Cr6+對牙鲆仔幼魚的急性毒性效應(yīng)研究

崔劍斌，孫朝徽，趙雅賢，任建功，張曉彥，王桂興，都 威，侯吉倫,宮春光，王玉芬

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院， 河北秦皇島 066100； 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心試驗站， 河北秦皇島 066100)

在過去的幾十年中，隨著工業(yè)化進(jìn)程的不斷加快，海洋和江河的水污染現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，很多污染源含有大量的重金屬離子，造成水體的重金屬污染[1]。重金屬污染具有一定的不可逆性，具有毒性大、持續(xù)時間長、微生物不可降解、易在生物體內(nèi)富集的等特點，已對水生生物造成了巨大威脅[2-4]。Cr6+是水環(huán)境中重要的重金屬污染物之一，是一種在多器官、多系統(tǒng)中都具有很強(qiáng)蓄積性的毒物[5]。水體中Cr6+的來源主要是工業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)常應(yīng)用的鉻化合物，例如鉻鐵冶煉、耐火材料、電鍍、制革、顏料和化工等工業(yè)生產(chǎn)。其中應(yīng)用最廣泛的重鉻酸鉀(K2Cr2O7)，是一種有毒且有致癌性的強(qiáng)氧化劑，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)劃歸為第一類致癌物質(zhì)。

在人類和其它哺乳動物中，關(guān)于Cr6+的毒理學(xué)和毒性效應(yīng)已經(jīng)有諸多的研究[6]。但在水生生物中，相關(guān)研究開展的相對較少，且僅集中在鳙 (Aristichthysnobilis)[7]、鯉 (Cyprinuscarpio)[8]、泥鰍(Misfurnusangullicaudatus)[9-10]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[11]等淡水魚以及日本黃姑魚(Nibeajaponica)[12]、鮸魚(Miichthysmiiuy)[13]等海水魚中。吳迪等[10]研究了重鉻酸鉀對二倍體和三倍體泥鰍鰭細(xì)胞的氧化損傷、微核形成以及金屬硫蛋白表達(dá)情況的影響，結(jié)果顯示，二倍體細(xì)胞的半致死濃度、酶活力都低于三倍體細(xì)胞，對Cr6+更為敏感，可用于鉻污染的研究和監(jiān)測。

本研究以我國重要的海水養(yǎng)殖魚類牙鲆(Paralichthysolivaceus)為對象，開展Cr6+對牙鲆的急性毒性效應(yīng)研究。以期為深入了解Cr6+對海水魚類的毒性機(jī)理、客觀評價其對海洋生物的潛在風(fēng)險以及準(zhǔn)確鑒定和處理其所造成的海洋與漁業(yè)污染事故提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗魚為一個牙鲆連續(xù)兩代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系。所用仔魚為孵化后20日齡，平均體長(1.05±0.09 cm)，平均體質(zhì)量(0.11±0.03 g)；幼魚平均體長(22.42±3.71 )cm，平均體質(zhì)量(92.65±9.82 )g。實驗開始前，挑選健壯、無病無傷、無畸形、大小均勻的個體，移入300 L圓水槽中飼養(yǎng)。仔魚飼養(yǎng)3 d，幼魚飼養(yǎng)7 d，每一個水槽的試驗魚無任何死亡方可用于實驗。正式實驗開始前24 h，試驗魚停止投喂。

1.2 實驗用水及配置

重鉻酸鉀(K2Cr2O7)，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)。實驗前稱取一定量的重鉻酸鉀, 用去離子水將重鉻酸鉀配成含Cr6+質(zhì)量濃度為10 g·L-1的母液。實驗時再以經(jīng)過兩次沙濾的海水稀釋成所需濃度的實驗溶液。實驗期間，水溫范圍為(18.5±0.5)℃，pH 范圍為8. 1～8. 3，鹽度為31. 0， 硬度為6200 mg·L-1，溶氧不低于5 mg·L-1。

1.3 實驗方法

1.3.1 急性毒性實驗

參照GB 13267-1991《水質(zhì)物質(zhì)對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法》進(jìn)行實驗[14]，采用靜水生物測試方法。通過預(yù)實驗確定仔魚和幼魚Cr6+的濃度范圍。正式實驗按照等對數(shù)間距法分別設(shè)5個濃度梯度處理，其中仔魚所設(shè)置的濃度梯度為25.00、32.92、44.16、59.22、80.00 mg·L-1；幼魚所設(shè)置的濃度梯度為280.00、324.00、374.00、433.00、500.00 mg·L-1。每一系列另設(shè)置1個空白對照，每個梯度設(shè)4個平行(其中3個為試驗組，1個為采樣組)。實驗所用容器，仔魚為1000 mL的大燒杯，幼魚為300 L圓水槽。每個容器中試驗魚為20尾。整個實驗持續(xù)96 h，實驗開始后10 h內(nèi)連續(xù)觀察試驗魚的活動情況，隨時撈出死亡個體，每24 h更換溶液一次，并分別在第24、48、72 、96 小時記錄試驗魚的存活情況。整個實驗期間，不投喂餌料。

1.3.2 試驗魚死亡的判定

當(dāng)用玻璃棒觸碰牙鲆幼魚時，無任何肉眼可見運動，如無鰓扇動，失去呼吸能力；碰觸尾柄后、毫無反應(yīng)；或者魚體失衡腹部向上，身體僵直，即判定為死亡個體。

1.3.3 血涂片制備及核異常觀察

取牙鲆幼魚外周血于潔凈的載玻片上，涂片，每尾魚至少制作5張涂片。涂片晾干，甲醇固定法10 min，15% Giemsa染液染色15 min, 自來水沖洗, 自然晾干。置于油鏡下觀察, 每片隨機(jī)觀察統(tǒng)計2000 個以上紅細(xì)胞, 記錄具有核異常的細(xì)胞數(shù)。核異常率(‰)為具有核異常的紅細(xì)胞數(shù)占所觀察的紅細(xì)胞總數(shù)的千分比。

1.3.4 組織切片與觀察

實驗開始后24、48、72、96 h，分別對幼魚各濃度進(jìn)行解剖，將鰓組織塊用波恩氏液固定24 h后，隨后移入70%酒精保存。對經(jīng)固定的組織塊進(jìn)行梯度乙醇脫水、 二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度4 μm)和HE染色。所制備組織切片用Leicai DM2500進(jìn)行觀察和拍照。

1.4 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計平均死亡率，換算成概率單位，按照Bliss法，求出概率單位和實驗溶液濃度的回歸方程，求出24、48、72、96 h半致死濃度LC50，以及各自的95%置信區(qū)間。計算公式為：

LC50=Lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]

式中，Xm為最大劑量的對數(shù)值，i為相鄰兩組比值的對數(shù)，p為各組死亡率，∑p為各組死亡率之和。

按照Turubell法計算安全濃度(safety concentration,SC)[15]。計算公式為：

不同處理組間的紅細(xì)胞核異常率采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 牙鲆的中毒癥狀

牙鲆仔魚和幼魚在Cr6+暴露中各處理組均表現(xiàn)為由集群變?yōu)榉稚?。低質(zhì)量濃度組的試驗魚沿容器底部緩慢游動; 高質(zhì)量濃度組的試驗魚進(jìn)入水槽后顯得十分不安, 上升到水面沿池壁轉(zhuǎn)圈游動，一段時間后伏在池底靜止不動。隨染毒時間的延長，各處理組均出現(xiàn)魚體色變黑、粘液分泌增多、 鰓及腹部有輕微充血的現(xiàn)象，以及失去平衡，游泳能力和呼吸能力減弱。

2.2 Cr6+對牙鲆仔魚和幼魚的急性毒性

從表1可以看出，牙鲆仔魚在不同濃度Cr6+中暴露24 h后均出現(xiàn)死亡，死亡率在(3.33±2.89)%至(43.33±7.86)%之間，顯著高于對照組，且各濃度處理組之間差異顯著(P≤ 0.05)。隨著暴露時間和濃度的增加，累計死亡率有明顯的增加。96 h后，25.00 mg·L-1組的累計死亡率為(35.00±5.18)%，而最高濃度80.00 mg·L-1的累計死亡率達(dá)(98.33±2.89)%。

牙鲆幼魚在500 mg·L-1處理組暴露24 h出現(xiàn)大量死亡，累計死亡率達(dá)90.00%；而其它處理組的累計死亡率在1.65%～16.65%之間。到48 h，500 mg·L-1的試驗魚全部死亡。其它濃度處理組在48 h至96 h，也呈現(xiàn)出隨時間和濃度的增加累計死亡率升高的趨勢。433 mg·L-1死亡率高達(dá)95.00%，且未死亡的3尾試驗魚活力微弱。

2.3 Cr6+對牙鲆的半致死濃度及LC50值

死亡率換算的概率單位和試驗液質(zhì)量濃度對數(shù)的回歸方程，以及各時間點的LC50值和95%置信區(qū)間見表2和表3。Cr6+對牙鲆仔魚的24、48、72、96 h半致死質(zhì)量濃度分別為75.19、67.13、49.77、31.09 mg·L-1，安全濃度為16.05 mg·L-1；對牙鲆幼魚24、48、72、96 h 的半致死質(zhì)量濃度分別為462.13、435.36、390.19、322.41 mg·L-1，安全濃度為115.91 mg·L-1。

2.4 Cr6+對牙鲆幼魚紅細(xì)胞核異常率的影響

在本試驗中，對照組正常紅細(xì)胞為橢圓形，其核位于細(xì)胞正中央，核膜清晰。在不同濃度Cr6+處理組中，可觀察到核變長、核內(nèi)空泡、核變圓、核質(zhì)斷裂、核不均等縊裂等異常(圖1)。不同濃度處理組的紅細(xì)胞核異常率結(jié)果如表4所示。對照組核異常率在不同處理時間之間差異不顯著(P>0.05)。而處理組的核異常率均顯著高于對照組，且總體上呈現(xiàn)質(zhì)量濃度、處理時間—效應(yīng)關(guān)系，即隨著Cr6+濃度增大、處理時間增加，紅細(xì)胞核異常率上升的趨勢。處理組中，核異常率最小值組為280 mg·L-1處理24 h，其值為(2.21±0.56)‰，為對照組的2.33倍；最大值組為433 mg·L-1處理96 h，其值為(10.13±1.23)‰，為對照組的9.56倍。此結(jié)果表明，Cr6+對牙鲆幼魚的紅細(xì)胞核具有明顯的損害作用。

表1 Cr6+對牙鲆仔魚和幼魚死亡率的影響Tab.1 Effects of Cr6+ on mortality of fry and fingerling of Paralichthys olivaceus

注：同一列不同小寫字母代表仔魚不同Cr6+濃度組間差異顯著(P≤0.05)；同一列不同大寫字母代表幼魚不同Cr6+濃度組間差異顯著(P≤0.05)

Note: Different lowercase letters within the same column represent significant differences between different Cr6+concentration groups of fry (P≤0.05); different capital letters within the same column represent significant differences between different Cr6+concentration groups of fingerling (P≤0.05)

表2 Cr6+對牙鲆仔魚的半致死濃度及其置信區(qū)間Tab.2 LC50 and confidence interval of Cr6+ to fry of Paralichthys olivaceus.

表3 Cr6+對牙鲆幼魚的半致死濃度及其置信區(qū)間Tab. 3 LC50 and confidence interval of Cr6+ to fingerling of Paralichthys olivaceus.

圖1 正常紅細(xì)胞和核異常紅細(xì)胞Fig. 1 Normal and nuclear abnormal erythrocyte of Paralichthys olivaceus注：a.正常紅細(xì)胞；b.核質(zhì)延長；c.核內(nèi)空泡；d.核變圓；e.核質(zhì)斷裂；f.核不均等縊裂Note: a. Normal erythrocyte; b. Nuclear prolongation; c. Intranuclear vacuoles; d.Nucler rounding; e. Nuclear fracture; f. Unequal nuclear crack

Cr6+ 濃度/(mg·L-1) Cr6+ concentration異常率/‰ Abnormal rates24 h48 h 72 h96 h00.95±0.21Aa0.96±0.43Aa0.98±0.52Aa1.06±0.33Aa2802.21±0.56Ba3.58±0.77Bb5.11±0.37Bc6.89±0.62Bd3242.85±0.79Ba4.94±1.25Cb6.56±0.83Cc8.57±0.79Cd3743.27±0.33Ba5.79±0.81Db7.82±1.77Cb9.89±0.60Dd4334.05±1.13Ca7.18±1.73Eb9.92±1.05Dc10.13±1.23Dc5006.32±0.85Da9.65±1.77Fb——

注：同一列不同大寫字母之間代表差異顯著(P≤0.05)；同一行不同小寫字母之間代表差異顯著(P≤0.05)

Note: Different capital letters within the same column represent significant differences (P≤0.05); different lowercase letters within the same line represent significant differences (P≤0.05)

2.5 Cr6+對牙鲆幼魚鰓的損傷

牙鲆鰓的結(jié)構(gòu)為硬骨魚類典型鰓結(jié)構(gòu)，由鰓弓和鰓絲兩大部分組成。鰓絲上含有諸多上皮細(xì)胞和支持細(xì)胞。對照組鰓組織較完整，表面較干凈(圖2-A)。在各處理組，隨著處理濃度和時間的增加，鰓組織發(fā)生明顯病理性變化，且表現(xiàn)出質(zhì)量濃度、處理時間—效應(yīng)關(guān)系。以433 mg·L-1組為例，在暴露24 h后，鰓小片的上皮細(xì)胞層增生使鰓小片呈棒狀，鰓小片上泌氯細(xì)胞增多，但上皮細(xì)胞層的結(jié)果仍較完整(圖2-B)；暴露48 h后，鰓小片上泌氯細(xì)胞進(jìn)一步增多，部分鰓小片的上皮細(xì)胞層與毛細(xì)血管分離形成空腔(圖2-C)；暴露72 h后，鰓絲末端一些部位甚至鰓小片基部的上皮層脫落，相鄰鰓小片的上皮細(xì)胞融合形成上皮細(xì)胞板；個別鰓小片頂端腫大呈球狀(圖2-D)；暴露96 h后，鰓組織結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步破壞，鰓小片頂端腫大和上皮細(xì)胞層破裂程度加重 (圖2-E)。由此可見，Cr6+可對牙鲆鰓造成損傷，從而影響其機(jī)能。

3 討論

本研究得出Cr6+對牙鲆仔魚96 hLC50為31.09 mg·L-1，安全濃度為16.05 mg·L-1；對幼魚96 hLC50為322.41 mg·L-1，安全濃度為115.91 mg·L-1。根據(jù)國家環(huán)?？偩炙霭娴摹端蛷U水監(jiān)測分析方法》(第四版)[16]中所描述的魚類急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)(表5)，Cr6+對牙鲆仔魚的毒性屬于中等毒性，而對幼魚的毒性為低等毒性。Cr6+對黃顙魚的危害等級為中等毒性[11]，對日本黃姑魚[12]和鮸魚[13]的危害等級則為高毒。同一污染物在不同物種上具有不同的毒性效應(yīng)，其潛在原因是多樣的。水體的溫度、pH、硬度、無機(jī)陰離子、絡(luò)合物以及魚體分泌物等物理、化學(xué)和生物因素會對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定的影響[17]。另外，受試魚所處的發(fā)育階段的不同，采用胚胎、仔魚、稚魚還是成魚進(jìn)行毒性實驗，也會對結(jié)果造成差異性影響。本研究采用牙鲆仔魚和幼魚開展實驗，兩者之間規(guī)格相差較大，所獲得的毒性等級也存在差異,從而為證實不同發(fā)育階段的實驗魚對結(jié)果會造成影響這一結(jié)論提供了證據(jù)。

表5 魚類急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[16]Tab. 5 Classification standard of fish acute virulence

有觀點認(rèn)為，在魚類中開展污染物的毒性效應(yīng)研究，要盡量以仔魚為實驗材料，這樣可以避免因試驗魚過大導(dǎo)致的檢測毒性數(shù)據(jù)偏高的問題[11]。但如果單純就某一生長階段的魚開展毒性檢測，會造成所獲得的實驗數(shù)據(jù)過于單一，無法獲得系統(tǒng)性的毒性數(shù)據(jù)，也無法綜合的開展毒性評估。因此，為了系統(tǒng)全面的獲得相關(guān)污染物對魚體的毒性效應(yīng)以及致毒機(jī)理，需要對處于不同生長階段的魚體開展染毒實驗，這樣獲得的數(shù)據(jù)才會更加全面和系統(tǒng)，才能更好的為對污染物毒性效應(yīng)評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

鰓是魚類與外界水環(huán)境直接接觸的呼吸器官，其組織完整性對正常發(fā)揮功能以及魚體的健康存活具有重要意義。大量研究表明，金屬離子的過度暴露，會造成魚鰓諸如鰓小片上皮細(xì)胞增生和脫落、上皮細(xì)胞層與毛細(xì)血管分離形成空腔、上皮細(xì)胞層融合和壞死等損傷[18-20]。類似的損傷病變在本研究中均被觀察到，從一個側(cè)面證明了不同金屬離子對魚類鰓組織所造成損傷具有一致性。重金屬處理造成魚類鰓組織損傷的機(jī)理，可能是因處理導(dǎo)致魚體產(chǎn)生過多的自由基團(tuán)，破壞了鰓的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致鰓中抗氧化活力下降，脂質(zhì)過氧化物增加，從而造成鰓結(jié)構(gòu)的改變[21]。但在另外一方面，這種損傷也是魚類對重金屬脅迫的一種自我保護(hù)機(jī)制，可有效減少魚體與重金屬的接觸，增加了重金屬脅迫環(huán)境下的生存幾率[22]。在以后的研究中，需要在分子層面上深入開展包含鰓在內(nèi)的金屬離子對魚類組織器官損傷的機(jī)理研究，為全面系統(tǒng)的解析金屬離子的毒性機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

圖2 牙鲆幼魚鰓組織切片F(xiàn)ig. 2 Histology sections of gill in fingerling of Paralichthys olivaceus注：A：對照組；B：433 mg·L-1處理24 h組(箭頭指泌氯細(xì)胞)；C: 433 mg·L-1處理48 h組(箭頭指空腔病變)；D: 433 mg·L-1處理72 h組(箭頭指頂端腫大病變，星號指空腔病變)；E: 433 mg·L-1處理96 h組(箭頭指頂端腫大病變)。比例尺=20 μmNote: A: Control; B: Exposed to 433 mg·L-1 Cr6+ solution for 24 h (arrow indicates the chloride cell); C: Exposed to 433 mg·L-1 Cr6+ solution for 48 h (arrow indicates the cavity); D: Exposed to 433 mg·L-1 Cr6+ solution for 72 h (arrow indicates the apical swelling, asterisk indicates the cavity); E: Exposed to 433 mg·L-1 Cr6+ solution for 96 h (arrow indicates the apical swelling).Scale bar = 20 μm