基于線粒體D-loop序列的長(zhǎng)江口中華鱘幼魚遺傳多樣性分析

孫麗婷,趙 峰,張 濤,紀(jì) 嚴(yán),莊 平

(1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江口漁業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

中華鱘(Acipensersinensis)屬鱘形目(Acipenseriformes)，鱘科(Acipenseridae)，鱘屬，為我國一級(jí)水生野生保護(hù)動(dòng)物，是一種典型的江海洄游型魚類，生活史極其復(fù)雜。每年6—8月，性腺發(fā)育至Ⅲ期的成體由東海經(jīng)長(zhǎng)江口，洄游進(jìn)入長(zhǎng)江，于翌年的10—11月在上游產(chǎn)卵場(chǎng)進(jìn)行繁殖，產(chǎn)后親魚即返回海洋[1]。仔魚孵化后順流而下，在翌年4月末至5月初時(shí)到達(dá)長(zhǎng)江口，經(jīng)過4～5個(gè)月的索餌肥育于8月末至9月初洄游進(jìn)入海洋生活[2]。20世紀(jì)中后期以來，由于大型水利工程修建、水體污染和過度捕撈等因素的影響，中華鱘野生種群呈衰退趨勢(shì)，洄游至葛洲壩下產(chǎn)卵場(chǎng)的繁殖群體呈現(xiàn)出數(shù)量下降、雌雄性比失衡、繁殖頻次下降、繁殖規(guī)模減小和產(chǎn)卵活動(dòng)延遲等現(xiàn)象[3-7]。近年來，中華鱘野生種群衰退的趨勢(shì)進(jìn)一步加劇。2010年，世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)將中華鱘列入瀕危物種紅色名錄極危(CR)物種行列。2013年以來，每年到達(dá)葛洲壩下產(chǎn)卵場(chǎng)的繁殖群體已不足50尾[8]。更為嚴(yán)重的是，2013年、2015年和2017年的繁殖季節(jié)，均未監(jiān)測(cè)到自然繁殖活動(dòng)，僅2014年和2016年發(fā)生自然繁殖，野生種群出現(xiàn)了偶發(fā)產(chǎn)卵現(xiàn)象[7]。

遺傳多樣性是保護(hù)生物學(xué)研究的核心之一，及時(shí)了解和掌握物種種內(nèi)遺傳變異的大小、時(shí)空分布及其與環(huán)境的關(guān)系，有助于采取科學(xué)有效的措施對(duì)瀕臨滅絕的物種加以保護(hù)和拯救。已有研究表明，無論是在蛋白質(zhì)水平還是核DNA水平，中華鱘野生群體的遺傳多樣性比洄游魚類的平均水平偏低[9-11]；葛洲壩截流以后，中華鱘野生幼魚群體的遺傳多樣性又進(jìn)一步降低[12]。近幾年微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)顯示，中華鱘野生幼魚群體的遺傳結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定[13]。本研究利用線粒體控制區(qū)(mitochondrial control region, D-loop)序列分析技術(shù)，研究了2015年和2017年長(zhǎng)江口野生中華鱘幼魚的遺傳多樣性，旨在及時(shí)了解和掌握長(zhǎng)江口中華鱘野生幼魚的遺傳多樣性狀況并推算參與自然繁殖的雌性親本數(shù)量，為相關(guān)物種保護(hù)和管理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

利用2015年和2017年春夏季在上海崇明長(zhǎng)江口東灘及其臨近水域監(jiān)測(cè)及漁民誤捕的野生中華鱘幼魚為實(shí)驗(yàn)樣本(表1)。誤捕死亡的個(gè)體取背部肌肉，存活的個(gè)體取鰭條，分別保存于無水乙醇備用。

表1 野生中華鱘幼魚樣本Tab.1 Samples of wild juvenile Acipenser sinensis

1.2 基因組DNA的提取

取肌肉(鰭條)約100 mg，使用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(北京，天根生化科技有限公司)提取總DNA，-20 ℃保存。

1.3 線粒體D-loop序列的PCR擴(kuò)增、純化與測(cè)序

使用引物DL: 5′CAAGAACACAAGATTAAT GAG3′ ; H740: 5′ GATCAAGGTATGTCGATGACA 3′[14]，擴(kuò)增中華鱘的mtDNA 的D-loop部分序列。PCR 總反應(yīng)體系為25 μL，其中包括：10×PCR buffer 5 μL, dNTP 4 μL (2.5 mmol·L-1)，上下游引物各1 μL (10 mmol·L-1),TaqDNA 聚合酶0.8 μL (5 U·μL-1)，模板DNA 1μL, 加雙蒸水至總體積 25 μL。樣品在AG-22331 型PCR 儀(Eppendorf) 上進(jìn)行擴(kuò)增, 94 ℃ 預(yù)變性 5 min; 94 ℃ 30s, 51 ℃ 45s, 72℃ 1min, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃ 延伸10 min; 4 ℃ 保存。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行膠回收雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用BLAST在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Clustal X[15]對(duì)序列進(jìn)行對(duì)位排列并結(jié)合人工核查與校正。利用DnaSP5.0軟件[16]確定單倍型數(shù)目及分布、核苷酸多樣性等。MEGA5.1[17]計(jì)算其堿基含量、變異位點(diǎn)數(shù)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)、群體內(nèi)及群體間的遺傳距離。使用MEGA5.1軟件[17]中的鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)生聚類樹，單倍型聚類樹中節(jié)點(diǎn)處的置信度用Bootstrap 1000次重復(fù)檢驗(yàn)。利用Arlequin3.1[18]進(jìn)行分子變異方差分析(AMOVA)評(píng)估群體間的遺傳變異。使用分化指數(shù)(Fst)[19]評(píng)價(jià)群體間的遺傳差異，使用1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)群體間Fst的顯著性。群體間的基因流通過公式Nm= (1-Fst)/(4Fst)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異特征

2個(gè)年度830個(gè)野生中華鱘幼魚的線粒體D-loop區(qū)可比序列長(zhǎng)度為462 bp，變異位點(diǎn)26個(gè)(包括插入和缺失位點(diǎn))，變異比率5.63%，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)8個(gè)，單變異位點(diǎn)18個(gè)，變異多為轉(zhuǎn)換和顛換，有1個(gè)插入缺失位點(diǎn)(圖1)。4種堿基C、T、A和G的平均含量分別為17.54%、32.22%、26.83%和23.41%。中華鱘幼魚線粒體D-loop的堿基組成具有較大的偏向性，C的含量顯著低于其它3種堿基的含量，A + T(59.05%)含量顯著高于G + C(40.95%)。

圖1 中華鱘線粒體控制區(qū)序列的變異位點(diǎn)Fig.1 Variable nucleotide sites of mtDNA D-loop of Acipenser sinensis

2.2 單倍型分布及遺傳關(guān)系

在2015年的672個(gè)樣本中檢測(cè)到11個(gè)單倍型，2017年158個(gè)樣本中檢測(cè)到8個(gè)單倍型，2個(gè)年度個(gè)體的單倍型分布如圖2所示。2個(gè)年度間共享單倍型有3個(gè)，占單倍型總數(shù)的18.75%； 2015年個(gè)體擁有8個(gè)特有單倍型，其中Hap5的出現(xiàn)頻次最高，共221個(gè)，占32.89%，Hap8和Hap11均只有1個(gè)個(gè)體。2017年個(gè)體擁有5個(gè)特有單倍型，其中Hap12出現(xiàn)的頻次最高，共31個(gè)，占19.62%。

2.3 中華鱘的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

中華鱘2個(gè)年份樣本間的遺傳多樣性參數(shù)見表2。2015年樣本共11個(gè)單倍型，單倍型多樣性(h)0.799±0.008，核苷酸多樣性(π)0.009 3±0.005 1，平均核苷酸差異數(shù)4.005；2017年樣本共8個(gè)單倍型，單倍型多樣性(h)0.848±0.008，核苷酸多樣性(π)0.012 3±0.006 6，平均核苷酸差異數(shù)5.081，2017年幼魚的遺傳多樣性略高于2015年。

從遺傳距離來看，2015年與2017年幼魚樣本間的遺傳距離為0.0102，沒有明顯的分化現(xiàn)象；各單倍型之間的平均遺傳距離為0.0124。兩個(gè)年度樣本間的Fst值為0.0830 4(表3)，基于Fst計(jì)算年度樣本間的基因流Nm為2.76。AMOVA分子變異方差分析表明，長(zhǎng)江口野生中華鱘幼魚兩個(gè)年度群體間的變異為8.30%，群體內(nèi)變異為91.70%，群體內(nèi)變異大于群體間變異。

圖2 中華鱘16個(gè)單倍型的分子系統(tǒng)樹及其分布Fig.2 Distribution of 16 haplotypes between 2 populations of Acipenser sinensisand its NJ molecular phylogenetic tree注：節(jié)點(diǎn)數(shù)字表示>50%的Bootstrap 支持率；括號(hào)內(nèi)為樣本數(shù)(2015/2017)Note: Numbers at nodes indicate bootstrap values greater than 50% with 1000 replicates， and the sample sizes are given in parentheses (2015/2017)

表2 野生中華鱘幼魚的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Parameters of genetic diversity of wild juvenile Acipenser sinensis

表3 中華鱘群體的AMOVA分析結(jié)果Tab.3 Results of AMOVA for Acipenser sinensis populations

注：Va、Vb分別表示群體間變異和群體內(nèi)變異

Note:Va,Vbmean variations among populations and within populations

3 討論

3.1 中華鱘的繁殖群體規(guī)模

mtDNA遵循嚴(yán)格的母系遺傳，一般不發(fā)生重組，后代能夠完整的保存母本遺傳信息，mtDNA一個(gè)單倍型即可代表一個(gè)母系集團(tuán)，較少的樣本就能反應(yīng)群體的遺傳結(jié)構(gòu)[20]。根據(jù)2015年和2017年長(zhǎng)江口中華鱘幼魚線粒體DNA的D-loop區(qū)序列單倍型數(shù)量，我們推測(cè)2014年參與自然繁殖的雌性親魚數(shù)量至少有11尾，2016年至少有8尾。廖小林等[21]對(duì)2016年采集的95顆中華鱘受精卵測(cè)序分析顯示，壩下產(chǎn)卵場(chǎng)至少有10尾雌魚參與了自然繁殖，本研究結(jié)果與之相差不大。

調(diào)查顯示，2014年長(zhǎng)江葛洲壩下游宜昌江段的中華鱘繁殖群體數(shù)量為57尾，2016年繁殖季節(jié)產(chǎn)卵場(chǎng)水聲學(xué)探測(cè)數(shù)量為48尾[8]。根據(jù)歷史數(shù)據(jù)葛洲壩下中華鱘繁殖群體的雌雄性比為5.86∶1[3]，推算出2014年的57尾親魚中約有49尾雌魚，8尾雄魚；2016年的48尾親魚中約有41尾雌魚，7尾雄魚。葛洲壩截流后，到達(dá)壩下產(chǎn)卵場(chǎng)的親魚出現(xiàn)了不同程度的性腺退化現(xiàn)象[22-23]，繁殖群體的性腺成熟比例從截流前的35%～50%[24]下降到10%～30%[25]，據(jù)此計(jì)算得到2014年參與自然繁殖的雌性親鱘在5～15尾，2016年4～12尾，本研究與計(jì)算結(jié)果較為吻合。

根據(jù)長(zhǎng)江口幼魚監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，2015年幼魚到達(dá)長(zhǎng)江口的規(guī)模大，數(shù)量多達(dá)上千尾[8]，而2017年春夏到達(dá)長(zhǎng)江口的中華鱘幼魚規(guī)模較小。根據(jù)本研究的結(jié)果，2017年參與自然繁殖的雌性親本數(shù)量略小于2015年，與監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)相符。葛洲壩截流初期壩下產(chǎn)卵場(chǎng)調(diào)查顯示，在1983—1985年，年均有26尾親鱘參加產(chǎn)卵，性比穩(wěn)定在1∶1左右，1986年后每年有30～40尾親魚在壩下產(chǎn)卵[26]。當(dāng)前壩下產(chǎn)卵場(chǎng)參與產(chǎn)卵的雌性親魚在10尾左右，性比失衡，中華鱘自然繁殖群體規(guī)模下降趨勢(shì)明顯；2005—2013年間，長(zhǎng)江口中華鱘幼魚的補(bǔ)充量波動(dòng)劇烈，總體呈下降趨勢(shì)[27]；近兩年發(fā)生偶發(fā)產(chǎn)卵現(xiàn)象后，長(zhǎng)江口中華鱘幼魚資源豐欠差異明顯，中華鱘的群體補(bǔ)充岌岌可危。

3.2 中華鱘群體的遺傳多樣性

從線粒體D-loop區(qū)序列分析來看，2015年和2017年長(zhǎng)江口中華鱘幼魚的平均單倍型多樣性為0.857 ± 0.006，平均核苷酸多樣性為0.010 2± 0.005 5。其中，2017年野生幼魚的遺傳多樣性略高于2015年的野生幼魚群體。已有研究表明，1995—2000年間長(zhǎng)江中野生中華鱘繁殖群體(該樣本能代表葛洲壩截流前的中華鱘野生群體)的線粒體D-loop區(qū)平均單倍型多樣性為0.949±0.010，平均核苷酸多樣性為0.011±0.006[28]。與之相比，當(dāng)前野生中華鱘群體的遺傳多樣性低于截流前，但仍然具有較高的遺傳多樣性水平。中華鱘個(gè)體生活周期長(zhǎng)達(dá)十幾年，甚至幾十年，生活史極其復(fù)雜。在其生活史中，個(gè)體初次性成熟的時(shí)間不同，同一世代的不同個(gè)體進(jìn)行生殖洄游的時(shí)間不一致，同年到達(dá)產(chǎn)卵場(chǎng)的繁殖群體的年齡和世代結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜[3]；在進(jìn)行首次繁殖后有數(shù)年的繁殖間期[29]，相鄰2～3年間群體的相似性很小，這樣會(huì)極大地降低近交衰退的幾率，這對(duì)中華鱘有效維持種群遺傳多樣性起到重要作用。由于親本數(shù)量極少，不同年度間繁殖群體的差異，可能也是造成2015年與2017年幼魚樣本遺傳多樣性差異的原因。

從單倍型分析來看，2個(gè)年份的中華鱘幼魚群體具有共享單倍型，說明其可能在歷史上具有共同的母本。AMOVA分析顯示，年度樣本間的變異為8.30%，群體內(nèi)的變異為91.70%，群體內(nèi)變異大于群體間的變異，單倍型之間的平均遺傳距離(0.012 4)略高于年度樣本之間的遺傳距離(0.010 2)。以上結(jié)果均表明，中華鱘作為一個(gè)單一種群，其遺傳變異主要來源于群體內(nèi)。在張四明等[29]的研究中，截流前的野生中華鱘群體年度樣本之間沒有明顯的分化現(xiàn)象；趙娜等[11]通過對(duì)等位基因的分布進(jìn)行聚類運(yùn)算也得到，中華鱘群體的年度樣本之間差異小，遺傳差異主要存在群體內(nèi)。這種遺傳結(jié)構(gòu)能夠使中華鱘種群的遺傳多樣性水平得以維持，不致因某一世代繁殖受阻或數(shù)量減少而驟降，有助于維持種群的遺傳多樣性。本研究中，2015年與2017年群體之間Fst為0.083 04 (0.05

盡管目前野生中華鱘種群仍然維持著相對(duì)較高的遺傳多樣性，但從已有研究可以看出，相比長(zhǎng)江葛洲壩截流前，2000年時(shí)長(zhǎng)江口中華鱘幼魚遺傳多樣性水平已然在下降[12]，2015年的微衛(wèi)星標(biāo)記研究結(jié)果也證實(shí)了野生中華鱘幼魚的遺傳多樣性水平逐漸降低的趨勢(shì)[31]。當(dāng)前日漸衰竭的種群資源量，勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致群體中發(fā)生遺傳漂變和遺傳多樣性的逐漸喪失，中華鱘面臨滅絕的危險(xiǎn)，恢復(fù)野生中華鱘種群資源迫在眉睫。通過分子生物學(xué)手段了解中華鱘現(xiàn)有種群遺傳結(jié)構(gòu)，以確定保護(hù)單元，建立人工種群并對(duì)其進(jìn)行遷地保護(hù)。在當(dāng)前的全人工繁殖技術(shù)和保護(hù)遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上，可在不同的養(yǎng)殖環(huán)境中建立不同的人工種群，互相補(bǔ)充，保證人工種群的遺傳多樣性，以保存中華鱘的種質(zhì)資源。

致謝：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所馬春艷副研究員、汕頭大學(xué)馬洪雨教授在實(shí)驗(yàn)過程中給予很大的幫助，一并表示感謝!