXHT-01的最佳誘變時間為100 s。

圖10 不同微波誘變時間對HDYXHT-01誘變效應(yīng)的影響Fig. 10 Effect of different microwave mutagenesis time on mutagenic effects of strain HDYXHT-01

不同微波誘變突變株的木糖利用率結(jié)果見圖11。由圖11可知，相比于原始菌株，就木糖利用率而言，菌株WB-4、WB-6、WB-7分別提高3.43%、2.15%、3.61%；其余6株微波突變菌株木糖利用率均有下降，下降范圍在3.11%～15.19%。

不同微波誘變突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）結(jié)果見圖12。

圖11 不同微波誘變突變株的木糖利用率Fig. 11 Xylose utilization rate of different microwave mutagenized mutants

圖12 不同微波誘變突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）Fig. 12 Ethanol production (A) and yield (B) of different microwave mutagenized mutants

由圖12可知，就乙醇產(chǎn)量而言，除菌株WB-8乙醇產(chǎn)量下降3.01%外其余突變株均有提高，范圍在2.94%～11.31%，進一步推測造成這些現(xiàn)象的原因是微波可能對出發(fā)菌株木糖代謝途徑及乙醇生成路徑中的幾種關(guān)鍵酶酶活的增強或削弱作用具有隨機性，其中WB-3的乙醇產(chǎn)量最高，達17.03 g/L，較原始菌株提高11.31%；就乙醇得率而言，各突變株的乙醇得率均有提高，范圍在0.74%～20.36%。

3 幾種物理誘變方法的比較

不同突變株的木糖利用率結(jié)果見圖13。由圖13可知，菌株HN-3的木糖利用率較原始菌株提高0.13%，菌株ZW-6、WB-3的木糖利用率分別較原始菌株降低1.92%、0.97%。不同突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）結(jié)果見圖14。

圖13 不同突變株的木糖利用率Fig. 13 Xylose utilization rate of different mutants

由圖14可知，菌株ZW-6、HN-3、WB-2的乙醇產(chǎn)量及得率均有不同程度的上升。菌株ZW-6、HN-3、WB-2的乙醇產(chǎn)量分別為17.44 g/L、18.49 g/L、18.11 g/L，分別較原始菌株提高13.91%、20.77%、18.29%；菌株ZW-6、HN-3、WB-2的乙醇得率分別為0.353 7 g/g、0.382 8 g/g、0.371 4 g/g，分別較原始菌株提高13.80%、23.17%、19.50%。

4 結(jié)論

本研究以休哈塔假絲酵母（Candida albicans）HDYXHT-01作為出發(fā)菌株，采用紫外線、He-Ne激光、微波三種不同的物理誘變方式對其進行誘變，目的在于選育高產(chǎn)乙醇菌株的同時確定最佳的物理誘變因子。結(jié)果表明，與紫外線及微波各誘變菌株相比，He-Ne激光誘變菌株的正突變率高，激光照射10 min時，正突變率高達48.62%；He-Ne激光誘變菌株的木糖利用率、乙醇產(chǎn)量、乙醇得率均提高最多，提高的范圍最大，分別較原始菌株提高1.69%～44.77%、13.12%～40.59%、29.73%～47.75%。因此，確定He-Ne激光為最佳物理誘變因子。最佳物理誘變因子的確定為提高科研工作效率及進一步對菌株進行改造工作奠定基礎(chǔ)；木糖利用率及乙醇產(chǎn)量高的突變菌株的獲得，在為利用休哈塔假絲酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙醇提供數(shù)據(jù)參考的同時，有助于農(nóng)業(yè)殘留物的回收利用做到節(jié)能減排，并具有一定意義的環(huán)保價值。