陳義軒,宋婷婷,方 明,于志國,李 潔*,賴 欣*,張貴龍*
(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,沈陽110866;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所,天津300191)
生物炭(Biochar)是由作物秸稈、木屑、糞便等廢棄生物質(zhì),在絕氧條件下經(jīng)高溫?zé)峤猱a(chǎn)生的黑色固態(tài)炭質(zhì),一般呈堿性[1]。具有比表面積大、孔徑大[2]和離子交換量大[3]等特性的生物炭,不僅可以減少土壤中氮素的流失,減少N2O 和CO2等氣體的排放,而且具有長久的碳貯存能力[4]。生物炭豐富的孔隙結(jié)構(gòu)可以吸附無機(jī)離子、可溶性有機(jī)物質(zhì)及揮發(fā)性氣體,為土壤中的微生物提供良好的棲息環(huán)境,從而改變微生物的群落結(jié)構(gòu)[5-6]。土壤微生物作為土壤的重要組成成分,其群落結(jié)構(gòu)與土壤化學(xué)循環(huán)密切相關(guān),并且直接影響著土壤肥力[7]。已有研究表明,生物炭的多孔性結(jié)構(gòu)能夠顯著增加土壤通氣性,影響反硝化微生物組分,抑制硝態(tài)氮(NO-3-N)的反硝化損失[8];生物炭表面富含有機(jī)陰離子官能團(tuán),負(fù)電荷伴隨著芳環(huán)結(jié)構(gòu)形成的多交換位點(diǎn),使得生物炭具有較高的陽離子交換量(CEC),有利于吸附銨態(tài)氮(NH+4-N),減少NH+4-N的生物可利用性及其向NO-3-N 的轉(zhuǎn)化[9]。但生物炭的種類和用量對土壤微生物數(shù)量及組成的影響以及微生物-土壤氮素養(yǎng)分循環(huán)之間的關(guān)聯(lián),仍是科學(xué)研究的難點(diǎn)。
磷脂脂肪酸(PLFA)是活體微生物細(xì)胞膜的主要成分,具有生物特異性,因此測定土壤PLFA 可揭示土壤微生物量及其結(jié)構(gòu)組成信息。近年來PLFA 法也成為分析土壤微生物群落組成的常用方法[10]。Xu等[11]研究發(fā)現(xiàn),玉米秸稈生物炭能夠改變土柱淋溶試驗(yàn)后潮褐土中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。Bamminger等[12]通過37 d的培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),生物炭添加能顯著提高微生物PLFA 總含量和細(xì)菌類、真菌類PLFA 含量。并且,已有研究發(fā)現(xiàn),不同性質(zhì)的生物炭添加到土壤中會被不同的微生物群落利用,其引起的微生物群落結(jié)構(gòu)變化也存在明顯的差異[13]。Ameloot 等[14]研究發(fā)現(xiàn)添加生物炭(350 ℃熱解柳樹、豬糞)使土壤革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的豐度增加。Farrell 等[15]研究發(fā)現(xiàn)添加450 ℃熱解小麥秸稈生物炭會極顯著提高細(xì)菌生物量,而真菌則偏向利用桉樹生物炭。
不同原料生物炭及其對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響差異較大,這種差異可能與生物炭的組成結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及生物炭的用量有關(guān)[5,16]。本研究選用原料差異較大的花生殼生物炭(PBC)、玉米稈生物炭(MBC)、楊木屑生物炭(ABC)以及竹屑生物炭(BBC),分別按0(對照)、20.0、40.0、80.0、160.0 g·kg-1施入華北地區(qū)菜地潮土,采用室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn),測定不同處理對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)合生物炭自身性質(zhì)、土壤理化性質(zhì)與微生物群落特征綜合分析,研究不同原料生物炭、不同施入量對土壤及其微生物的影響及可能的作用機(jī)制,以期為生物炭的實(shí)際應(yīng)用提供施生物炭土壤與微生物反饋?zhàn)饔玫睦碚搮⒖肌?/p>
供試土壤采集自天津西青區(qū)益利來生態(tài)農(nóng)場(39°14′6″N,116°9′53.5″E)設(shè)施大棚,種植作物為黃瓜等蔬菜。土樣剔除動、植物殘?bào)w后充分混合,過20目篩后待用。土壤基本理化性質(zhì)如表1所示。
以宋婷婷等[17]試驗(yàn)為基礎(chǔ),用玉米稈、花生殼、楊木屑、竹屑四種生物質(zhì)作為供試材料。收集玉米稈、花生殼、楊木屑和竹屑,將其風(fēng)干、粉碎、研磨后過20目篩,于HBYQ 馬弗爐2200 中通N2狀態(tài)500 ℃燒制120 min,冷卻至室溫,過100目篩,干燥保存?zhèn)溆?。不同材料制備的生物炭的理化性質(zhì)如表2、圖1 和圖2所示。
土壤基本理化性質(zhì)測定參照鮑士旦的《土壤農(nóng)化分析》[18]。土壤pH 值、電導(dǎo)率參照NY/T 1377—2007、HJ 802—2016 進(jìn)行測定。土壤NO-3-N 和NH+4-N 濃度采用全自動連續(xù)流動分析儀(AA3,Bran+Luebbe Corp.)測定。生物炭pH 值測定參考GB/T 12496.7—1999;陽離子交換量采用火焰分光光度計(jì)進(jìn)行測定;生物炭的比表面積采用比表面積分析儀測定;灰分含量采用緩慢灰化法測定;揮發(fā)分的測定參照GB/T 2001—2013;固定碳的計(jì)算方法為固定碳(%)=100-灰分-揮發(fā)分;生物炭相對原子含量(%)測定使用X射線光電子能譜(XPS)的方法。傅里葉變換紅外光譜分析(FITR):用傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 380,Nicolet Corp.,美國)測定生物炭的紅外光譜,采用KBr壓片制樣,掃描波數(shù)范圍為400~4500 cm-1。掃面電鏡圖(SEM):采用TM-1000型掃描電鏡(Hitachi,日本),冷場發(fā)射式,對生物炭進(jìn)行表征。
表1 土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of soil
表2 生物炭理化性質(zhì)與工業(yè)分析Table 2 The proximate analysis and chemical properties of biochar
圖1 四種不同原料生物炭的傅里葉紅外光譜圖Figure 1 FT-IR spectra of biochar of different raw materials
稱取100 g 新鮮潮土,根據(jù)處理分別稱取20.0、40.0、80.0、160.0 g·kg-1四種不同生物炭,混合均勻后置于平底玻璃筒中,每個(gè)處理3 次重復(fù)。調(diào)節(jié)水分至田間持水量的45%,封口膜封口,并在封口膜中間留一個(gè)小孔,將其置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45 d,用稱重法定期校正土壤水分含量。在培養(yǎng)試驗(yàn)的1、3、6、9、14、20、30、45 d 破壞性取樣,測定土壤中的NO-3-N和NH+4-N。培養(yǎng)結(jié)束后,測定微生物PLFAs。
土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析采用PLFA 方法進(jìn)行分析[10]。稱取凍干土樣3 g 加入氯仿∶甲醇∶檸檬酸=1∶2∶0.8 單相提取劑15.8 mL,室溫振蕩離心,收集上清液,二次振蕩提取離心,合并上清液,加入檸檬酸緩沖液和氯仿,靜置過夜后氯仿相(下層)氮?dú)獯蹈伞⒅愞D(zhuǎn)移到SPE 柱中,萃取純化PLFA。利用安捷倫GC-MS(6890-5975C)檢測樣品。脂肪酸定量用內(nèi)標(biāo)法,十九脂肪酸甲酯(C19:0)作為內(nèi)標(biāo),PLFA 含量用nmol·g-1表示。根據(jù)不同微生物群落脂肪酸的分子結(jié)構(gòu)和基團(tuán)位置,Kulmatiski 等[10]將微生物群落分為真菌、放線菌、細(xì)菌(革蘭氏陽性菌G+和陰性菌G-)等,PLFA總量以檢測得到的脂肪酸加和表示。不同類型脂肪酸和微生物的對應(yīng)關(guān)系見表3。
圖2 四種不同原料生物炭的電鏡掃描圖(×2000倍)Figure 2 SEM(×2000 times)of different raw materials biochar
采用Excel 2016 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,SPSS 22 進(jìn)行顯著性分析、雙因素方差Duncan′s 分析(Two-ways ANOVA)和相關(guān)性分析等比較生物炭種類與添加量對土壤微生物群落的影響,Origin Pro 2017 作圖,Canoco 5.0進(jìn)行冗余分析排列諸多因素中對土壤微生物影響較大的理化指標(biāo)。文中出現(xiàn)的數(shù)值均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
添加生物炭對土壤pH值和電導(dǎo)率的影響均呈增加趨勢,但因用量與種類不同,處理間差異顯著。與對照相比,隨生物炭用量增加,施入四種生物炭處理的土壤pH 值和電導(dǎo)率均顯著升高(表4、表5);土壤pH 增幅在5.01%~7.19%,電導(dǎo)率增幅在-7.60%~65.79%。其中MBC 處理二者增幅最大,隨著MBC 添加量的增加,pH 最高為8.35,同時(shí)土壤EC 值由3.42 mS·cm-1升高到5.67 mS·cm-1,增幅達(dá)65.79%;而ABC和PBC處理對土壤pH值和EC值影響較小。
土壤微生物PLFA 總量及細(xì)菌、真菌、放線菌等土壤微生物群落組分PLFA 表征結(jié)果(圖5)顯示,供試PLFA 碳原子數(shù)從14~22 共26 種PLFA 被檢測出,基于含量較高的PLFA 進(jìn)行微生物類型劃分,發(fā)現(xiàn)供試土壤表現(xiàn)為細(xì)菌含量最高,其次為真菌和放線菌。添加生物炭的結(jié)果顯示,不同種類生物炭對土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu),整體呈“低量促進(jìn),高量抑制”的趨勢。其中施用PBC、MBC 和ABC 20 g·kg-1和40 g·kg-1時(shí)可顯著提高土壤微生物PLFA 總量,PLFA 總量最高;而BBC 則對微生物PLFA 總量表現(xiàn)出顯著的抑制作用。
表3 磷脂脂肪酸命名歸屬Table 3 PLFA interpretations
表4 不同種類生物炭對土壤pH值的影響Table 4 The effect of different types of biochar on soil pH
表5 不同種類生物炭對土壤電導(dǎo)率的影響(mS·cm-1)Table 5 The effect of different types of biochar on soil EC(mS·cm-1)
圖3 不同種類生物炭對土壤硝態(tài)氮含量的影響Figure 3 The effect of different types of biochar on soil nitrite nitrogen
進(jìn)一步對細(xì)菌、真菌和放線菌等土壤微生物群落組分PLFA 指標(biāo)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,不同生物炭對土壤微生物各組分的影響顯著,進(jìn)而導(dǎo)致土壤微生物PLFAs 總量和結(jié)構(gòu)的變化。在20 g·kg-1和40 g·kg-1PBC 處理中,細(xì)菌PLFA 量極顯著增加,分別較對照增幅為72.68%和34.3%,占該處理土壤微生物PLFA 總量的58.51%和49.60%。而隨PBC 添加量的增加,細(xì)菌PLFA 量在80 g·kg-1PBC 處理快速降低,導(dǎo)致其真菌細(xì)菌比值在20 g·kg-1和40 g·kg-1時(shí)較小,80 g·kg-1添加下出現(xiàn)0.72的峰值(圖6)。
ABC 顯著提高了真菌PLFA 含量。其中,ABC 添加量為20 g·kg-1和40 g·kg-1時(shí),真菌PLFA 量為9.35 nmol·g-1和8.55 nmol·g-1,占該處理土壤微生物PLFA總量的27.91%和30.29%,該添加量下的各生物炭處理相比,ABC真菌細(xì)菌比顯著高于其他三種生物炭。
MBC 是四種生物炭中唯一大幅度提高放線菌生物量的處理。20 g·kg-1添加量下,PLFA 達(dá)到3.06 nmol·g-1,顯著高于其他處理。BBC 顯著抑制了土壤細(xì)菌和真菌PLFA 量,導(dǎo)致相同添加量下其土壤微生物PLFA總量顯著低于其他處理。
圖6 生物炭添加對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)(真菌細(xì)菌比)的影響Figure 6 The effect of biochar to fungi-to-bacteria ratio
由表6 可知,生物炭種類和添加量對土壤微生物群落總PLFA 量,及其細(xì)菌、真菌、革蘭氏陽性菌PLFA 和真菌細(xì)菌比的影響顯著,而對放線菌PLFA含量影響不顯著。其中生物炭種類與添加量對細(xì)菌、真菌和真菌細(xì)菌比產(chǎn)生顯著交互作用。生物炭種類和添加量均對革蘭氏陽性菌產(chǎn)生了極顯著的影響,但革蘭氏陰性菌PLFA 僅與生物炭種類顯著相關(guān),且交互作用不顯著。
以土壤各菌群PLFA 量作為生物樣本,土壤和生物炭理化性質(zhì)作為環(huán)境變量對各因素進(jìn)行相關(guān)性分析(表7)。結(jié)果顯示,pH、EC、孔徑、比表面積和礦質(zhì)態(tài)氮含量是影響微生物PLFA 總量的主要控制因素,其中,細(xì)菌PLFA 含量與pH、EC、孔徑、NH+4-N 呈顯著負(fù)相關(guān),與比表面積呈顯著正相關(guān);真菌、革蘭氏陽性、陰性菌PLFA 含量和生物炭孔徑及土壤NH+4-N 呈顯著負(fù)相關(guān),與比表面積呈顯著正相關(guān);而放線菌PLFA含量與pH呈顯著負(fù)相關(guān)。
冗余參數(shù)如表8 所示,環(huán)境變量解釋了總變量的82.52%,不同種類生物炭分布在不同象限,說明生物炭種類對土壤微生物群落組成的影響差異顯著(圖7)。結(jié)果顯示,PBC、ABC 和20、40 g·kg-1MBC 的添加提高土壤真菌、細(xì)菌、放線菌和革蘭氏陰性菌、陽性菌PLFA 含量,其中孔徑、比表面積、CEC、灰分和礦質(zhì)態(tài)氮是促進(jìn)其土壤各菌群PLFA 含量的主要控制因素;而BBC和80、160 g·kg-1MBC處理則降低土壤真菌、細(xì)菌、放線菌和革蘭氏陰性菌、陽性菌PLFA 含量,其中pH、EC、孔徑是控制其土壤各菌群PLFA 含量的主要控制因素。
生物炭具富碳、孔隙度高、表面負(fù)載官能團(tuán)等特點(diǎn),施入土壤通常會影響其理化性質(zhì),阻控養(yǎng)分淋失,同時(shí)擾動土壤微生物群落[1,5]。諸多研究指出,生物炭制備過程產(chǎn)生的灰分物質(zhì),是導(dǎo)致土壤pH 值和電導(dǎo)率升高的主要因素[3,19-20]。由于生物炭灰分物質(zhì)中含有Na、Ca 和Mg 等堿金屬元素,且表面負(fù)載豐富的-COO-、-O-等有機(jī)陰離子官能團(tuán)[21],故生物炭一般呈堿性。在本研究中,PBC、MBC、ABC、BBC 的pH 值分別為9.92、9.84、8.76 和9.32;隨著生物炭添加量的增加,土壤pH 值升高(表4)。這與Zhang 等[22]和雷海迪等[23]的研究相近,其認(rèn)為生物炭含有的堿性灰分物質(zhì)多呈可溶態(tài),增加土壤鹽基飽和度,降低土壤交換性氫離子和鋁離子的水平。但一些研究[24]也指出,潮土本身偏堿性,具有較高的鹽基飽和度,且具有一定緩沖性,因此,生物炭對潮土pH 值影響可能不顯著。本研究供試潮土為連續(xù)種植的設(shè)施菜地土壤,其土壤pH 值為7.79,明顯低于文獻(xiàn)[24]中的8.30 的土壤pH。此外,本研究僅發(fā)現(xiàn)MBC 對供試土壤pH 值和電導(dǎo)率影響明顯,MBC 在四種生物炭中灰分最高,說明可能其本身含有較多的可溶性鹽或在有機(jī)質(zhì)分解的時(shí)候釋放出礦質(zhì)鹽分,從而提高供試土壤電導(dǎo)率。
表6 生物炭種類(B)與添加量(M)對土壤微生物群落影響的雙因素方差分析Table 6 Two-way-ANOVA for soil microbial community with biochar types(B)and addition content(M)
表7 皮爾遜相關(guān)性分析Table 7 Pearson′s correlations between microbial quantities and the properties of biochar and its amendment soils
表8 冗余分析參數(shù)表Table 8 Redundancy analysis summary table
圖7 不同環(huán)境變量對微生物群落的影響Figure 7 Effects of different environmental variables on microbial community
在快速熱解條件下制備生物炭時(shí),原材料花生殼、玉米秸稈、楊木屑及竹屑中的N、P、S 等非金屬元素會在該過程中揮發(fā)損失,因此,生物炭自身礦質(zhì)態(tài)氮含量可忽略不計(jì)。前期研究指出[16],四種生物炭表面分布的含氧官能團(tuán)(-OH、-C=O、-C-O)均參與了對-N、-N的吸附。本研究中,添加MBC處理土壤-N 下降幅度最大,這可能與MBC 參與-N吸附的含氧官能團(tuán)有關(guān),從紅外譜圖中可以看出,與其他三種生物炭相比,MBC 在3156~3800、1620 cm-1和1300~1000 cm-1處出現(xiàn)的醇羥基、芳香環(huán)羰基和醚類伸縮振動最為明顯(圖1),一定程度說明了在MBC對-N 的吸附過程中,含氧官能團(tuán)的參與作用更為顯著。另一些研究指出生物炭對土壤礦質(zhì)態(tài)氮變化的影響,也與生物炭可提供富含電子供體的有機(jī)物質(zhì)及高碳氮比間接影響反硝化細(xì)菌的能量轉(zhuǎn)化相關(guān)[25]。一方面,生物炭表面的陰離子含氧官能團(tuán)通過絡(luò)合或靜電作用與Ca2+、Mg2+等金屬離子結(jié)合形成金屬橋,增加對土壤-N 的吸附潛力[22],另一方面這些官能團(tuán)還可以提供豐富的電子供體與受體,促進(jìn)土壤厭氧反硝化作用,進(jìn)而導(dǎo)致土壤-N 含量的降低[26-27]。本研究培養(yǎng)初期,隨各生物炭添加量增加,土壤-N 含量呈顯著降低的趨勢,與上述學(xué)者研究結(jié)果相似。而經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng),土壤-N含量趨于平穩(wěn),可能是因?yàn)樯锾恐饾u向土壤底層沉積,或者是由于生物炭表面吸附不穩(wěn)定態(tài)碳,使反應(yīng)底物濃度降低的緣故[28]。
隨生物炭的輸入,土壤碳氮比和pH值的提高,一定程度上能改變土壤微生物碳氮利用率[29]。生物炭提高了土壤pH 值,打破了土壤溶液中NH3與的轉(zhuǎn)化平衡,堿性環(huán)境更利于向NH3轉(zhuǎn)化[8],因此,本試驗(yàn)隨生物炭用量的增加,培養(yǎng)初期土壤-N含量下降。韓光明[30]對潮土施加玉米芯生物炭的研究顯示,添加生物炭明顯提高氨氧化細(xì)菌與固氮微生物數(shù)量,加快對胺類碳源的利用。
生物炭的輸入改變了土壤理化條件,影響土壤微生物的生存環(huán)境,進(jìn)而影響微生物群落分布,引起土壤微生物群落變化[5]。本研究結(jié)果顯示,PBC、MBC和ABC 可顯著提高土壤微生物PLFA 含量,該結(jié)果與梁韻等[32]和張又弛等[33]的報(bào)道一致。研究表明,生物炭疏松、多孔的特殊表面結(jié)構(gòu)以及自身易分解的成分,能夠?yàn)槲⑸锏纳嫣峁鏊宛B(yǎng)分來源,促進(jìn)特定種類微生物的生長和繁殖[34]。
添加不同種類生物炭,能被不同的土壤微生物群落利用,其引起的微生物群落結(jié)構(gòu)變化也存在顯著差異[35]。有研究指出生物炭表面的氫鍵或靜電作用能使細(xì)菌留在生物炭的孔隙中,不受土壤淋洗的影響,從而增加土壤細(xì)菌的數(shù)量[5,36]。在本研究中,PBC 有較大的比表面積,且PBC 施入量為20 g·kg-1時(shí)細(xì)菌PLFA 量達(dá)到最大,這可能與PBC 有易產(chǎn)生氫鍵的灰分、合適的CEC及孔隙大小有關(guān)。
生物炭對真菌的影響與比表面積、孔徑、含水量、pH、灰分、高碳氮比等因素密切相關(guān)[5,37]。本試驗(yàn)PLFA 結(jié)果顯示,相同施用量下,ABC 各處理真菌PLFA 量總能保持較高水平,這可能是因?yàn)锳BC 的pH 值、表面粗糙有序的孔隙和較大的孔徑更適宜真菌定植。
放線菌能分泌胞外酶,參與復(fù)雜芳香類物質(zhì)的降解過程[38],紅外譜圖顯示,只有MBC 在2000~1600 cm-1處有較明顯的芳香族物質(zhì)的泛頻峰,說明MBC對芳香烴類基團(tuán)有較強(qiáng)的吸附性,因此一定程度上可以促進(jìn)利用該類物質(zhì)的放線菌的生長。此外,BBC對微生物PLFA 總量起顯著抑制作用,通過電鏡掃描與理化分析結(jié)果顯示,與其他生物炭相比,BBC 具有比表面積、CEC較小,孔徑較大和表面結(jié)構(gòu)不規(guī)則等特點(diǎn),可能對微生物的生長繁殖和定植有不利影響[39]。
真菌細(xì)菌比可以反映真菌和細(xì)菌相對含量的變化及其相對豐富度,是判斷土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)。本研究顯示,與空白對照相比,除20 g·kg-1PBC 和160 g·kg-1BBC 處理外,其余生物炭處理的土壤真菌細(xì)菌比值顯著增加,說明生物炭改善了土壤微生物群落結(jié)構(gòu),有利于土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[40]。
綜上所述,不同種類生物炭和用量對土壤養(yǎng)分與微生物群落結(jié)構(gòu)特征影響顯著。因此需根據(jù)不同生物炭材料,考慮土壤微生物組成和結(jié)構(gòu),確定安全用量,為生物炭安全施用提供理論依據(jù)。此外,本試驗(yàn)為室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),后期也應(yīng)該進(jìn)一步開展長期田間試驗(yàn),探索生物炭對土壤氮素行為和微生物群落之間的作用與機(jī)制。
(1)不同種類生物炭孔徑、比表面積、CEC及灰分等自身理化性質(zhì)的不同,顯著影響土壤pH 值和電導(dǎo)率,也直接影響土壤-N與-N的動態(tài)變化。
(2)添加PBC、ABC、MBC 可提高土壤微生物PLFA 總量及真菌、細(xì)菌、放線菌和革蘭氏陽性菌、陰性菌等組分的PLFA 含量;而BBC 則降低土壤微生物總PLFA含量及各組分PLFA含量。
(3)通過相關(guān)性和冗余分析可知,土壤pH、EC 和礦質(zhì)態(tài)氮含量,及孔徑、比表面積和灰分等生物炭屬性是影響各處理土壤PLFA 總量和各菌群PLFA 含量的主要控制因素。