稻田土壤古菌群落組成對(duì)秸稈還田的響應(yīng)

王 寧，趙亞慧，艾玉春，張永春，汪吉東，于建光*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南京210014；2.農(nóng)業(yè)部江蘇耕地保育科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，南京210014）

秸稈還田是可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中資源循環(huán)利用的重要措施之一，不僅能夠改善土壤結(jié)構(gòu)、增加土壤養(yǎng)分和提高作物產(chǎn)量[1-5]，而且對(duì)土壤微生物也有著重要的影響[6-7]。古菌是土壤微生物的重要組成部分，直接影響土壤物質(zhì)循環(huán)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等[8-10]。然而由于土壤中大部分古菌很難分離培養(yǎng)，采用傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法如微生物平板培養(yǎng)法、變性梯度凝膠電泳（DGGE）等往往無(wú)法詳細(xì)描述出土壤微生物的群落多樣性和組成方面的信息[11-13]，使得對(duì)于土壤古菌生物多樣性的研究仍然匱乏，有關(guān)其演替規(guī)律仍不明了。近年來(lái)興起的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)如高通量測(cè)序技術(shù)等[14-16]，為深入探究土壤古菌群落組成、功能及其適應(yīng)機(jī)制提供了良好的契機(jī)，有助于闡述古菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)秸稈還田的響應(yīng)規(guī)律。

本文擬選取江蘇省兩種長(zhǎng)期稻麥輪作田塊作為研究對(duì)象，利用Illumina 測(cè)序技術(shù)，研究淹水培養(yǎng)期間不同量小麥秸稈施用于兩種類型稻田土壤后古菌群落的組成，旨在揭示稻田土壤古菌群落對(duì)秸稈還田的響應(yīng)規(guī)律，并結(jié)合土壤性質(zhì)進(jìn)一步揭示土壤古菌群落遷移的驅(qū)動(dòng)因子。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方案

供試土壤采自江蘇省兩種長(zhǎng)期稻麥輪作田塊，即泰州市的高砂土（GS）和無(wú)錫市的黃泥土（HN），土壤風(fēng)干過2 mm篩，混合均勻后貯存于室溫備用，其基本性質(zhì)見表1。供試秸稈是成熟收割后的小麥秸稈，來(lái)自于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥試驗(yàn)基地。秸稈曬干后磨碎，過10 目篩貯存于4 ℃?zhèn)溆茫渲薪斩挼暮剂繛?6.5%，含氮量為0.48%，碳氮比為96.9。

稱取400 g 土壤（干質(zhì)量）于廣口瓶中（直徑10 cm×高15 cm），試驗(yàn)設(shè)置4 種處理，分別為不添加小麥秸稈即對(duì)照（Control）、施用10 g·kg-1小麥秸稈（WS 1%）、施用20 g·kg-1小麥秸稈（WS 2%）、施用50 g·kg-1小麥秸稈（WS 5%）。小麥秸稈與土壤混合均勻后，向土壤中添加去離子水使其處于淹水狀態(tài)，每個(gè)處理設(shè)置12 個(gè)重復(fù)。將培養(yǎng)瓶置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，避光培養(yǎng)；在淹水培養(yǎng)期間的第0、15、30 d和60 d，分別收集每個(gè)處理的3 個(gè)重復(fù)樣品的孔隙水和土壤。具體采樣過程為：利用土壤孔隙水采樣器收集土壤孔隙水，用于溶解性有機(jī)碳（DOC）、還原性亞鐵[Fe（Ⅱ）]和總鐵（Fe）的測(cè)定；破壞性采樣收集土壤樣品，部分土壤風(fēng)干后用于土壤性質(zhì)（pH、EC、TC、TN）的測(cè)定，部分鮮樣保存于-20 ℃冰箱用于古菌群落結(jié)構(gòu)分析。

土壤pH值采用酸度計(jì)（pHs-3C 型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠）測(cè)定（土∶水=1∶5）；土壤EC 采用電導(dǎo)儀（DDSJ-318型電導(dǎo)率儀，上海雷磁儀器廠）測(cè)定；土壤TC 與TN 含量采用元素分析儀（Vario MAX CNS，Elementar，Germany）測(cè)定，并計(jì)算碳氮比值（C/N）；孔隙水DOC 含量采用有機(jī)碳分析儀（Shimadzu TOCVcph，Japan）測(cè)定；孔隙水Fe（Ⅱ）和總Fe 采用鄰菲啰啉比色法測(cè)定。

表1 兩種類型土壤基本性質(zhì)Table 1 Basic properties of two paddy soils used in this study

1.2 土壤微生物總DNA的提取及其古菌群落分析

根據(jù)FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒說明書提取土壤中DNA，儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆?。古菌PCR 擴(kuò)增采用具有barcode 的16S rRNA 通用引物：519F（5′-CAGCCGCCGCGGTAA-3′ ）和806R（5′ - GGACTACNSGGGTMTCTAAT-3′）。20 μL的擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：10 ng 模板DNA、4 μL FastPfu Buffer（5×）、2 μL BSA（2.5 mmol·L-1）、0.8 μL 519F（5 μmol·L-1）、0.8 μL 806R（5 μmol·L-1）、18 μL 滅菌水。每個(gè)樣品包括4 個(gè)重復(fù)體系。擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；40 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min；最后在72 ℃再延伸5 min。混合同一樣品的4 個(gè)PCR 產(chǎn)物重復(fù)樣品，切膠回收并純化。將PCR 產(chǎn)物用藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。所獲得的DNA 送到上海凌恩生物有限公司，用于Illumina Miseq測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)分析采用Excel 2007 和SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析，古菌群落測(cè)序數(shù)據(jù)分析具體請(qǐng)參照文獻(xiàn)[17]的方法，古菌群落系統(tǒng)發(fā)育樹利用ISanger云平臺(tái)進(jìn)行分析，圖形繪制采用SigmaPlot 10.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

淹水培養(yǎng)期間，不同量小麥秸稈（0、1%、2%和5%）施用下兩種類型土壤的部分理化性質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化見圖1。從圖1可以看出，未施用秸稈時(shí)，整個(gè)淹水培養(yǎng)期間兩種類型水稻土壤的TC、TN、C/N、DOC、Fe（Ⅱ）和Fe 濃度整體上并無(wú)顯著變化。而土壤EC在淹水初期逐漸降低，例如，在淹水的0～15 d 期間，高砂土EC 從132 μS·cm-1降低至43 μS·cm-1，而黃泥土EC 從61.7 μS·cm-1降低至27.5 μS·cm-1；在淹水培養(yǎng)的15～60 d期間，兩種類型土壤的EC保持穩(wěn)定。另外，研究發(fā)現(xiàn)兩種類型的土壤pH 在未施用秸稈時(shí)呈現(xiàn)不同的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律：高砂土壤pH 在整個(gè)淹水培養(yǎng)期間無(wú)顯著變化，而黃泥土pH 從最初的6.38 逐漸降低為6.14，后又逐漸升高為6.77 和6.59。以上研究結(jié)果表明，0～60 d 淹水培養(yǎng)對(duì)兩種類型土壤的TC、TN、C/N 和孔隙水中DOC、Fe（Ⅱ）和總Fe 的濃度并無(wú)顯著影響，但顯著降低了黃泥土壤的pH 值和兩種類型土壤的EC。

對(duì)于施用秸稈的土壤，在整個(gè)淹水培養(yǎng)期間，兩種類型土壤的TC 和TN 是逐漸增高的，而土壤C/N 及孔隙水DOC、Fe（Ⅱ）和總Fe濃度在淹水培養(yǎng)初期（0～15 d 或者0～30 d）是逐漸增大的，而在淹水培養(yǎng)后期逐漸降低。當(dāng)秸稈施用量為5%時(shí)，兩種類型土壤EC變化趨勢(shì)存在著顯著的差異：黃泥土EC 是先升高后降低的，而對(duì)于高砂土，在整個(gè)厭氧培養(yǎng)期間，EC 是從132.4 μS·cm-1逐漸增大到232.3 μS·cm-1。然而當(dāng)秸稈施用量為1%和2%，在整個(gè)厭氧培養(yǎng)期間，兩種類型土壤EC 都未有顯著變化。另外，研究發(fā)現(xiàn)施用秸稈的兩種類型土壤的pH 值呈現(xiàn)不同的動(dòng)態(tài)變化，高砂土壤pH 在整個(gè)淹水培養(yǎng)期間并無(wú)顯著變化；而黃泥土pH 先有所降低，后又逐漸升高。以上研究結(jié)果表明，當(dāng)添加新鮮有機(jī)質(zhì)時(shí)，淹水培養(yǎng)顯著增加了土壤TC、TN、C/N、DOC、Fe（Ⅱ）和Fe，而土壤pH和EC的變化與土壤類型密切相關(guān)。

與未施用秸稈相比，隨著秸稈還田量的增大，土壤pH 值逐漸降低，而土壤EC、TC、TN、C/N、DOC、Fe（Ⅱ）和Fe 逐漸增加，并且當(dāng)秸稈還田量為5%時(shí)，上述土壤指標(biāo)改變量最大。以上結(jié)果表明，秸稈還田顯著降低了土壤pH 值，而顯著提高了土壤EC、TC、TN、C/N、DOC、Fe（Ⅱ）和Fe 含量，并且隨著秸稈還田量的增加其改變量逐漸增大。

2.2 土壤古菌群落組成

利用Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)78 個(gè)不同量秸稈施用0、15、30 d 和60 d 后的土壤樣品按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU 聚類。不同量秸稈施用下，淹水培養(yǎng)第0、15、30 d 和60 d 土壤的古菌群落系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

可以看出，未施用秸稈時(shí)，高砂土和黃泥土的優(yōu)勢(shì)古菌均為奇古菌門（Thaumarchaeota）（圖2），其相對(duì)豐度為97.3%和98.1%（圖3）；不同秸稈處理下，對(duì)奇古菌門相對(duì)豐度的顯著性差異分析發(fā)現(xiàn)，淹水培養(yǎng)第15 d和30 d，秸稈施用對(duì)土壤奇古菌門的相對(duì)豐度無(wú)顯著影響；但淹水培養(yǎng)第60 d 時(shí)，與未施用秸稈相比，秸稈施用下，兩種類型稻田土壤中奇古菌門的相對(duì)豐度顯著降低，并且隨著秸稈施用量的增加，奇古菌門的豐度也逐漸降低（P＜0.05）（圖3）。以上結(jié)果表明，淹水培養(yǎng)初期，秸稈還田對(duì)兩種類型稻田土壤中優(yōu)勢(shì)古菌（奇古菌門）的豐度并無(wú)顯著性影響，而淹水培養(yǎng)后期，秸稈還田顯著降低了土壤中奇古菌門的豐度，并且秸稈還田量的增加明顯抑制了土壤中奇古菌門的豐度。

圖1 0～60 d淹水培養(yǎng)期間不同量秸稈施用下兩種類型土壤性質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化Figure 1 Temporal changes of soil properties during a 60 d incubation period for two paddy soils

為了進(jìn)一步探究秸稈還田對(duì)土壤中古菌群落組成的影響，我們對(duì)不同量秸稈還田下土壤中古菌群落組成進(jìn)行了主成分分析（PCA）（圖4）。結(jié)果顯示，兩種不同類型的土壤之間古菌群落存在著顯著差異（圖4A，表2），表明土壤類型是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要控制因子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與未淹水培養(yǎng)的土壤（第0 d）相比，淹水培養(yǎng)（第15、30 d 和60 d）期間兩種類型土壤古菌群落并無(wú)顯著變化（圖4B，表2）。以上研究結(jié)果表明，淹水培養(yǎng)時(shí)間對(duì)兩種類型土壤古菌群落結(jié)構(gòu)并無(wú)顯著性影響。

圖2 淹水培養(yǎng)期間不同量秸稈施用下兩種類型土壤古菌群落的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree of archaeal community composition in two soils during flooding incubation with different straw additions

圖3 淹水培養(yǎng)期間不同量秸稈施用下兩種類型土壤奇古菌門（Thaumarchaeota）的相對(duì)豐度Figure 3 Relative abundances of Thaumarchaeota in two soils during flooding incubation with different straw additions

圖4 淹水培養(yǎng)期間不同量秸稈施用下兩種類型稻田土壤古菌群落組成的主成分分析Figure 4 Principle component analysis（PCA）of archaea community composition in two types of soils with various treatments

與未施用秸稈的土壤相比，秸稈施用量為1%和2%時(shí)，并未顯著改變高砂土古菌群落結(jié)構(gòu)，而當(dāng)秸稈施用量為5%時(shí)，顯著改變了其古菌群落結(jié)構(gòu)；與高砂土不同，當(dāng)秸稈施用量為1%時(shí)，顯著改變了黃泥土古菌群落結(jié)構(gòu)，而當(dāng)秸稈施用量為2%和5%時(shí)，并未顯著改變其古菌群落結(jié)構(gòu)（圖4C，表2）。另外，不同量秸稈施用下兩種類型土壤古菌群落演替也顯著不同。秸稈施用量為5%時(shí)，高砂土古菌群落顯著不同于秸稈施用量為1%和2%的土壤，而秸稈施用量為1%和2%之間的高砂土古菌群落并無(wú)顯著差異；然而，對(duì)于黃泥土，僅秸稈施用量為1%和2%之間的土壤古菌群落存在著顯著性差異（圖4C；表2）。以上研究結(jié)果表明，秸稈還田能夠改變兩種類型土壤古菌群落結(jié)構(gòu)，而兩種類型土壤古菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)不同量秸稈還田的響應(yīng)是顯著不同的。

表2 不同量秸稈施用下兩種類型土壤古菌群落結(jié)構(gòu)的差異性分析Table 2 Significant differences（P value）in archaeal community composition in two soils between different treatments

2.3 土壤性質(zhì)對(duì)古菌群落的影響

為了進(jìn)一步探究土壤中古菌群落遷移的主要驅(qū)動(dòng)因子，本文分析了土壤性質(zhì)與優(yōu)勢(shì)古菌（奇古菌門）豐度間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)土壤pH、TN和C/N與奇古菌門呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性（表3）。結(jié)果表明pH、TN 和C/N是影響奇古菌門差異性的重要因子。進(jìn)一步通過冗余分析（RDA）對(duì)環(huán)境因子和土壤古菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)在所用的環(huán)境因子[pH、EC、TC、TN、C/N、DOC、Fe（Ⅱ）、Fe]中，土壤pH 和C/N 是影響秸稈還田下兩種類型土壤古菌群落遷移的最重要因子（圖5）。以上研究結(jié)果表明，秸稈還田很可能主要是通過改變土壤性質(zhì)來(lái)改變優(yōu)勢(shì)菌的豐度，進(jìn)而調(diào)控古菌群落結(jié)構(gòu)。

表3 奇古菌門（Thaumarchaeota）與土壤性質(zhì)的相關(guān)性分析Table 3 Spearson correlation coefficient（r）between soil characteristics and the relative abundance of Thaumarchaeota

圖5 淹水培養(yǎng)期間不同量秸稈施用下兩種類型稻田土壤古菌群落組成的冗余分析Figure 5 Redundancy analysis（RDA）of archaeal community composition at genus level in two types of soils during flooding incubation with different amounts of wheat straw addition

3 討論

古菌是目前生物地球化學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，不僅能在高溫、強(qiáng)酸/堿性、高鹽、缺氧等極端條件下存在，而且能在普通海洋、土壤等環(huán)境介質(zhì)中存活，其含量巨大，在全球的碳氮元素生物地球化學(xué)過程中的作用不可忽視[18]。本研究發(fā)現(xiàn)兩種類型稻田土壤中主要的優(yōu)勢(shì)古菌均為奇古菌門，其主要的屬是Candidatus Nitrososphaera，這類古菌已經(jīng)被報(bào)道能夠參與氨氧化作用[19]。而早年通過同位素示蹤技術(shù)對(duì)古菌群落組成的分析發(fā)現(xiàn)，泉古菌是古菌群落的重要組成，其能利用14C-無(wú)機(jī)碳和H213CO3進(jìn)行自養(yǎng)[20-21]。隨后，Konneke等從海洋中成功分離培養(yǎng)到第一株奇古菌Nitro?sopumilus maritimus，證實(shí)了這類奇古菌通過催化氨氧化獲取能量進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)的代謝特征[22]，因此這類古菌也被稱為氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing Archaea，AOA）。近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)其他一些奇古菌如海綿共生古菌（Cenarchaeum symbiosum）、海洋亞硝化短小古菌（Nitrosopumilus maritimus）、加爾加亞硝化球菌（Ni?trososphaera gargensis）、黃石亞硝化熱泉菌（Nitrosocal?dus yellowstonii）、維也納亞硝化球菌（Nitrososphaera viennensis EN76）、阿伯丁土壤亞硝化細(xì)桿菌（Nitroso?talea devanaterra）等都是重要的氨氧化古菌[22-26]。氨氧化古菌的發(fā)現(xiàn)，不僅改變了近百年來(lái)人們對(duì)氨氧化過程主要由細(xì)菌驅(qū)動(dòng)的認(rèn)識(shí)，也為揭示奇古菌門的生理代謝特征及其在自然界物質(zhì)轉(zhuǎn)化，尤其是氮循環(huán)中的作用開啟了新的篇章。

大量研究顯示土壤性質(zhì)是調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因子[27]。已有研究表明土壤pH 值是引起微生物群落遷移的重要調(diào)控因子[28]。我們研究發(fā)現(xiàn)隨著秸稈施用量的增大，土壤pH顯著降低，這很可能是由于秸稈還田過程中會(huì)腐爛分解產(chǎn)生甲酸、乙酸、酚酸等有機(jī)酸[29]。進(jìn)一步的分析也表明pH 顯著改變了稻田土壤古菌群落組成（圖5）。同時(shí)，由于秸稈中含有豐富的碳氮等營(yíng)養(yǎng)元素，秸稈還田將秸稈中的一些營(yíng)養(yǎng)元素歸還土壤，在一定程度上可以顯著增加土壤中碳氮等養(yǎng)分含量[30-32]。本研究中秸稈還田顯著提高了土壤碳氮含量及其碳氮比，為微生物的生長(zhǎng)提供碳源和氮源，進(jìn)而改變古菌群落結(jié)構(gòu)。

本研究中兩種類型土壤的古菌群落組成對(duì)不同量秸稈還田響應(yīng)的差異很可能是由于不同類型土壤中微生物可利用的基質(zhì)含量和種類各不相同所導(dǎo)致的。已有研究表明土壤微生物群落的遷移與pH和C/N密切相關(guān)（圖5）。本研究中，黃泥土屬于偏酸性土壤（pH＜7.0），比較適合古菌優(yōu)勢(shì)菌如氨氧化菌的生長(zhǎng)[33]，同時(shí)低秸稈量施用下能夠明顯提高土壤的C/N比值，為微生物提供碳源和氮源[34]，因此顯著改變了古菌群落結(jié)構(gòu)；而微生物對(duì)土壤中C、N的利用有一定的比例范圍，一旦C/N 比值變大，勢(shì)必引起微生物對(duì)N 源的爭(zhēng)奪利用，當(dāng)秸稈施用量很大時(shí)很可能會(huì)造成土壤氮缺乏[35]，從而降低氨氧化古菌的相對(duì)豐度，因此高秸稈施用于酸性土壤后，盡管pH 的降低更有利于古菌優(yōu)勢(shì)菌如氨氧化古菌的生長(zhǎng)，然而過高的C/N反而降低氨氧化古菌的相對(duì)豐度。由于pH 和C/N 對(duì)氨氧化古菌的相反效應(yīng)，因此高秸稈量施用很可能并未引起黃泥土中微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著性遷移。而相對(duì)堿性高砂土（pH＞7.0），pH 對(duì)微生物菌落的影響作用可能較小，因此高秸稈施用下，C/N 對(duì)微生物作用更強(qiáng)，從而較高秸稈施用下高砂土古菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著遷移。

4 結(jié)論

（1）兩種類型稻田土壤的優(yōu)勢(shì)古菌均為奇古菌門（Thaumarchaeota）。

（2）兩種類型土壤古菌群落組成對(duì)不同量秸稈還田響應(yīng)存在著明顯差異。與未施用秸稈的土壤相比，高秸稈施用量（5%）顯著改變了高砂土古菌群落組成，而低秸稈施用量（1%）顯著改變了黃泥土古菌群落組成。高秸稈施用量（5%）下高砂土古菌群落顯著不同于較低秸稈施用量（1%和2%）的土壤，而較低秸稈施用量（1%和2%）之間的土壤古菌群落并無(wú)顯著差異；而黃泥土僅較低秸稈施用量（1%和2%）之間的土壤古菌群落存在著顯著差異。

（3）pH 和C/N 是秸稈還田下兩種類型土壤古菌群落遷移的重要驅(qū)動(dòng)因子。