轉(zhuǎn)基因棉花連續(xù)種植對(duì)土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

劉瑞華，陳靜怡，王麗麗，李 靜，劉惠芬，楊殿林，趙建寧*

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津300384；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津300191；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030；4.農(nóng)業(yè)部產(chǎn)地環(huán)境污染防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300191）

轉(zhuǎn)基因作物在21 年的全球商業(yè)化進(jìn)程中，種植面積從1996 年的170 萬(wàn)hm2上升至2016 年的1.85 億hm2。棉花作為我國(guó)種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物，2016 年種植面積約為280 萬(wàn)hm2，占棉花總播種面積的96%以上[1]。轉(zhuǎn)基因作物的大規(guī)模商業(yè)化種植在給人們帶來收益的同時(shí)，其對(duì)土壤微生物的影響及對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)帶來的風(fēng)險(xiǎn)越來越引發(fā)人們的關(guān)注[2]。

土壤是植物與其生長(zhǎng)環(huán)境之間物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化的重要場(chǎng)所。叢枝菌根真菌是其菌絲與植物根系形成的共生體[3]，也是土壤生態(tài)系統(tǒng)中一種同時(shí)具有植物根系和微生物特性的互惠共生體[4]。其容易受到土壤環(huán)境變化的影響，是一種較好的指示微生物，因此近年來吸引了越來越多的研究者對(duì)其進(jìn)行研究和探討。盧鑫萍等[5]研究發(fā)現(xiàn)，土壤鹽分組成類型的不同會(huì)對(duì)AM 真菌孢子的密度和侵染率有影響；Ndoye 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，土壤pH 值及各種無(wú)機(jī)速效養(yǎng)分含量均對(duì)AM 真菌的種屬分布有顯著影響；張海波等[7]研究發(fā)現(xiàn)，AM 真菌物種豐富度、Shannon 多樣性指數(shù)和侵染率受土壤類型與植物種類交互作用的顯著影響。

轉(zhuǎn)基因作物的殘?bào)w及根系分泌物皆有可能對(duì)土壤中的AM 真菌群落產(chǎn)生影響。王鳳玲等[8]研究表明轉(zhuǎn)Bt 棉葉片腐熟物抑制了AM 真菌在植物根部的定植，降低了AM 真菌的共生效應(yīng)；Turrini 等[9-10]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt 基因的玉米會(huì)影響共生體菌絲生長(zhǎng)和侵染，并危害到其附著胞的發(fā)育，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)Bt 基因品種的侵染率遠(yuǎn)低于其非轉(zhuǎn)基因親本；但是梁晉剛等[11]對(duì)轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆的研究并未發(fā)現(xiàn)AM 真菌群落結(jié)構(gòu)與非轉(zhuǎn)基因大豆間存在顯著性差異；Pasonen 等[12]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)AM 真菌的定植可能會(huì)有一定的影響。目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物種植對(duì)AM 真菌的影響還沒有定論[13]，關(guān)于長(zhǎng)期種植轉(zhuǎn)基因作物是否會(huì)對(duì)AM 真菌產(chǎn)生影響的研究還鮮見報(bào)道。因此，本研究利用PCR-DGGE 技術(shù)，以轉(zhuǎn)基因棉花013011（抗旱）、SGK321（抗蟲）和非轉(zhuǎn)基因棉花TH2（抗旱受體）、石遠(yuǎn)321（抗蟲受體）為研究材料，探究它們長(zhǎng)期種植后對(duì)土壤AM 真菌群落多樣性的影響，旨在為轉(zhuǎn)基因棉花種植的土壤環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于天津市武清區(qū)梅廠鎮(zhèn)周莊村（39°36′71.21″N，117°22′69.65″E），海拔6.3 m。地處華北平原東北部，地勢(shì)平緩。年平均氣溫為11.6 ℃，年平均降水量為606 mm，無(wú)霜期212 d。供試土壤為潮土，2016 年棉花播種前試驗(yàn)地基本理化性質(zhì)：全磷含量0.77±0.05 g·kg-1，全氮含量0.65±0.04 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)含量18±1.02 g·kg-1，pH值8.26±0.06。

1.2 供試材料

供試棉花品種為4 個(gè)品種，分為2 組對(duì)照試驗(yàn)。第1 組：TH2（抗旱受體）和013011（抗旱）；第2 組：石遠(yuǎn)321（抗蟲受體）和SGK321（抗蟲）。供試的轉(zhuǎn)基因材料013011 抗旱棉尚屬于研究階段，因此其所轉(zhuǎn)基因不便公布；SGK321為我國(guó)自主研發(fā)的雙價(jià)抗蟲棉，是將雙價(jià)抗蟲基因（Bt+CpTI）導(dǎo)入石遠(yuǎn)321 后育成的新品種。供試品種均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院棉花研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)為大田試驗(yàn)，每個(gè)小區(qū)100 m2（20 m×5 m），每種棉花種植3 個(gè)小區(qū)即3 次重復(fù)，寬窄行種植，行距分別為90 cm和40 cm。試驗(yàn)地自2011年開始種植供試品種至今，每個(gè)小區(qū)固定種植同一棉花品種，一直采用覆膜種植的方式，每個(gè)小區(qū)間種植寬度為5 m 的玉米保護(hù)行。施肥量為：氮肥200 kg·hm-2，鉀肥100 kg·hm-2，磷肥60 kg·hm-2。其中氮肥基施60%，追肥40%。磷鉀肥全部作基肥施用，棉花其他田間管理按照常規(guī)管理，不施農(nóng)藥。

1.4 土壤樣品采集

本試驗(yàn)分別在棉花的花鈴期（2016 年8 月16 日）和吐絮期（2016 年9 月27 日）采集土樣。采用隨機(jī)取樣法每個(gè)小區(qū)選取3 個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)選5 株相距最近的棉花，去除表面雜草和枯枝落葉，每株距離主根2 cm位置處用直徑3.5 cm 土鉆取20 cm 深土樣，并將3 個(gè)采樣點(diǎn)的樣品等比例混合，作為一個(gè)重復(fù)放入滅菌塑封袋帶回實(shí)驗(yàn)室放入低溫冰箱（-20 ℃）保存。

1.5 土壤總DNA提出

稱取0.35 g土壤樣品后采用BBI公司（Canada）的EZ-10 Spin Soil DNA Extraction kit 按操作說明提取總DNA，獲得的總DNA 使用Biophotometer（Eppendorf，Germany）進(jìn)行定量分析，并在1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，檢測(cè)總DNA質(zhì)量。

1.6 PCR擴(kuò)增

采用巢式PCR（Nested PCR）方法針對(duì)AM 真菌的ITS片段進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列及反應(yīng)程序見表1。

第一輪PCR 反應(yīng)體系：1 μL 每種引物，25 μL Premix Ex Taq（Loading dye mix），2 μL 的模板DNA，終體積為50 μL；第二輪PCR 反應(yīng)體系：1 μL 每種引物，25 μL Premix Ex Taq（Loading dye mix），以2 μL 第一輪PCR 產(chǎn)物為模板，補(bǔ)充無(wú)核酸酶水（Nuclease-Free water，Promega）至50 μL。

1.7 變性梯度凝膠電泳（DGGE）檢測(cè)

采用DcodeTM通用突變檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）按照操作說明進(jìn)行DGGE分析。丙烯酰胺凝膠（37.5∶1）濃度為8%，變性劑梯度為25%～50%[100%變性劑含有7 mol·L-1尿素和40%（V/V）去離子甲酰胺]，電泳緩沖液為1×TAE。將25 μL PCR 產(chǎn)物和5 μL 6×loading buffer 混合后用微量進(jìn)樣器加入膠孔中，100 V、60 ℃條件下電泳16 h。電泳結(jié)束后，小心取出凝膠，放在SYBRTMGreen I（1∶10 000）（Invitrogen，USA）染液中染色30 min，然后用Gel Dox XR 凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）觀察與拍照。

1.8 條帶回收及測(cè)序?qū)Ρ?/h3>

選取主要條帶割膠回收，用不帶GC 夾子的引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳分析確定為單一條帶后送出進(jìn)行克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI 上經(jīng)過Blast對(duì)比分析。將其中同源性最高的序列確定為參照菌株。相似性≥97%的序列則視為同一序列型。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007 和SPSS 17.0（Duncan′s test）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Quantity One 4.6.2 軟件進(jìn)行數(shù)字化處理并進(jìn)行聚類分析。各樣品用香農(nóng)-維納指數(shù)（Shannon-Wiener index，H）、均勻度（Evenness index，EH）和豐富度（Richness，S）評(píng)價(jià)AM 真菌多樣性的變化，其計(jì)算公式如下：

H=-ΣPilnPi

EH=H/lnS

式中：H 代表香農(nóng)-威納指數(shù)；Pi代表第i 條帶占總強(qiáng)度的比值；EH代表均勻度；S代表?xiàng)l帶數(shù)量或豐富度。

測(cè)序結(jié)果采用Chromas 2.0 軟件進(jìn)行序列分析，登陸NCBI（National Center for Biotechnology Information）網(wǎng)站下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。然后采用MEGA 6.0 軟件，Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)（Bootstrap）為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤總DNA的提取及PCR擴(kuò)增

各土壤樣品的總DNA 經(jīng)過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳（圖1），所有土壤樣品總DNA 均在9416～23 130 bp，表示所獲得的土壤DNA 質(zhì)量很好。將獲得的土壤DNA 直接用于PCR 擴(kuò)增（圖2）。擴(kuò)增后所獲得的片段集中在230 bp左右且條帶清晰片段大小均一，可用于后續(xù)DGGE分析。

表1 PCR反應(yīng)的引物及反應(yīng)條件Table 1 Primers and conditions used for PCR

圖1 棉花土壤樣品花鈴期（a）和吐絮期（b）DNA提取Figure 1 DNA samples extracted from the cotton soil at flowering and boll-setting stage（a）and boll opening stage（b）

圖2 棉花土壤樣品花鈴期（a）和吐絮期（b）AM真菌的ITS片段PCR結(jié)果Figure 2 AM fungi ITS fragment PCR results of the cotton samples at flowering and boll-setting stage（a）and boll opening stage（b）

2.2 DGGE指紋圖譜和AM真菌基因測(cè)序結(jié)果分析

DGGE 圖譜能夠直觀地反映出不同棉花品種土壤中AM 真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。在DGGE 圖譜中，不同位置的條帶代表不同的AM 真菌類群，不同泳道同一橫向位置的不同條帶一般被認(rèn)為是同一AM 真菌類群?；ㄢ徠诠灿?4條不同條帶，顯示出AM真菌的種類，其中非轉(zhuǎn)基因棉TH2 有18 個(gè)條帶，轉(zhuǎn)基因棉013011有20個(gè)；非轉(zhuǎn)基因棉石遠(yuǎn)321有21個(gè)，轉(zhuǎn)基因棉SGK321 有21 個(gè)。吐絮期共有27 條不同條帶，顯示出AM真菌的種類，其中非轉(zhuǎn)基因棉TH2有26個(gè)條帶，轉(zhuǎn)基因棉013011 有25 個(gè)；非轉(zhuǎn)基因棉石遠(yuǎn)321 有27個(gè)，轉(zhuǎn)基因棉SGK321有26個(gè)。

圖3 轉(zhuǎn)基因棉和非轉(zhuǎn)基因棉在花鈴期（a）和吐絮期（b）土壤中AM真菌群落結(jié)構(gòu)DGGE圖譜分析Figure 3 DGGE fingerprint analyses of AM fungi communities planted with GM verus Non-Gm cotton at flowering and boll-setting stage（a）and boll opening stage（b）

根據(jù)AM 真菌DGGE 指紋圖譜（圖3）選擇DGGE膠上易于區(qū)分的條帶進(jìn)行克隆測(cè)序。在花鈴期樣品中選取24 條條帶，在吐絮期樣品中選取27 條條帶，分別進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果登陸美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），得到條帶所代表的AM 真菌類型。分析所得序列的歸屬（表2、表3）以及樣品的指紋圖譜（圖3）發(fā)現(xiàn)，花鈴期測(cè)序的樣品條帶中兩組對(duì)照TH2 和013011（抗旱）、石遠(yuǎn)321 和SGK321（抗蟲）多為共有條帶，均包含有Uncultured Glomus（球囊霉屬）、Uncultured Glomeraceae（球囊霉科）、Uncultured Glomeromycota（球囊菌門）、Uncultured Rhizophagus（根孢囊霉屬）和Glomus sp.，且亮度較高的條帶大多為Uncultured Glomus（球囊霉屬），因此Uncultured Glomus（球囊霉屬）為共同優(yōu)勢(shì)屬。對(duì)比TH2 和013011（抗旱）樣品指紋圖譜（圖3）發(fā)現(xiàn)條帶18 和條帶24 為轉(zhuǎn)基因棉013011（抗旱）特有條帶，分別屬于Uncultured Glo?mus（球囊霉屬）和Uncultured Glomeromycota clone（球囊霉科）；條帶13 為非轉(zhuǎn)基因棉TH2 特有條帶，屬于Uncultured Rhizophagus（根孢囊霉屬）。對(duì)比石遠(yuǎn)321和SGK321（抗蟲）樣品指紋圖譜（圖3）發(fā)現(xiàn)條帶13為轉(zhuǎn)基因棉SGK321 特有條帶，屬于Uncultured Rhizoph?agus（根孢囊霉屬）；條帶24為非轉(zhuǎn)基因棉石遠(yuǎn)321特有條帶，屬于Uncultured Glomeromycota（球囊菌門）。未能在GenBank 收錄相似的AM 真菌分類中找到與條帶17 相似的分類。吐絮期測(cè)序的樣品條帶中兩組對(duì)照TH2 和013011（抗旱）、石遠(yuǎn)321 和SGK321（抗蟲）多為共有條帶，均包含有Uncultured Rhizophagus（根孢囊霉屬）、Uncultured Glomeraceae（球囊霉科）、Uncultured Glomus（球囊霉屬）、Rhizophagus sp.、Uncultured Diversispora（多孢囊霉屬）、Uncultured Glomeromycotina 和Uncultured Claroideoglomus（幼 套近明囊屬），且亮度較高的條帶大多為Uncultured Clo?mus（球囊霉屬），因此Uncultured Clomus（球囊霉屬）為共同優(yōu)勢(shì)屬。對(duì)比TH2 和013011（抗旱）樣品指紋圖譜（圖3）發(fā)現(xiàn)條帶18為非轉(zhuǎn)基因棉TH2特有條帶，屬于Uncultured Glomus（球囊霉屬），條帶15為轉(zhuǎn)基因棉013011 特有條帶，屬于Rhizophagus sp.（根孢囊霉屬）。對(duì)比石遠(yuǎn)321 和SGK321（抗蟲）樣品指紋圖譜（圖3）發(fā)現(xiàn)全為共有條帶。未能在GenBank收錄相似的AM 真菌分類中找到與條帶16、20、21、23、24 相似的分類。

表2 花鈴期序列鑒定和同源性分析結(jié)果Table 2 Sequence identification and homology analysis of flowering and boll-setting period

表3 吐絮期序列鑒定和同源性分析結(jié)果Table 3 Sequence identification and homology analysis of boll opening stage

2.3 土壤AM真菌多樣性分析

AM 真菌的多樣性指數(shù)是研究其群落物種數(shù)、個(gè)體數(shù)以及均勻度的綜合指標(biāo)。一般可用香農(nóng)-威納指數(shù)（H），均勻度（EH）和豐富度（S）表現(xiàn)。根據(jù)DGGE指紋圖譜中每條條帶的灰度比率對(duì)香農(nóng)-威納指數(shù)（H）、均勻度（EH）和豐富度（S）進(jìn)行分析。

結(jié)果表明土壤中AM 真菌的香農(nóng)-威納指數(shù)僅在吐絮期石遠(yuǎn)321 顯著低于SGK321，其余均未發(fā)現(xiàn)顯著性差異；TH2、013011 和石遠(yuǎn)321、SGK321 的土壤AM 真菌豐富度在各生長(zhǎng)期內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)顯著性差異；土壤中AM 真菌的均勻度僅在吐絮期TH2 顯著高于013011，其余均未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（表4）。

2.4 條帶相似性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用相似性矩陣數(shù)據(jù)，通過未加權(quán)算術(shù)平均對(duì)群法（The unweighted pair-group method with arithmetic averages，UPGMA）進(jìn)行聚類分析。一般認(rèn)為相似度大于0.60 就說明兩個(gè)群體具有較好的相似性。本研究中花鈴期4 種不同土壤樣品的最小相似度為0.65（圖4），在吐絮期4 種不同土壤樣品的最小相似度為0.61（圖4）。說明轉(zhuǎn)基因棉與常規(guī)棉土壤中AM 真菌群落結(jié)構(gòu)在花鈴期和吐絮期差異不顯著。

結(jié)果表明，花鈴期測(cè)序序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列相似度在99%～100%；吐絮期測(cè)序序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列相似度在98%～100%。將測(cè)序獲得的基因序列與相似序列對(duì)比，采用MEGA6 軟件Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖5和圖6）?；ㄢ徠跇悠犯鶕?jù)進(jìn)化上親緣關(guān)系的相似度，條帶1、3、4、6、7、9、10、11、12、14、21、22 形成了第1 類群；條帶2、5、15 形成了第2 類群；條帶8、16、18、19、20、23、24 形成了第3 類群；條帶13 為第4 類群。由圖6 可知，吐絮期樣品根據(jù)進(jìn)化上親緣關(guān)系的相似度，條帶4、5、6、7、9、10、18、19 形成第1 類群；條帶1、2、3、12、15、17 形成第2 類群；條帶8、11、13、14、22、25、26、27形成了第3類群。

表4 DGGE圖譜多樣性指數(shù)分析Table 4 DGGE profiles diversity index analysis

圖4 轉(zhuǎn)基因棉與非轉(zhuǎn)基因棉在花鈴期（a）和吐絮期（b）土壤樣品AM真菌群落結(jié)構(gòu)聚類分析Figure 4 Dendrogram of AM fungi communities at flowering and boll-setting（a）and boll opening stage（b）based on DGGE fingerprint

3 討論

本研究采用了PCR-DGGE 技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因棉與非轉(zhuǎn)基因棉土壤中AM 真菌群落結(jié)構(gòu)，直觀地反映出花鈴期和吐絮期兩組對(duì)照樣品中AM 真菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一時(shí)期轉(zhuǎn)基因樣品與非轉(zhuǎn)基因樣品之間DGGE 指紋圖譜有很強(qiáng)的相似性，且各條帶的亮度差異較小。一般認(rèn)為條帶的多少代表群落的多樣性，條帶的亮度代表微生物的量[14]。這說明同一生育時(shí)期AM 真菌的群落多樣性和群落構(gòu)成比較穩(wěn)定，沒有因?yàn)檗D(zhuǎn)基因棉花的種植而發(fā)生變化。而Castaldini 等[15]和Turrini 等[10]的研究表明轉(zhuǎn)基因作物的種植會(huì)對(duì)AM 真菌造成負(fù)面的影響，Blackwood等[16]采用Biolog 方法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt 玉米種植的土壤中真菌的含量要高于常規(guī)玉米，這些結(jié)果與本研究結(jié)果存在一定的差異，可能是由于所選生境及植物的種類不同而造成的。本研究中，花鈴期和吐絮期土壤樣品中AM 真菌群落結(jié)構(gòu)的最小相似度均大于0.6，優(yōu)勢(shì)屬均為Glomus（球囊霉屬），進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)基因棉的種植未對(duì)AM 真菌群落產(chǎn)生顯著影響，這一結(jié)果與Knox等[17]的研究結(jié)果相似，其結(jié)果也表明了轉(zhuǎn)基因植物的種植對(duì)AM 真菌無(wú)影響或影響甚微，Daniell 等[18]的研究結(jié)果表明Glomus（球囊霉屬）是根際叢枝菌根真菌群落的重要組分，這也與本研究結(jié)果相一致。同時(shí)還可以發(fā)現(xiàn)兩組棉花對(duì)照土壤樣品并不是以轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因分布在聚類圖的上下兩側(cè)，而是根據(jù)品種的不同分在了聚類圖的上下兩側(cè)，這說明品種間的差異要大于轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因之間的差異。另外同一組對(duì)照之間轉(zhuǎn)基因棉與非轉(zhuǎn)基因棉聚類結(jié)果大多沒有完全分開，可能是由于轉(zhuǎn)基因的導(dǎo)入使棉花根系分泌物發(fā)生了一定變化，從而導(dǎo)致土壤中AM 真菌的生長(zhǎng)發(fā)育過程受到了一定的影響[29]。

對(duì)土壤樣品AM 真菌的香農(nóng)-威納指數(shù)、豐富度、均勻度研究發(fā)現(xiàn)吐絮期的數(shù)值均要高于花鈴期，這種微生物數(shù)量與植株生長(zhǎng)發(fā)育呈正相關(guān)的現(xiàn)象在其他文獻(xiàn)中也有相似報(bào)道[20-21]。香農(nóng)-威納指數(shù)僅在吐絮期石遠(yuǎn)321 顯著低于SGK321，均勻度僅在吐絮期TH2顯著高于013011，這種顯著性差異從整體結(jié)果來看相差甚微，且其余結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。由于在自然環(huán)境中影響微生物群落多樣性的因素很多，作物的生長(zhǎng)期的不同、作物和土壤類型的差異、土壤養(yǎng)分因子、作物根系分泌物和農(nóng)業(yè)管理等都會(huì)影響微生物的群落結(jié)構(gòu)[22]。因此對(duì)于這種短暫的、不持續(xù)的差異性，本研究認(rèn)為是由于生育期的不同和種植地點(diǎn)的差異引起的。這也與Meyer等[23]發(fā)現(xiàn)影響真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素是作物生育期、種植地點(diǎn)及季節(jié)的觀點(diǎn)相符合。本研究還發(fā)現(xiàn)，同一生育期同一特有條帶在兩組對(duì)照實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)在一組的轉(zhuǎn)基因棉中同時(shí)也出現(xiàn)在另一組非轉(zhuǎn)基因棉中，因此認(rèn)為這種特異性并不是由于轉(zhuǎn)基因棉的種植而引起的，可能是由于品種的不同而造成，Bouffaud 等[24]對(duì)玉米土壤微生物的研究也表明不同玉米品種的種植會(huì)對(duì)其根際微生物群落組成產(chǎn)生一定的影響。在不同的生育期兩組對(duì)照實(shí)驗(yàn)的特異性條帶差異較大。因此可以認(rèn)為生育期的不同對(duì)土壤AM 真菌的群落結(jié)構(gòu)有一定的影響[25]，類似地，Liu 等[26]和Guadarrama 等[27]的研究也認(rèn)為季節(jié)變化以及生育期的不同對(duì)AM 真菌群落結(jié)構(gòu)有較大的影響。從系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果分析可知吐絮期AM 真菌的類群與花鈴期相比發(fā)生了變化，這與本研究認(rèn)為AM 真菌的類群差異是由于生育期的不同而造成的相一致。

圖5 花鈴期系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Phylogenetic tree of flowering and boll-setting period

任馨[28]對(duì)轉(zhuǎn)Bt 基因水稻種植的土壤研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt 基因水稻的種植沒有對(duì)土壤中的AM 真菌造成影響，劉華等[29]對(duì)多年種植轉(zhuǎn)基因棉的研究也未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的種植對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成影響。本實(shí)驗(yàn)室其他研究者用不同方法對(duì)與本研究相同試驗(yàn)地種植的轉(zhuǎn)基因棉與非轉(zhuǎn)基因棉土壤中酶活性、養(yǎng)分含量、微生物群落、細(xì)菌群落以及古菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，其研究結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因棉的種植會(huì)對(duì)以上指標(biāo)造成顯著性的影響[30-34]。這也與本研究結(jié)果認(rèn)為轉(zhuǎn)基因棉的種植并未對(duì)土壤AM 真菌群落結(jié)構(gòu)造成顯著性影響相一致。另外，本研究檢測(cè)出的大多數(shù)AM 真菌屬于不可培養(yǎng)微生物，且大部分分類地位仍未知，要確定其具體種屬和功能特性還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）轉(zhuǎn)基因棉與非轉(zhuǎn)基因棉土壤AM 真菌DGGE指紋圖譜在同一生長(zhǎng)時(shí)期多為共有條帶，同一生長(zhǎng)時(shí)期土壤AM 真菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，花鈴期和吐絮期優(yōu)勢(shì)屬均為Glomus（球囊霉屬）。

圖6 吐絮期系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 6 Phylogenetic tree of boll opening stage

（2）轉(zhuǎn)基因棉與非轉(zhuǎn)基因棉的種植對(duì)土壤AM 真菌香農(nóng)-威納指數(shù)（H）、均勻度（EH）和豐富度（S）幾乎沒有產(chǎn)生顯著性影響。

因此，本研究認(rèn)為轉(zhuǎn)基因棉的種植對(duì)土壤AM 真菌群落多樣性沒有產(chǎn)生顯著影響。