基于線粒體Cytb序列的伯氏肩孔南極魚群體遺傳結(jié)構(gòu)初步分析

趙 娜，馬春艷，宋 煒，馮春雷，王魯民，張鳳英，蔣科技，趙憲勇，馬凌波

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090; 2. 上海海洋大學(xué),上海 200090;3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071)

在大約5億9千萬年前的前寒武季后期，超級大陸岡瓦納還包括南極洲、非洲、南美洲、澳大利亞、印度和阿拉伯半島[1]。自中生代晚期，劇烈的大陸板塊活動使得超級大陸岡瓦納開始逐漸解體，幾個大洲開始分離開來，到了新生代時期南極大陸經(jīng)過緩慢的漂移，逐漸到了現(xiàn)在的地理位置[2]。在南極大陸逐漸漂移的過程中，整個南極大陸的氣候開始逐漸變冷，慢慢被冰雪覆蓋[3-4]。南大洋的水溫在南極大陸逐漸漂移過程中，水溫不斷降低，許多生物走向滅絕，僅有少數(shù)能夠適應(yīng)低溫的生物存活了下來，南極魚類為了適應(yīng)低溫環(huán)境，種群進(jìn)行了相應(yīng)的改變，生物多樣性也發(fā)生了改變。南極大陸被南大洋分割開來，環(huán)繞南極的南極繞極流( Antarctic Circumpolar Current, ACC)，阻礙了南極海域與其它海域的聯(lián)系，對南極魚類的種群遺傳具有一定的影響。

南極魚類在始新世到現(xiàn)在的4000萬年內(nèi)發(fā)生了顯著性的變化[5]。雖然南大洋僅僅占了全世界海洋面積的10%，現(xiàn)有的魚類有322種[6]。伯氏肩孔南極魚(Trematomusbernacchii)屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)，鱸形目(Perciformes)，南極魚亞目(Notothenioide)，南極魚科(Notothenioidei)，肩孔南極魚屬，是一種廣泛分布于南極附近的適應(yīng)寒冷環(huán)境的魚類，因其在寒冷條件下的適應(yīng)性機(jī)制和自適應(yīng)輻射具有重要的科學(xué)研究價值以及其經(jīng)濟(jì)價值而引起了世界范圍的關(guān)注[7]。目前，關(guān)于伯氏肩孔南極魚遺傳多樣性、遺傳分化和種群歷史動態(tài)等方面的研究報道較少。本研究采用mtDNA細(xì)胞色素b(Cytb)基因序列的分析技術(shù)，研究分析了南極地區(qū)伯氏肩孔南極魚的種群遺傳結(jié)構(gòu)及其多樣性與種群歷史動態(tài)，以期為更好地保護(hù)該魚種野生種群、促進(jìn)其資源的可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的伯氏肩孔南極魚分別采自位于羅斯海(LSH)、凱西站(KXZ)、長城站(CCZ)、戴維斯站(DWSZ)和中山站(ZSZ)的5個采樣點(diǎn)(表1)。樣品采集的時間、地點(diǎn)以及數(shù)量見圖1與表1。樣品采集后先對樣品進(jìn)行形態(tài)鑒定，在-20 ℃條件下冷凍保存運(yùn)回到實(shí)驗(yàn)室。

表1 伯氏肩孔南極魚的采集樣品數(shù)Tab.1 Sample number of Trematomus bernacchii in each location

圖1 伯氏肩孔南極魚取樣地點(diǎn)圖Fig.1 Sampling sites of Trematomus bernacchii注:CCZ:長城站，LSH:羅斯海，KXZ:凱西站，DWSZ:戴維斯站，ZSZ:中山站Note:CCZ:Great Wall Station，LSH:Ross Sea，KXZ:Casey Station，DWSZ:Davis station，ZSZ:Zhongshan Station

1.2 伯氏肩孔南極魚mtDNA Cytb 序列的擴(kuò)增與測序

取伯氏肩孔南極魚背部肌肉或鰭部約100 mg，使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(北京，天根生化科技有限公司)提取總DNA。

1)Cytb引物使用自行設(shè)計的引物如下所示：

CF1/R1：CCGAAACTGTCCTTGGTGTGAG、GAGTGAGGGTGGCGTTATCTAC

CF2/R2：ACCTCCCCGCTCCATCTAAT、TACCCCCCCAAGTTTGTCTG

CF3/R3：AGGGGGGTTTTCGGTAGATA、TTTAGGGTCCTGGGGGCTTC

2)PCR在25μL的反應(yīng)體系中執(zhí)行，其中包括：

2xTaqPCR Master-Mix 12.5 μL

上游引物(10mmol·L-1) 1 μL

下游引物(10mmol·L-1) 1 μL

模板DNA 1 μL

去離子水 9.5 μL

3)PCR反應(yīng)條件為：

預(yù)變性 94℃ 5min；

變性 94℃ 30s

退火 54℃ 45s

延伸 72℃ 1min；

第二階段循環(huán)35次

總延伸 72℃ 7min

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測質(zhì)量和大小后，由JIE LI BILOGY進(jìn)行正向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Clustal X[8]對序列進(jìn)行對位排列, 并結(jié)合人工核查與校正。單倍型數(shù)目及分布、核苷酸多樣性使用DnaSP 5.1[9]軟件確定。用MEGA 5.1[10]軟件按照Kimura-2-parameter[11]進(jìn)化模型來構(gòu)建單倍型鄰接關(guān)系樹, 系統(tǒng)樹的可靠性采用1000次重復(fù)抽樣評估，并計算群體內(nèi)的遺傳距離。

使用Arlequin 3.1[12]軟件的分子變異分析[13](AMOVA)來評估群體間遺傳變異，通過1000次重復(fù)抽樣來檢驗(yàn)不同遺傳結(jié)構(gòu)水平上的協(xié)方差的顯著性，按樣本的地理來源將5個群體分為1個組群，并采用Exact檢驗(yàn)檢測單倍型在兩兩群體間分布頻率的差異來評價群體間的遺傳分化[14]。上述分析均由Arlequin 3.1軟件計算，群體間的遺傳距離采用Kimura-2-parameter模型計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異特征分析

本實(shí)驗(yàn)共得到了5個群體98尾伯氏肩孔南極魚的線粒體，Cytb基因全序列長度為1 141 bp，無堿基的插入與缺失，轉(zhuǎn)換替代明顯多于顛換，大多數(shù)變異發(fā)生在密碼子第3位(79.73%)，第1位(10.81%)和第2位(9.46%)的變異較低。其突變位點(diǎn)為75個，變異比率為6.57%，其中單一信息位點(diǎn)47個，占4.12%，簡約信息位點(diǎn)28個，占2.45%。4個堿基A、T、C和G的平均頻率分別為20.6%、32.4%、26.7%和20.3%，其中G的堿基含量低于其它3種堿基含量，A+T(53%)的出現(xiàn)頻率高于C+G(47%)，表現(xiàn)出了其堿基組成具有偏向性。

2.2 單倍型在群體中的分布及遺傳關(guān)系

98個個體中共檢測到27種單倍型，所得單倍型已全部提交到GenBank，登錄號為(MF664438～MF664464 )。伯氏肩孔南極魚27種單倍型在5群體中的分布如表2所示。群體間共享單倍型4個，占單倍型總數(shù)的14.81%，剩余23個均為某個群體所特有，在共享單倍型中Hap2為5個群體所共有，Hap4為4個群體所共有(除羅斯海外)，Hap7為凱西站和戴維斯站所共有，Hap23為凱西站和中山站所共有，各個站點(diǎn)存在共享單倍型，說明其親緣關(guān)系較近，各地理種群具有一定的基因交流，是一個隨機(jī)交配的群體。伯氏肩孔南極魚5個群體的遺傳多樣性數(shù)據(jù)見表3，98尾伯氏肩孔南極魚的單倍型多樣性為0.685 90±0.002 36，核苷酸多樣性為0.002 59±0.013 43，遺傳多樣性較高。核苷酸多樣性分析表明(表3)中山站核苷酸遺傳多樣性較高，大于0.004。

2.3 種群遺傳距離與遺傳分化

從5個伯氏肩孔南極魚地理群體的遺傳距離(表4)來看，群體內(nèi)的平均遺傳距離在0.001 254～0.010 199，群體間的平均遺傳距離在0.001 733～0.007 140。結(jié)果表明，5個群體間的平均遺傳距離與群體內(nèi)的平均遺傳距離處于同一水平。

表2 伯氏肩孔南極魚27種單倍型在5個群體中的分布及其分子系統(tǒng)樹Tab.2 Distribution of 27 haplotypes among 5 Trematomus bernacchii populations and its NJ molecular phylogenetic tree

注:節(jié)點(diǎn)數(shù)字表示大于50%的Bootstrap支持率;CCZ:長城站，LSH:羅斯海，KXZ:凱西站，DWSZ:戴維斯站，ZSZ:中山站

Note:Numbers at nodes indicate bootstrap values greater than 50% with 1000 replicates;CCZ:Great Wall Station，LSH:Ross Sea，KXZ:Casey Station，DWSZ:Davis Station，ZSZ:Zhongshan Station

表3 不同群體伯氏肩孔南極魚的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Parameters of genetic diversity of different populations of Trematomus bernacchii

注:CCZ:長城站，LSH:羅斯海，KXZ:凱西站，DWSZ:戴維斯站，ZSZ:中山站

Note:CCZ:Great Wall Station，LSH:Ross Sea，KXZ:Casey Station，DWSZ:Davis station，ZSZ:Zhongshan Station

在群體遺傳學(xué)中兩兩之間的遺傳分化指數(shù)一般分布在-1～1之間，遺傳分化系數(shù)(Fst)越大表示群體間的分化程度越高[15]。伯氏肩孔南極魚的5個群體間的Fst在-0.002 450～ 0.190 380之間(表4)，5個群體間的遺傳分化水平較低(Fst= -0.018 300～0.190 380，P>0.05)。AMOVA分析表明大部分的遺傳變異來自于種群內(nèi)部，只有少數(shù)遺傳變異來自于種群之間，并且Φstatistics為正值。Exact檢驗(yàn)表明，單倍型在群體間分布頻率的差異顯著(P=0.001 96)，說明其種群之間存在基因交流。

2.4 中性進(jìn)化分析

5個伯氏肩孔南極魚群體的中性檢驗(yàn)分析結(jié)果見表3。Tajima’s D檢驗(yàn)的結(jié)果表明除戴維斯站(DWSZ)外均為負(fù)值，凱西站(KXZ)為極顯著差異(P<0.01)，中山站(ZSZ)顯著性差異(P<0.05)，其它群體均為不顯著差異(P>0.05)。中山站(ZSZ)顯著的偏離突變-漂變平衡(P<0.05)，凱西站(KXZ)極顯著的偏離突變-漂變平衡(P<0.01)。

圖2 基于K-2-P遺傳距離的伯氏肩孔南極魚5個群體之間的UPGMA樹Fig.2 UPGMA tree of 5 Trematomus bernacchii populations built under K-2-P genentic distance注:CCZ:長城站，LSH:羅斯海，KXZ:凱西站，DWSZ:戴維斯站，ZSZ:中山站Note:CCZ:Great Wall Station，LSH:Ross Sea，KXZ:Casey Station，DWSZ:Davis Station，ZSZ:Zhongshan Station

群體PopulationKXZLSHCCZDWSZZSZKXZ 0.001 9800.001 830 0.001 733 0.003 104 0.005 875LSH0.039 640 0.001 254 0.001 7350.003 221 0.005 912CCZ0.190 380 0.097 110 0.010 1990.003 031 0.005 851DWSZ -0.002 450 0.156 2800.071 790 0.001 6590.007 140ZSZ0.011 1500.011 940 0.013 940-0.018 300 0.004 584

注:CCZ:長城站，LSH:羅斯海，KXZ:凱西站，DWSZ:戴維斯站，ZSZ:中山站

Note:CCZ:Great Wall Station，LSH:Ross Sea，KXZ:Casey Station，DWSZ:Davis Station，ZSZ:Zhongshan Station

表5 伯氏肩孔南極魚群體遺傳差異的 AMOVA 分析Tab.5 Analysis of molecular variance (AMOVA) among populations of Trematomus bernacchii

Fu’s 檢驗(yàn)凱西站(KXZ)、羅斯海(LSH)和戴維斯站(DWSZ)群體為正值，長城站(CCZ)和中山站(ZSZ)群體為負(fù)值，且除凱西站(KXZ)外其余均無顯著性差異(P>0.05)，F(xiàn)s值的顯著性表明凱西站極顯著的偏離突變-漂變平衡(P<0.01)，F(xiàn)s是負(fù)值，并且顯著的偏離中性(P<0.05)，則有可能是群體擴(kuò)張導(dǎo)致的。伯氏肩孔南極魚群體的D值和Fs均為負(fù)值，且具有極顯著的差異(P<0.01)，因此可以推斷出其可能經(jīng)歷了種群的快速爆發(fā)與擴(kuò)張事件。

2.5 歷史統(tǒng)計分析

將本實(shí)驗(yàn)中的5個群體進(jìn)行錯配分析，得到不同的頻率分布形狀圖，展現(xiàn)了伯氏肩孔南極魚群體的種群歷史多樣性，其中SSD和Raggedness值較大且不存在顯著差異(P<0.05)。群體擴(kuò)張參數(shù)τ為1.723 74，參考線粒體Cytb的進(jìn)化速率為每百萬年0.9%～1.2%，伯氏肩孔南極魚的性成熟年齡為8年[16]，根據(jù)公式T=τ/2u，得到該種群的擴(kuò)張時間大約為9.84-10.49萬年前，大約是中更新世時期，該時期氣候寒冷，有冰期與間冰期的明顯交替[17]。

3 討論

3.1 遺傳多樣性

通過研究Cytb的完整序列基因分析了南極地區(qū)5個伯式肩孔南極魚地理群體的遺傳多樣性，研究結(jié)果以在一定的程度上反映伯氏肩孔南極魚資源的遺傳背景。有些群體數(shù)量較少，主要是由于南極魚類比較難獲取樣本，統(tǒng)計分析表明用于群體分析數(shù)量最少為5個，5個樣本即可以對數(shù)據(jù)進(jìn)行溯祖分析[18]。測序后得到的序列長度為1 141 bp，無堿基的插入與缺失，轉(zhuǎn)換替代明顯多于顛換，大多數(shù)變異發(fā)生在密碼子第3位(79.73%)。整個群體單倍型多樣性較高(H=0.685 90±0.002 36)、核苷酸多樣性較低(Pi=0.002 59±0.013 43)的模式，這種模式揭示其出現(xiàn)過種群瓶頸效應(yīng)[19]，這與在銀鯧(Pampusargenteus)[20]、松江鱸(Trachidermusfasciatus)[21]、小黃魚(Larimichthyspolyactis)[22]等研究中得到的結(jié)果相似。相比同生活在南大洋的物種來說，如南極東部沿岸貝氏肩孔南極魚(H=0.994，Pi=0.012 71)及尼氏肩孔南極魚(H=0.978，Pi=0.004 58)，都與伯氏肩孔南極魚群體有著相似的遺傳多樣性。貝氏肩孔南極魚和尼氏肩孔南極魚都屬于GRANT等[19]劃分的第二類遺傳模式，而高H低Pi的現(xiàn)象是由于有效種群數(shù)量較少，此后經(jīng)歷一個快速的擴(kuò)張期，積累了較多的變異，然而仍未積累大量序列變異造成[23]。在冰期魚類可能面臨惡劣的環(huán)境導(dǎo)致種群數(shù)量下降經(jīng)歷瓶頸期，冰期之后由于環(huán)境適宜，種群呈現(xiàn)爆炸式擴(kuò)散，快速積累遺傳變異，因此伯氏肩孔南極魚是一個大的隨機(jī)交流的群體。

圖3 不同站點(diǎn)的伯氏肩孔南極魚群體之間的錯配分析Fig.3 Mismatch distribution of populations of Trematomus bernacchii from different sites注:a，凱西站；b，羅絲海；c，長城站；d，戴維斯站；e，中山站Note:a，Casey Station；b，Ross Sea：c，Great Wall Station；d，Davis Station；e，Zhongshan Station

3.2 遺傳結(jié)構(gòu)與分化

從魚類對環(huán)境的適應(yīng)能力、對生態(tài)的適應(yīng)性進(jìn)化能力以及對自然選擇的效應(yīng)等方面能分析出種群的遺傳結(jié)構(gòu)[24]。伯氏肩孔南極魚的NJ樹顯示，該種群是一個隨機(jī)交配的群體，5個群體間的遺傳分化水平較低(Fst= -0.018 30～0.190 38，P>0.05)，不存在顯著的遺傳分化現(xiàn)象，遺傳距離相近，即不存在地理分布的譜系，這與UPGMA樹得到的結(jié)構(gòu)一致并與大多數(shù)的海洋性魚類在非常廣泛的地理范圍內(nèi)不存在顯著的遺傳差異的結(jié)果一致[19,25]。產(chǎn)生此現(xiàn)象的一個主要原因可能是由于南大洋存在南極繞極流，有助于伯氏肩孔南極魚魚卵的擴(kuò)散，各個群體之間可以進(jìn)行交流。魚類在屬、種和種群3級水平上的遺傳距離值分別為0.9、0.3和0.05[26]。5個群體之間的遺傳距離在0.001 252～0.009 991之間，均小于0.05，表明其采樣點(diǎn)之間的分化尚未達(dá)到種群水平。AMOVA分析的結(jié)果也同樣顯示了變異主要來自種群內(nèi)部，而整個大的群體中不存在分化現(xiàn)象。

3.3 種群的歷史動態(tài)分析

種群在歷史上所經(jīng)歷的變化主要是通過單倍型多樣性與核苷酸多樣性來推測，根據(jù)GRANT等[19]提出的歷史事件的4個假設(shè)來看，伯氏肩孔南極魚線粒體Cytb基因?qū)儆诘?種類型，這一類型的種群在歷史過程中發(fā)生過瓶頸效應(yīng)或者奠基者效應(yīng)，在此之后由一個小的群體迅速擴(kuò)張與爆發(fā)。Tajima’sD和Fu’s檢驗(yàn)結(jié)果顯示在凱西站出現(xiàn)了極顯著差異(P<0.01)，其余群體無顯著性差異(P>0.05)，這可能與樣本本身較難獲取，數(shù)量上有所差異，導(dǎo)致結(jié)果存在差別。5個群體除羅斯海外其余采樣點(diǎn)在錯配分析圖中均有小的峰值出現(xiàn)，可能預(yù)示了在這些地區(qū)存在一個比較年輕的祖先系統(tǒng)，值得注意的是羅斯海這一采樣點(diǎn)無此現(xiàn)象，可能是由于除了本身環(huán)境中的南極繞極流的存在，該地區(qū)的洋流還存在自身的漩渦現(xiàn)象，還需要進(jìn)一步的實(shí)地考察。根據(jù)公式得到該種群的擴(kuò)張時間大約為9.84～10.49萬年前，大約是中更新世時期，該時期氣候寒冷，有冰期與間冰期的明顯交替，氣候條件的變化使整個群體經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)后擴(kuò)張群體存活下來。

Exact檢驗(yàn)結(jié)果表明了5個群體之間無顯著的遺傳分化，是一個可以隨機(jī)交配的群體，但是Cytb完整序列分析結(jié)果顯示不能簡單地把南極地區(qū)作為整個單一種群進(jìn)行管理，必須結(jié)合其它分子標(biāo)記技術(shù)如SSR、AFLP、SNP等全面檢測伯氏肩孔南極魚群體的遺傳結(jié)構(gòu)，從而為漁業(yè)管理措施的制訂提供支撐。

伯氏肩孔南極魚分布較為廣泛，本研究由于樣本數(shù)量的問題及遺傳背景資料的缺乏，結(jié)果尚不能全面反映伯氏肩孔南極魚的遺傳特征，今后研究中需要增加樣本數(shù)量，并結(jié)合核基因標(biāo)記聯(lián)合分析伯氏肩孔南極魚的種群遺傳與分化。