恩施市3種泡辣椒樣品中細(xì)菌多樣性研究

尚雪嬌，折米娜，鄧長(zhǎng)陽(yáng)，廖 華，趙 楠，郭 壯，4*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽(yáng)441053；2.恩施市農(nóng)業(yè)局，湖北 恩施445000；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都610066；4.恩施市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北 恩施445000）

泡辣椒是一種流行于四川、湖南和貴州等地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒產(chǎn)品[1]，其主要利用辣椒表面附著的微生物自然發(fā)酵而成[2]。由于傳統(tǒng)發(fā)酵食品制作環(huán)境開放，使得各類產(chǎn)品中的微生物具有多樣性[3]。鐘燕青[4]研究發(fā)現(xiàn)，湖南地區(qū)自然發(fā)酵剁辣椒中的乳酸菌主要為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和短乳桿菌（Lactobacillus breris），同時(shí)沙漠等[5]從自然發(fā)酵的辣椒醬中分離出兩株產(chǎn)酸量高、生長(zhǎng)良好且適用于發(fā)酵辣椒試驗(yàn)的菌株，分別為L(zhǎng).plantarum和腸膜串球菌（Streptococcus faecalis）。周俊良[6]在貴州地區(qū)市售泡辣椒和農(nóng)家自制醬辣椒產(chǎn)品中篩選出4株適用于發(fā)酵辣椒制品制作的乳酸菌，分別為雙發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus bifermentans）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）和食果糖乳桿菌（Lactobacillus fructivorans），然而關(guān)于湖北恩施地區(qū)泡辣椒中微生物多樣性的研究報(bào)道尚少。

相對(duì)于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方式，Illumina MiSeq第二代高通量測(cè)序技術(shù)可以獲得不同環(huán)境條件下微生物的群落結(jié)構(gòu)，不僅能夠檢測(cè)到低豐度的微生物，而且具有很高的可信度和準(zhǔn)確度[7]。同時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）是一種新型且不依賴于培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)，其可以直接提取微生物的宏基因組，通過(guò)電泳圖來(lái)檢測(cè)和鑒定自然環(huán)境或人工環(huán)境中微生物的種類[8]。Illumina MiSeq技術(shù)和PCR-DGGE技術(shù)改善了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法中耗時(shí)長(zhǎng)和工作量大等缺點(diǎn)，同時(shí)具有快速和簡(jiǎn)便且重復(fù)性好的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品[9-10]、肉制品[11-12]、腸道[13-14]和土壤[15-16]微生態(tài)研究等領(lǐng)域。

因此，本研究采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)與PCR-DGGE技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)恩施地區(qū)3種泡辣椒中微生物的多樣性進(jìn)行解析，同時(shí)利用傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)方法及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其中所含的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定。以期全面解析恩施市傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒中細(xì)菌的多樣性，同時(shí)對(duì)恩施地區(qū)發(fā)酵食品中乳酸菌的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

3種泡辣椒樣品（編號(hào)分別為L(zhǎng)JS01、LJS02和LJS03，泡制時(shí)間均在30 d左右）：采購(gòu)于恩施市土橋壩菜市場(chǎng)。

1.1.2 試劑

三羥甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、聚丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺、N,N-亞甲基二丙烯酰胺（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；D5625-01脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DNA marker、PCR清潔試劑盒：京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；2PCR×mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq酶（5 U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix、pMD18-T vector：大連寶生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）Top10感受態(tài)細(xì)胞：鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所自制；PCR引物合成由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成，引物信息如表1所示。

表1 本實(shí)驗(yàn)采用的引物信息Table 1 Information of primers used in the experiment

1.2 儀器與設(shè)備

MiSeq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；R930機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)DELL公司；CT15RE冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；VeritiTM96-well thermal cycler PCR儀：美國(guó)AB公司；NanoDrop 2000/2000c超微量分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Fisher公司；DCodeTMSystem：美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；Bio-5000 plus掃描儀：上海中晶科技有限公司；DG250厭氧工作站：英國(guó)DWS公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 泡辣椒樣品宏基因組提取與檢測(cè)

采用OMEGA D5625-01試劑盒提取3種泡辣椒樣品的宏基因組，采用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)并用NanoDrop超微量分光光度計(jì)測(cè)定其DNA的濃度。

1.3.2 泡辣椒樣品細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增及MiSeq高通量測(cè)序

參照沈馨等[17]的方法對(duì)泡辣椒樣品中細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及MiSeq高通量測(cè)序。PCR擴(kuò)增體系：5×PCR緩沖液4.0 μL，dNTP mix 2.0 μL，正反向引物338F/806

R各0.8 μL，rTaq酶0.4 μL，DNA模板10 ng，無(wú)菌超純水補(bǔ)充至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共30次循環(huán)；72℃再延伸10min。其擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后將濃度稀釋至100 nmol/L，寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行MiSeq高通量測(cè)序。

1.3.3 序列拼接及質(zhì)量控制

參照周書楠等[18-19]的方法，根據(jù)成對(duì)序列之間的重疊關(guān)系，將雙端序列拼接成一條序列；其次根據(jù)barcode將所有序列劃分到各個(gè)樣品并對(duì)序列方向進(jìn)行校正，最后切除序列的barcode和引物。使用QIIME v1.7.0分析平臺(tái)對(duì)拼接及質(zhì)控成功的序列進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分和物種鑒定（包括界、門、綱、目、科和屬水平），并計(jì)算各分類單元的相對(duì)含量。

1.3.4 泡辣椒中乳酸桿菌多樣性解析

對(duì)乳酸桿菌的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP 2.0 μL，正向引物（LacF-GC）、反向引物（LacR）和rTaq各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，無(wú)菌超純水補(bǔ)充至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

使用8%聚丙烯酰胺凝膠、變性劑梯度為35%～52%的變性劑（尿素和去離子甲酰胺）進(jìn)行DGGE。電泳溫度為60 ℃，電泳緩沖液為0.5×TAE，上樣量為10 μL，120 V條件下運(yùn)行80 min后，80 V條件下運(yùn)行13 h。電泳結(jié)束后，對(duì)凝膠進(jìn)行硝酸銀染色，對(duì)DGGE圖進(jìn)行觀察、掃描、拍照并找出優(yōu)勢(shì)條帶切膠回收。回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用不含GC夾子的引物L(fēng)acF和LacR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系及條件與上述方法相同。將清潔的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化到E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)單克隆鑒定合格后送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果除去兩端載體的序列，然后使用BioEdit軟件進(jìn)行拼接，拼接后在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）進(jìn)行同源性比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株，采用MEGA 5.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 泡辣椒中乳酸菌的分離與鑒定

將泡辣椒樣品進(jìn)行倍比稀釋并涂布于含有1.0%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取有透明圈的單菌落進(jìn)行純化、革蘭氏染色和保藏。采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法[20]提取各菌株的DNA，以其為模板進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增。在張魯冀等[21]的方法上稍作修改，PCR擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP 2.0 μL，正向引物（27F）、反向引物（1495R）、rTaq酶和DNA模板各0.5 μL，無(wú)菌超純水補(bǔ)充至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將清潔的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照方法1.3.4處理并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行拼接和比對(duì)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Origin 8.5軟件對(duì)平均相對(duì)含量＞1.0%的細(xì)菌屬進(jìn)行柱狀圖的繪制，維恩（Venn）圖由在線網(wǎng)站（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進(jìn)行繪制。利用BioEdit軟件和MEGA 5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)泡辣椒細(xì)菌多樣性的研究

3種泡辣椒樣品中共產(chǎn)生了131 480條16S rRNA高質(zhì)量序列，平均每種樣品產(chǎn)生43 826 條16S rRNA高質(zhì)量序列。根據(jù)100%的相似性進(jìn)行序列劃分共得到78 050條代表性序列，根據(jù)序列的97%相似性進(jìn)行OTU劃分后，共得到8 879個(gè)OTU，每種樣品平均得到2 959個(gè)OTU。使用Ribosomal Database Projec（tRDP）和Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，將所有的序列鑒定為10個(gè)門、18個(gè)綱、42個(gè)目、82個(gè)科和177個(gè)屬。

在門水平上，3種泡辣椒樣品中平均相對(duì)含量＞1.0%的細(xì)菌門分別為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對(duì)含量分別為85.70%和12.59%。在屬水平上，有10.88%的序列不能被鑒定，其中平均相對(duì)含量＞1.0%的屬如圖1所示。

由圖1可知，泡辣椒樣品中平均相對(duì)含量＞1.0%的屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和明串球菌屬（Leuconostoc），其平均相對(duì)含量分別為67.37%、7.69%、1.99%、1.16%、1.08%和1.02%。由此可知，隸屬于Firmicutes的Lactobacillus為泡辣椒中的優(yōu)勢(shì)屬。利用MiSeq高通量測(cè)序方法，韓俊燕等[20]對(duì)發(fā)酵辣椒中微生物多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Firmicutes為所有樣品的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，其含量＞50%，進(jìn)一步研究得知，Lactobacillus和Weissella為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。JUNG J Y等[22]使用454 GS FLX Titanium測(cè)序系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)韓國(guó)泡菜中主要的細(xì)菌屬為L(zhǎng)euconostoc、Lactobacillus和Weissella。

圖1 泡辣椒樣品中平均相對(duì)含量＞1.0%的細(xì)菌屬Fig. 1 Bacterial genera with average relative abundance more than 1.0% in the pickled chili samples

在OTU水平上，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)OTU在3種泡辣椒樣品中出現(xiàn)的頻率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 基于OTU水平的Venn圖Fig. 2 Venn diagram based on OTU level

由圖2可知，3種泡辣椒樣品中共有23個(gè)核心OTU，僅占OTU總數(shù)的0.2%，但包含了95 978條序列，占總序列數(shù)的73.0%。在23個(gè)核心OUT中，8個(gè)核心OTU在3種泡辣椒樣品中的平均相對(duì)含量＞1.0%，分別為OTU1140、OTU2282、OTU3351、OTU7763、OTU326、OTU227、OTU5266和OTU 7746。進(jìn)一步構(gòu)建了8個(gè)核心OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。

圖3 泡辣椒樣品中平均相對(duì)含量＞1.0%核心OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of core OTU with average relative abundance more than 1.0% in the pickled chili samples

由 圖3 可 知，OTU1140 和OTU2282 與Lactobacillus acidifarinae聚為一類，OTU3351與Lactobacillus namurensis聚為一類，OTU7763和Lactobacillusparafarraginis聚為一類，OTU326與Lactobacillus kisonensis聚為一類，OTU5266和OTU227與Pediococcus ethanolidurans聚為一類，OTU7746與耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）聚為一類。由此可見，上述8個(gè)核心OTU中2個(gè)鑒定為Pediococcus，6個(gè)鑒定為L(zhǎng)actobacillus，因此，采集自恩施市的3種泡辣椒樣品中平均相對(duì)含量＞1.0%的核心菌群均為乳酸桿菌。

2.2 基于PCR-DGGE測(cè)序技術(shù)泡辣椒乳酸桿菌多樣性的研究

圖中L1～L5代表特異性條帶編號(hào)。圖4 泡辣椒樣品中乳酸桿菌PCR-DGGE結(jié)果Fig. 4 PCR-DGGE results of Lactobacillus in the pickled chili samples

由于本研究中MiSeq高通量測(cè)序的靶點(diǎn)主要針對(duì)16S rRNA的V3～V4區(qū)，所以其引物通用性較強(qiáng)，在種屬鑒定時(shí)通常僅將其鑒定到屬水平。本研究進(jìn)一步使用乳酸桿菌專用引物對(duì)樣品中的乳酸桿菌屬進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)對(duì)其多樣性進(jìn)行解析。泡辣椒樣品中乳酸桿菌PCR-DGGE電泳結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在電泳圖中共找到5條特異性條帶，其中條帶L1、L2、L4是3種泡辣椒樣品的共有條帶，條帶L5存在于泡辣椒樣品LJS01和LJS03中，但是各條帶的亮度不一致，說(shuō)明同種微生物在不同樣品中的含量存在差異，而條帶L3只存在于泡辣椒樣品LJS03中。由此可見，不同泡辣椒樣品間乳酸桿菌多樣性存在一定差異，且泡辣椒樣品LJS03中乳酸桿菌多樣性較高。進(jìn)一步對(duì)各優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行切膠回收和序列分析，結(jié)果如表2所示。

表2 DGGE中優(yōu)勢(shì)乳酸桿菌序列比對(duì)結(jié)果Table 2 Sequence alignment results of dominant Lactobacillus in DGGE

由表2可知，5個(gè)特異性條帶的基因序列與NCBI中模式菌株的基因序列具有較高的相似度（99%～100%）。條帶L1為植物乳桿菌（L.plantarum），條帶L2為L(zhǎng).namurensis，條帶L3為發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum），條帶L4為耐酸乳桿菌（L.acetotolerans），條帶L5為短乳桿菌（L.breris）。由此可見，恩施市泡辣椒中乳酸菌多樣性較高，采用純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)其中蘊(yùn)含的乳酸菌菌種資源進(jìn)行挖掘顯得尤為必要。

2.3 泡辣椒中乳酸菌分離鑒定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

使用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法對(duì)3種泡辣椒樣品中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定。從3種泡辣椒樣品中共分離得到14株乳酸菌，編號(hào)分別為L(zhǎng)JS01-1、LJS01-2、LJS01-3、LJS01-4、LJS01-6、LJS01-7、LJS02-1、LJS02-2、LJS02-4、LJS03-1、LJS03-2、LJS03-3、LJS03-5和LJS03-6。將各菌株與NCBI中同源性較高的模式菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，菌株LJS01-1、LJS01-3、LJS01-6、LJS01-7、LJS03-1、LJS03-5和LJS03-6與L.plantarum聚于一支，菌株LJS01-4、LJS02-2與L.fermentum聚于一支，菌株LJS02-1、LJS01-2、LJS02-4與屎腸球菌（Enterococcus faecium）聚于一支，菌株LJS03-2和LJS03-3與香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis）聚于一支。因此，14株乳酸菌經(jīng)16S rRNA基因序列鑒定，7株為L(zhǎng). plantarum，2株為L(zhǎng). fermentum，3株為E.faecium，2株為L(zhǎng).farciminis。

圖5 14株菌株基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of 14 strains based on 16S rRNA gene sequences

通過(guò)純培養(yǎng)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，本研究從泡辣椒樣品中分離出的乳酸菌主要為L(zhǎng).plantarum。利用傳統(tǒng)分子生物學(xué)及16S rRNA測(cè)序方法，王修俊等[23]在貴陽(yáng)發(fā)酵辣椒中發(fā)現(xiàn)一株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)、生長(zhǎng)良好的優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)鑒定為L(zhǎng).plantarum；葉陵等[24]從自然發(fā)酵剁辣椒中共鑒定出5株乳酸菌，其中3株為L(zhǎng).plantarum、2株為L(zhǎng).breris。

3 結(jié)論

恩施市3種泡辣椒樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對(duì)含量分別為85.70%和12.59%；優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其平均相對(duì)含量高達(dá)67.37%。通過(guò)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法共分離鑒定出14株乳酸菌，其中7株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、2株為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）、3株為屎腸球菌（Enterococcus faecium）、2株為香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis），表明優(yōu)勢(shì)乳酸菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。