斑馬魚早期胚胎發(fā)育囊胚sphere時期的蛋白組學(xué)研究

陳 漪,胡瑞芹,冉皓宇,陳良標

(1. 海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心(上海海洋大學(xué), 中國科學(xué)技術(shù)部), 上海 201306;2. 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室(上海海洋大學(xué)), 上海 201306; 3. 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海 201306)

斑馬魚(Daniorerio)作為脊椎動物中的模式生物，具有繁殖容易、發(fā)育快、體外受精、體外發(fā)育、胚胎透明等優(yōu)點，有利于研究胚胎發(fā)育過程。斑馬魚胚胎的早期發(fā)育是一個非常復(fù)雜的過程，涉及到了細胞分裂、細胞運動、胚層形成、背腹分化、前后軸線分化以及器官形成等多個方面[1-3]。這些生理進程中諸多信號通路互相協(xié)調(diào)、共同作用，聯(lián)合控制著整個發(fā)育過程。近年來國內(nèi)外有大量的研究均采用斑馬魚為實驗動物展開，并且在與生物早期胚胎相關(guān)的諸多領(lǐng)域中有重要發(fā)現(xiàn)，例如環(huán)境或化學(xué)因素對發(fā)育過程的影響、細胞活動、物質(zhì)形成以及組織和器官的形成機制等。

斑馬魚胚胎發(fā)育至4hpf即胚胎球型期(sphere)，是介于囊胚(blastula)和外包(epiboly)兩個時期之間的過渡時期。研究sphere時期的基因和蛋白質(zhì)表達的模式有助于揭示斑馬魚早期發(fā)育關(guān)鍵時期的調(diào)控機制。在斑馬魚的胚胎形成過程中，從囊胚期到外包期的過程是合子基因起始表達的關(guān)鍵時期，胚層細胞也開始分化和協(xié)同運作，然而其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜且機制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚胚胎囊胚期，分子粘連蛋白在深層細胞間形成放射狀的相互聯(lián)系[4]促使胚胎正常外包；有許多信號通路涉及到斑馬魚胚胎囊胚到外包的調(diào)控過程，諸如Wnt/PCP通路、PDGF-PI3K通路、Eph-Ephrin信號通路、Jak-Stat信號通路及MAP激酶級聯(lián)反應(yīng)等[5-9]。

蛋白質(zhì)是基因功能的最終執(zhí)行者，也是細胞增殖、分化、凋亡等生命活動的直接體現(xiàn)者[10]。利用蛋白質(zhì)組學(xué)可以從蛋白質(zhì)水平了解生物個體、組織器官的發(fā)育形成過程和基因調(diào)控機制。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究實現(xiàn)了同基因組、轉(zhuǎn)錄組分析的對接，為發(fā)育生物學(xué)各領(lǐng)域的研究提供更可靠的理論依據(jù)[11-12]。

基于高通量測序的基因組和轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于斑馬魚胚胎發(fā)育過程，通過轉(zhuǎn)錄組可以對各個階段的基因表達模式和表達差異動態(tài)變化進行比較分析。然而全基因組序列和轉(zhuǎn)錄組水平的基因表達并不足以闡明參與調(diào)控斑馬魚胚胎發(fā)育過程的一些生物功能和機制。在整體的功能研究中需要在基因水平和蛋白水平上相互驗證、互為補充[13]。蛋白組學(xué)的研究在許多魚類的發(fā)育過程中均有報道，諸如在金魚(Carassiusauratusl)胚胎發(fā)育早期[14]、鮭魚從體節(jié)期到器官形成階段[15]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)的肝臟器官發(fā)育[16]及斑馬魚卵巢發(fā)育階段[17-18]等。

常規(guī)的2D-GE和 MudPIT的蛋白組鑒定方法能夠檢測到的蛋白質(zhì)數(shù)量十分有限。相對和絕對定量的等量異位標簽iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation) 是由美國ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司研發(fā)的一種多肽體外標記技術(shù)[19]。 iTRAQ標記聯(lián)合質(zhì)譜分析具有分離能力強、分析范圍大、高靈敏度及定性分析結(jié)果較可靠等優(yōu)點，現(xiàn)已成為差異蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究的主要工具之一[20]。iTRAQ標記與LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的各個方面。在斑馬魚中，iTRAQ被廣泛用于鰓組織[21]、肝組織[22]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)[23]以及胚胎[24]的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。

本研究以高通量和高靈敏度的iTRAQ蛋白質(zhì)組定性定量技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC -MS /MS)，檢測斑馬魚胚胎發(fā)育sphere時期蛋白質(zhì)表達情況，探索新的蛋白質(zhì)，并進一步分析這些蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，從而獲得不同蛋白在該時期的表達情況及其參與的生物學(xué)過程，以期為進一步研究斑馬魚胚胎發(fā)育過程及其調(diào)控機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

斑馬魚及胚胎收集：AB品系的野生型斑馬魚購于北京中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，在本實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖傳代。孵化后斑馬魚在3 L魚缸中養(yǎng)殖至性成熟，以適宜水環(huán)境飼養(yǎng)，水溫為(28.5±0.5) ℃， pH值7±0.5，電導(dǎo)率450～550μS；通過自動光照系統(tǒng)控制光照周期(明14 h，暗10 h)。每天2次(9∶00, 18∶00)按時投喂初孵豐年蟲。繁殖時將雌雄斑馬魚(各1條)置于孵化缸內(nèi)以隔板隔開，次日將隔板抽離，使雌雄魚追尾產(chǎn)卵，約10 min后將親魚轉(zhuǎn)移至另一盛有干凈循環(huán)水的缸中并標記產(chǎn)卵日期。收集孵化缸底斑馬魚胚胎，置于培養(yǎng)皿中，清洗并加入E3培養(yǎng)基，斑馬魚胚胎在恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)育，溫度為(28.5±0.5) ℃。發(fā)育至4 hpf的斑馬魚胚胎在PBS緩沖液中快速剝?nèi)ヂ褮ぃヂ褮さ陌唏R魚胚胎取100枚收集到干凈的1.5 mL EP管中，吸去多余的PBS，放入液氮中速凍5 min，-80 ℃保存待用。共取3組相同時期、相同處理條件、相同數(shù)目不同親本斑馬魚所產(chǎn)的胚胎樣品。

1.2 主要試劑與儀器

iTRAQ Reagent-8Plex Multiplex Kit購自AB Sciex公司；液相Easy nLC/ Ultimate 3000、色譜柱(C18 1.9 mm 150 μm×120 mm)、色譜預(yù)柱(C18 3 mm 100 μm×20 mm) 均購自于Thermo Scientific公司；HPLC分級液相1260 infinity Ⅱ購自Agilent公司；HPLC分級色譜柱xBridge peptide BEH 130 C18 column 購自Waters公司；Q-Exactive HF質(zhì)譜儀購自Thermo Scientific公司。

1.3 斑馬魚魚卵蛋白質(zhì)提取和iTRAQ標記

1.3.1 斑馬魚卵蛋白質(zhì)提取、定量及電泳

每組冷凍保存的樣品溶解后加入裂解液(含8 M尿素)、50 mM 的NH4HCO3以及蛋白酶抑制劑。裂解樣品速度1 000 g以上，4 ℃離心30 min，取上清液。提取的總蛋白進行去高豐度處理(高豐度卵黃蛋白)。根據(jù) Bradford 法測蛋白濃度，確定 SDS-PAGE 和 iTRAQ 分析所需要的蛋白量。各取25 μL蛋白質(zhì)樣品5∶1(v/v)加入5×體積上樣緩沖液，沸水浴5 min，轉(zhuǎn)速14 000 r·min-1離心10 min后取上清液，進行10% SDS-PAGE電泳。電泳條件：恒流14 mA，時間90 min。電泳后進行考馬斯亮藍染色檢測蛋白質(zhì)量。

1.3.2 蛋白Trypsin酶切和iTRAQ標記

蛋白質(zhì)定量后每個樣品取200 μg置于離心管中，加入5 μL的1 M DTT(二硫蘇糖醇)，37 ℃孵育1 h后，加入20 μL 1 M的IAA (吲哚乙酸)，混勻后，室溫下避光反應(yīng)1 h。吸取所有樣品加入超濾管中，離心后棄收集液；加入100 μL UA(8M urea，100 mM Tris-HCl，pH8.0)至超濾管中，離心后棄收集液，重復(fù)2次；加入0.5 M TEAB 100 μL，離心后棄收集液，重復(fù)3次；更新收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，按照蛋白和酶50∶1(w/w)的比例加入Trypsin，37 ℃酶解12～16 h。取100 μg 酶解片段脫鹽處理，按照AB公司試劑盒iTRAQ Reagent-8Plex說明書進行標記。3組蛋白質(zhì)樣品進行iTRAQ標記標簽分子量分別為113(A-4h-1)、114(A-4h-2)、117(A-4h-3)。標記之后取少量樣本混合，進行LC-MS/MS質(zhì)譜檢測，查看iTRAQ標記效率。

1.4 高pH條件下HPLC分離肽段混合物及質(zhì)譜分析

1.4.1 高pH條件下C18色譜柱的HPLC分級

將標記抽干后的肽段樣品用100 μL液相A流動相復(fù)溶，渦旋振蕩，轉(zhuǎn)速14 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液進行色譜上樣；準備60個空白1.5 mL離心管，依次標記為1～60，用于收集分離得到的組份1～60。在高pH條件下HPLC儀中進行反相分離。使用色譜柱(C18 1.9 mm 150 μm×120 mm)，流速為0.7 mL·min-1。A相流動相為2%乙腈(ACN)、98% Milipore水，pH10；B相流動相為98% ACN和2% Milipore水，pH10。B相梯度如下：0～3 min升至 5%，保持2min，5～45 min升至35%，45～53 min升至90%，保持7 min。從5 min開始，依次收集每1.5 min洗脫物到1～60號離心管中，真空冷凍離心干燥。

1.4.2 質(zhì)譜分析

將干燥后的樣品用5 μL 0.5%的甲酸(FA)重溶，并將收集到的60個組分合并成多個組分，將合并后的組分轉(zhuǎn)速14 000 r·min-1離心10 min，吸取上清上樣10 μL，進行高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(HPLC-MS/MS)分級分析。采用毛細管高效液相色譜，每份樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)進行分離。色譜柱以95%的A液平衡。樣品由自動進樣器上樣到質(zhì)譜預(yù)柱(C18 3 mm 100 μm×20 mm)，再經(jīng)分析柱分離，流速及相關(guān)液相梯度如下：流速為600 nL·min-1，A相流動相為0.1% FA、99.9% Milipore水；B相流動相為0.1% FA、99.9% ACN。B相梯度如下：初始5%，0～16 min升至10%，16～51 min升至22%，51～71min升至30%，71～72 min升至95%，72～78 min維持95%。每份樣品經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后用質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜全掃描質(zhì)量范圍300～1400 m·z-1，分辨率150 000，選取一級信號強度最高的20個離子進行二級質(zhì)譜分析，二級質(zhì)譜全掃描質(zhì)量范圍200～2 000 m·z-1，動態(tài)排除設(shè)置為12 s。

1.4.3 數(shù)據(jù)庫檢索

使用Proteome Discovery搜庫軟件(Thermo Fisher) ，Mascot (Version 2.2)搜索引擎對Uniprot database斑馬魚數(shù)據(jù)庫(uniprot-danio+rerio_170221.fasta)進行搜庫。搜庫參數(shù)如表1所示。結(jié)果過濾參數(shù)為：Peptide FDR≤0.01，Peptide score>10。

表1 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索參數(shù)Tab.1 Protein database retrieval parameters

1.5 生物信息學(xué)分析

對鑒定出的蛋白進行生物過程及分子功能分析。通過Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org)對鑒定蛋白作GO功能注釋分析；通過KEGG公共數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)對鑒定蛋白作KEGG功能注釋分析，進行Pathway代謝通路注釋；將鑒定到的蛋白和KOG數(shù)據(jù)庫(cluster of orthologous groups of proteins，蛋白相鄰類的聚簇)進行比對，對蛋白質(zhì)進行直系同源分類并預(yù)測這些蛋白可能的功能，然后做功能分類統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚胚胎發(fā)育4hpf時期形態(tài)

斑馬魚早期胚胎發(fā)育根據(jù)形態(tài)可以劃分成7大時期——合子期(zygote)、卵裂期(cleavage)、囊胚期(blastula)、原腸胚期(gastrula)、體節(jié)期(segmentation)、咽囊期(pharyngula)及孵化期(hatching period)，隨后進入仔稚魚階段。斑馬魚的早期胚胎發(fā)育在4hpf時期進入決定胚胎發(fā)育方向的關(guān)鍵時期。胚胎從受精至發(fā)育4 h，胚胎處于囊胚后期，動物極囊胚細胞進行不同步分裂，由于細胞的持續(xù)分裂與細胞運動，胚盤由原先的橢球形變?yōu)榍蛐?，細胞向外擴展(圖1-A)，胚盤變平與卵黃形成水平邊界(圖1-B)，稱之為球型(sphere)階段。從圖1-C中紅色箭頭所示處可以明顯看到箭頭上方較小的囊胚細胞和下方較大的卵黃細胞。經(jīng)歷sphere階段之后，胚胎卵黃細胞逐漸向動物極突起，胚層開始不均一增厚，胚胎進入外包期(epiboly)。

2.2 蛋白提取SDS-PAGE電泳分析

斑馬魚胚胎4hpf時期提取的各組蛋白樣品經(jīng) Bradford 法蛋白定量及SDS-PAGE電泳。對電泳結(jié)果分析表明，3個平行重復(fù)樣本中總蛋白在10～220 kDa分子量范圍內(nèi)得到有效分離，3組樣品蛋白特異條帶明顯，相應(yīng)的蛋白條帶清晰、完整，蛋白沒有發(fā)生明顯降解。從電泳譜帶上看，各組斑馬魚胚胎總蛋白中的高豐度脂質(zhì)得到有效的去除，樣品之間平行度較好，整體蛋白電泳譜帶具有相似的帶型，蛋白條帶分布均勻、分辨率高且呈現(xiàn)多樣性，含有的蛋白亞基種類和數(shù)量相似(圖2)。初步表明蛋白的提取效果較為理想，蛋白總量和純度滿足進行下一步蛋白標記，液相色譜分級分離實驗。

2.3 質(zhì)譜鑒定和iTRAQ定量分析

經(jīng)質(zhì)譜分析并比對uniprot-danio+rerio_170221.fasta 數(shù)據(jù)庫結(jié)果得出：iTRAQ標記效率為98.00%，鑒定到的總蛋白為1 178個，鑒定共計獲得唯一肽段7 351個(圖3)，其中2段以上不同肽段覆蓋的蛋白704種，占全部鑒定蛋白的59.76%；5段以上不同肽段覆蓋蛋白398種，占全部鑒定蛋白的33.78%。通過iTRAQ標記，LS-MS/MS技術(shù)有效的分離和鑒定出了斑馬魚4hpf發(fā)育階段胚胎中蛋白質(zhì)的表達情況。3次重復(fù)實驗之間的蛋白定量比值平均值都在1附近，表明3組蛋白樣品之間重復(fù)性較好，檢測出的蛋白質(zhì)可信度較高。

對鑒定獲得的1 178個蛋白質(zhì)的分子量和等電點兩種基本理化性質(zhì)的分布進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，所有鑒定到的蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量分布在6.0～545.4 kDa之間，等電點范圍為3.61～12.12。其中蛋白質(zhì)等電點主要分布在5.0～8.9之間，占鑒定到蛋白總數(shù)的77.92%，92%的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量在10～110 kDa之間(圖4,圖5)。

圖1 斑馬魚4hpf時期胚胎形態(tài)Fig.1 Features of Danio rerio embryo in 4hpf stage注：A為胚胎正面觀，B為側(cè)面觀；A、B比例尺為200 μm；C比例尺為100 μm；B、C中紅色箭頭所示為與胚胎囊胚細胞與卵黃細胞交界處Notes: A shows surface view of embryo, B shows lateral view of embryo; scale bar of A and B is 200 μm, scale bar of C is 100 μm; the red arrows in B and C point out the cell boundary

圖2 斑馬魚4hpf胚胎蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE diagram ofDanio rerio 4hpf embryos protein注：M：蛋白標準marker；4h-1、4h-2、4h-3：分別為3組不同批次的4hpf斑馬魚胚胎蛋白Notes: M:protein marker; 4h-1,4h-2,4h-3 are 3 different groups of Danio rerio 4hpf embryos, respectively

圖3 鑒定肽段數(shù)量分布圖Fig.3 Peptide count distribution

圖4 鑒定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布圖Fig.4 Relative molecular weight distribution of protein

圖5 鑒定蛋白質(zhì)等電點分布圖Fig.5 Isoelectric point distribution of protein

本研究對檢測到的所有蛋白進行了相對平均表達量的測定。定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金屬結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類的表達量較低；而卵黃蛋白原、熱休克蛋白、肌動蛋白和微管蛋白則具有明顯的高表達(表2)。實驗結(jié)果表明，iTRAQ標記方法對胚胎中低豐度蛋白也有良好的檢測效果。經(jīng)分析，胚胎中高表達的蛋白質(zhì)對于維持胚胎的正常營養(yǎng)供應(yīng)、細胞運動、能量代謝十分重要。另外，在鑒定出的蛋白中有426個未知蛋白，在數(shù)據(jù)庫中沒有相應(yīng)的注釋，其中20個蛋白具有顯著的高表達，初步推測這些未知蛋白在胚胎發(fā)育4hpf時期具有重要的功能，但其具體功能有待進一步的研究。

2.4 蛋白功能的注釋分析

研究進一步通過生物信息分析的方法對鑒定出的蛋白進行功能注釋分析。對檢測到的蛋白分別進行了GO 注釋(圖6)、COG 注釋(圖7)。這些蛋白分別注釋到了3類總共48個不同的GO term上。共有769個蛋白與生物過程(biological process)的功能相關(guān)，分析中可以看出在斑馬魚4hpf發(fā)育階段表達量較高的蛋白參與較多的生物過程分別是細胞代謝、刺激應(yīng)答、單一生物體過程、生物調(diào)節(jié)、細胞進程以及發(fā)育過程(圖6-A)。經(jīng)分析有673個蛋白具有細胞組成(cellar component)功能，在該階段胚胎中，參與細胞組成的主要蛋白類型為大分子復(fù)合物、細胞器組成蛋白、細胞成分蛋白以及細胞膜組成蛋白(圖6-B)。912個蛋白質(zhì)注釋到分子功能(molecular function)上，蛋白參與數(shù)目較多的分子功能分別為催化活性、結(jié)合活性、分子結(jié)構(gòu)形成活性和分子轉(zhuǎn)運活性(圖6-C)。 COG(cluster of orthologous groups of proteins， 蛋白相鄰類的聚簇)是對蛋白質(zhì)進行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫。在COG注釋分析中發(fā)現(xiàn)，其中參與細胞信息存儲處理的蛋白有119種，其中最顯著的是蛋白翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成功能；參與細胞代謝過程的有107種，主要與碳水和脂質(zhì)代謝相關(guān)；參與細胞進程與信號傳導(dǎo)的有183種，大多數(shù)為翻譯后修飾與分子伴侶相關(guān)蛋白。

表2 斑馬魚4hpf時期胚胎高表達蛋白質(zhì)Tab.2 High expression proteins in 4hpf stage of Danio rerio embryo

對鑒定出蛋白進行KEGG Pathway代謝通路注釋，發(fā)現(xiàn)這些蛋白所涉及到的Pathway多達129條，其中富集蛋白數(shù)目在10個以上的有30條(圖8)。參與蛋白最多的是核糖體相關(guān)通路，其次還有碳代謝、剪接體相關(guān)通路、細胞內(nèi)吞作用、氧化磷酸化、RNA轉(zhuǎn)運、氨基酸的生物合成與降解、細胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)通路等。

3 討論

在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中蛋白質(zhì)的含量和蛋白質(zhì)水平的調(diào)控對于胚胎的正常發(fā)育進程十分關(guān)鍵。蛋白質(zhì)組能夠直觀的反映特定時期內(nèi)的胚胎中基因和其它相關(guān)調(diào)控因子在決定胚胎表型和細胞的分化命運時發(fā)揮功能的情況。

斑馬魚的胚胎發(fā)育的囊胚階段(2.25～4.66 hpf)[25]，胚胎在形態(tài)上和分子水平上都發(fā)生復(fù)雜的變化。在基因?qū)用?，囊胚中期，胚胎?jīng)歷母型-合子型轉(zhuǎn)換(MZT)過程，大量合子型基因表達并伴隨著母源mRNA降解[26]；在細胞層面，囊胚晚期胚胎細胞進行著快于任何發(fā)育階段的細胞重排和細胞運動，繼而動物極下包，進入原腸胚階段。斑馬魚胚胎發(fā)育的4 hpf時期(sphere)，是介于囊胚和外包兩個時期之間的過渡時期，胚胎剛剛由母源型調(diào)控轉(zhuǎn)為合子型調(diào)控，開始了大量的基因轉(zhuǎn)錄活動，該時期積累的蛋白質(zhì)以及它們的調(diào)控作用影響了胚胎發(fā)育后續(xù)的外包(epiboly)階段。

本研究采用iTRAQ標記與LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，在斑馬魚早期胚胎發(fā)育4 hpf時期的胚胎中共鑒定到1 178種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)廣泛的參與到細胞中的物質(zhì)合成與代謝、細胞信號傳遞、細胞運動和細胞骨架、細胞增殖及其調(diào)控、細胞分化與轉(zhuǎn)錄調(diào)控等各項生命活動過程。盡管目前對斑馬魚早期各個階段的轉(zhuǎn)錄組均有比較詳盡的分析和研究，但是關(guān)于斑馬魚早期胚胎發(fā)育的蛋白組學(xué)研究仍然較少且研究的發(fā)育時期并不完全。TAY等[27]對斑馬魚早期發(fā)育6～72 hpf中的10個不同時期進行蛋白質(zhì)組研究，通過雙向電泳進行檢測，發(fā)現(xiàn)大量的蛋白質(zhì)表達量隨著發(fā)育時長變長而增加，同時對這些蛋白進行定性并鑒定到了108個已知蛋白。斑馬魚單胚胎的蛋白質(zhì)組研究中，在斑馬魚3hpf去卵黃和未去卵黃胚胎中分別鑒定到499種和260種蛋白，在5hpf未去卵黃胚胎中鑒定到212種蛋白[28]。斑馬魚早期發(fā)育4hpf的胚胎蛋白組目前還沒有相關(guān)研究報道。在本研究中，利用高靈敏的iTRAQ標記結(jié)合質(zhì)譜分析，在4hpf時期斑馬魚胚胎中鑒定到了更大數(shù)量的蛋白質(zhì)，包括已有報道的卵黃蛋白原(vitellogenin)；熱休克蛋白heat shock protein 5，heat shock protein HSP 90-beta，heat shock cognate 71 kDa protein等；分子伴侶蛋白chaperonin containing TCP1 subunit 2 (Beta)，chaperonin containing TCP1, subunit 7 (Eta)等；細胞骨架蛋白actinin alpha 4，tubulin alpha chain等翻譯功能蛋白ribosomal protein，translation initiation factor 4A等[17,22-23]，以及之前的蛋白組學(xué)研究中未能鑒定出的一些低表達的蛋白質(zhì)如Ndufa9、RhoA-C、Pgam5、Deltex1等。在本研究中對斑馬魚胚胎發(fā)育4hpf時期的蛋白質(zhì)組進行了大范圍的定性和定量檢測，得到了更大數(shù)據(jù)量且更準確的斑馬魚胚胎蛋白組信息。進一步研究這一關(guān)鍵時期中這些蛋白的功能將有助于更深入的了解斑馬魚早期胚胎發(fā)育的分子調(diào)控機制起到重要的作用。檢測結(jié)果分析還發(fā)現(xiàn)有8個預(yù)測的新結(jié)構(gòu)蛋白，類似SNRPD2 結(jié)構(gòu)蛋白、類似ENDOD1結(jié)構(gòu)蛋白、含有SNF2家族 N端和解旋酶(helicase)保守C端結(jié)構(gòu)域蛋白、透明帶蛋白樣結(jié)構(gòu)域(zona pellucida-like)蛋白。除此之外還有426個，占檢測蛋白總數(shù)36.16%的蛋白被注釋為未知蛋白，這些蛋白可能在斑馬魚早期發(fā)育過程中起到重要作用但是具體功能仍有待研究。

圖6 斑馬魚4hpf時期表達蛋白GO注釋分析Fig.6 GO annotation and analysis of protein in 4hpf embryo注：a：生物過程相關(guān)蛋白GO注釋；b：細胞組成相關(guān)蛋白質(zhì)GO注釋；c：分子功能相關(guān)蛋白質(zhì)GO注釋Notes: a: GO annotation of biological process; b: GO annotation of cellar component; c: GO annotation of molecular function

圖7 斑馬魚4 hpf時期表達蛋白COG注釋Fig.7 COG annotation and analysis of protein at 4hpf stage of embryo

圖8 斑馬魚4hpf時期表達蛋白KEGG通路分析Fig.8 KEGG pathway analysis of protein in 4hpf embryo

在本研究中，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)卵黃蛋白原 (vitellogenin, Vtgs)是斑馬魚4hpf時期胚胎中表達量最高的蛋白，同時卵黃蛋白也是斑馬魚從卵子到胚胎發(fā)育中持續(xù)表達最豐富的蛋白。目前已知在斑馬魚基因組上有7種Vtgs基因，分別為Vtg1～Vtg7，位于基因組的不同的位置上[29]。在斑馬魚中，Vtg大多在肝臟中合成，而在卵巢中也有少量Vtg mRNA的表達，在斑馬魚卵母細胞成熟的過程中，卵黃蛋白原Vtgs最早開始在Ⅱ期表達并迅速在卵子中累積，卵黃蛋白持續(xù)表達，直到卵母細胞成熟[29]。在關(guān)于斑馬魚卵母細胞成熟過程的蛋白質(zhì)組學(xué)動態(tài)研究中，卵黃蛋白Vtgs在斑馬魚早期卵母細胞成熟過程中高表達，研究鑒定到包括Vtg1、Vtg3、Vtg4和Vtg7在卵母細胞成熟的各個階段表達呈現(xiàn)大幅增加趨勢，其中Vtg3在卵母細胞最終成熟階段上升了5倍[17]。在本研究中發(fā)現(xiàn)在斑馬魚4hpf的胚胎中，卵黃蛋白原Vtg1、Vtg2、Vtg3、Vtg7的表達量是檢測到的蛋白中表達量最高的4種蛋白，這個結(jié)果與先前的斑馬魚卵母細胞蛋白組學(xué)研究結(jié)果一致，故而認為在斑馬魚的早期胚胎發(fā)育過程中，卵黃蛋白由母源卵子提供，在胚胎的合子發(fā)育過程中起到了重要的作用，為早期胚胎的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)。

通過對鑒定到的蛋白進行GO注釋和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)斑馬魚早期胚胎發(fā)育4 hpf時期表達的蛋白廣泛參與了許多重要的生物過程。包括對胚胎發(fā)育至關(guān)重要的信號傳導(dǎo)相關(guān)通路，如Wnt信號通路、Hedgehog信號通路和TGF-β信號通路；細胞增殖分化及細胞凋亡相關(guān)的信號通路，如：P53信號通路、Notch信號通路、NOD-like receptor信號通路等；以及涉及細胞間相互作用和信號傳遞相關(guān)的通路，如：MAPK信號通路、緊密連接、黏著斑連接等。

斑馬魚早期胚胎發(fā)育的囊胚過渡和外包過程中，細胞骨架和細胞間的粘連發(fā)揮了重要作用，破壞細胞骨架和細胞粘連[30]，阻斷MAPK信號通路[31]，均導(dǎo)致胚胎在外包前發(fā)育異常和阻滯。

KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)4hpf時期表達大量的核糖體組成以及翻譯相關(guān)蛋白質(zhì)，說明了核糖體功能和翻譯過程在該時期的重要性。核糖體的生物合成過程在細胞中占據(jù)實質(zhì)性的細胞資源，因此它也緊密協(xié)調(diào)著細胞中的營養(yǎng)效率[32]。在斑馬魚的早期胚胎卵裂增殖階段，胚胎細胞快速分裂需要大量能量供應(yīng)新的蛋白合成并且積累物質(zhì)為下一次分裂做準備，尤其在囊胚時期，細胞開始運動、分化并形成胚層，胚胎細胞的正常生物合成與細胞間的信息傳遞是保證胚胎正常發(fā)育和外包的重要條件。

綜上所述，通過iTRAQ標記聯(lián)合LC-MS/MS的方法可以對4hpf時期的斑馬魚胚胎中的蛋白質(zhì)組進行有效的分離和鑒定，該技術(shù)為研究斑馬魚的早期胚胎發(fā)育過程中蛋白質(zhì)組學(xué)提供了高效、可行的研究方法，也為進一步研究斑馬魚的發(fā)育過程的調(diào)控機制提供了新的研究方向。本研究利用iTRAQ標記建立了斑馬魚早期發(fā)育關(guān)鍵階段sphere時期的蛋白質(zhì)組表達圖譜，為后續(xù)研究斑馬魚早期胚胎在發(fā)育過程中的蛋白組學(xué)研究提供參考和奠定基礎(chǔ)。在后期的研究工作中需進一步對4hpf時期前后的蛋白組表達情況進行檢測，通過比較分析各個時期的斑馬魚胚胎中蛋白質(zhì)組的差異變化找出在斑馬魚胚胎發(fā)育特定時期發(fā)揮關(guān)鍵功能的蛋白，這對研究斑馬魚早期胚胎發(fā)育的調(diào)控過程具有重要意義。

4 小結(jié)

本研究通過iTRAQ蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)對4hpf時期的斑馬魚胚胎中的蛋白質(zhì)組進行有效的分離和鑒定，檢測了斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中囊胚sphere時期的蛋白質(zhì)表達情況，對該時期表達的蛋白質(zhì)進行定性和定量的鑒定，并分析該時期表達的蛋白質(zhì)的相應(yīng)功能和參與調(diào)控的生物過程。檢測結(jié)果共鑒定到的總蛋白數(shù)為1 178個，利用生物信息學(xué)進行功能分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白廣泛參與了細胞信號傳遞、細胞運動和細胞骨架構(gòu)建、細胞增殖、細胞分化、物質(zhì)合成與代謝等各項重要的生命活動過程。