基于形態(tài)與DNA條形碼的中國(guó)鲾科魚(yú)類(lèi)分類(lèi)研究

周 琪，章 群，唐楚林，徐 示，王業(yè)磷

(暨南大學(xué)生態(tài)系，廣州 510632)

鲾科(Leiognathidae)隸屬于鱸形目(Perciformes)，廣泛分布于西太平洋及印度洋海域，中國(guó)主要分布于南海及臺(tái)灣海峽。鲾科魚(yú)類(lèi)為群居性小型魚(yú)類(lèi)，一般棲息于岸邊泥沙地、河口或內(nèi)灣，在沿岸軟底質(zhì)生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位，并具有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。鲾科魚(yú)類(lèi)鱗片細(xì)小易脫落，體內(nèi)有可與發(fā)光細(xì)菌相互作用的發(fā)光器官和組織。目前國(guó)際上對(duì)鲾科的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一 ，如ITIS(Integrated Taxonomic Information System)和《南海魚(yú)類(lèi)檢索》[3]將鲾科分為3個(gè)屬：小牙鲾屬(Gazza)、鲾屬(Leiognathus)、仰口鲾屬(Secutor)；CHAKRABARTY等[4]依據(jù)外部形態(tài)、體長(zhǎng)和體高的比例、發(fā)光器官和組織的特征等，將鲾科分為6個(gè)屬：鲾屬、金鲾屬(Aurigequula)、項(xiàng)鲾屬(Nechequula)、馬鲾屬(Equulites)、布氏鲾屬(Eubleekeria)、光胸鲾屬(Photopectoralis)；SPARKS等[5]依據(jù)發(fā)光器官內(nèi)在和外在是否存在性二態(tài)，認(rèn)為鲾科由不存在性二態(tài)的鲾屬和金鲾屬以及存在性二態(tài)的Gazzinae亞科中8個(gè)屬組成；Fishbase (http://www. fishbase. org/)記錄全球鲾科至少有8屬48種，其中中國(guó)8屬19種；陳大剛等[6]記錄全球鲾科有3屬30種，中國(guó)有3屬22種。鲾科魚(yú)類(lèi)無(wú)論是外部形態(tài)還是內(nèi)部的發(fā)光器官和組織等特征具有極大的種間相似性[7]，通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)鑒定存在較大困難。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于鲾科魚(yú)類(lèi)的研究報(bào)道多為生態(tài)資源調(diào)查[8]、發(fā)光器官和組織的性二態(tài)及其發(fā)光機(jī)制的研究[9]等。在分類(lèi)方面，YU[10]對(duì)臺(tái)灣海域的鲾科魚(yú)類(lèi)進(jìn)行了分子上和形態(tài)上的比較分析。ABRAHAM等[11]根據(jù)詳細(xì)的形態(tài)數(shù)據(jù)研究了印度西海岸16種鲾科魚(yú)類(lèi)的種間關(guān)系。但現(xiàn)有的國(guó)內(nèi)外資料不足以闡明中國(guó)沿海鲾科魚(yú)類(lèi)的分類(lèi)現(xiàn)狀。

2003年HEBERT等[12-13]提出“DNA條形碼”的概念，即通過(guò)一段易于擴(kuò)增測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)基因序列進(jìn)行物種鑒定；對(duì)動(dòng)物界中11門(mén)13320個(gè)物種的線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ亞基(COI)序列分析發(fā)現(xiàn)，除腔腸動(dòng)物門(mén)(Cnidaria)外，多數(shù)物種種內(nèi)遺傳距離≤ 2%，種間遺傳距離遠(yuǎn)大于(一般≥10×)種內(nèi)遺傳距離，并可對(duì)98%以上的物種進(jìn)行分類(lèi)。2005年WARD等[14]對(duì)澳大利亞等地海域207種魚(yú)類(lèi)的研究，驗(yàn)證了COI基因序列作為海洋魚(yú)類(lèi)DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列的可行性。同年國(guó)際社會(huì)開(kāi)始實(shí)施魚(yú)類(lèi)生命條形碼計(jì)劃，采用經(jīng)權(quán)威分類(lèi)鑒定標(biāo)本的魚(yú)類(lèi)線粒體COI基因序列，以電子數(shù)據(jù)庫(kù)形式，構(gòu)建含有DNA條形碼、圖像和地理坐標(biāo)的全球魚(yú)類(lèi)參考標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)。雖然DNA條形碼技術(shù)有助于物種鑒定，而且對(duì)物種間群落關(guān)系多樣性(如食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜性)的研究有重要作用；但由于所使用的線粒體標(biāo)記為母系遺傳，在區(qū)分雜交種、近期分化物種時(shí)仍存在諸多問(wèn)題[15]，因而準(zhǔn)確的物種分類(lèi)需要DNA條形碼和形態(tài)分類(lèi)研究的相互參照及驗(yàn)證[16-17]。YING等[18]利用GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和BOLD (http://www. barcodinglife.org)下載的232條鲾科魚(yú)類(lèi)6屬24種COI序列進(jìn)行了DNA條形碼分析，但并無(wú)中國(guó)黃斑鲾(L.bindus)、短吻鲾(L.brevirostris)、頸斑鲾(L.nuchalis)、短棘鲾(L.equulus)、堅(jiān)鲾(L.stercorarius)序列分析，也沒(méi)有進(jìn)行形態(tài)分析等；JU[19]利用COI序列和形態(tài)特征在中國(guó)北部灣發(fā)現(xiàn)新紀(jì)錄種Deveximentummegalolepis。

本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室在中國(guó)沿海各地采集的鲾科魚(yú)類(lèi)進(jìn)行分類(lèi)整理和詳細(xì)的形態(tài)測(cè)量，測(cè)定了每一形態(tài)種一定數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)COI序列；結(jié)合GenBank和BOLD中下載的序列，以期突破傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)根據(jù)表型性狀鑒定的局限性，明確中國(guó)鲾科魚(yú)類(lèi)的分類(lèi)地位，為保護(hù)鲾科魚(yú)類(lèi)生物多樣性和開(kāi)展海洋生態(tài)調(diào)查提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源、形態(tài)測(cè)量與數(shù)據(jù)處理

參閱FishBase、《南海魚(yú)類(lèi)檢索》[3]等資料，將2005—2018年采集于中國(guó)4省14個(gè)地點(diǎn)(表1)的142尾鲾科魚(yú)類(lèi)鑒定為3屬10種，其中小牙鲾(G.minuta)14尾，G.sp.A10 尾，黃斑鲾 14尾，短吻鲾33尾，頸斑鲾26尾，短棘鲾20尾，細(xì)紋鲾(L.berbis)4尾，帶紋鲾(L.striatus) 1尾，堅(jiān)鲾1尾，仰口鲾(S.ruconius)19尾。參照ROHLF等[20]的幾何形態(tài)測(cè)量法，測(cè)量體長(zhǎng)、體高、頭長(zhǎng)、頭高、吻長(zhǎng)、眼徑、尾柄長(zhǎng)、尾柄高、背鰭長(zhǎng)、胸鰭長(zhǎng)、腹鰭長(zhǎng)、臀鰭長(zhǎng)、全長(zhǎng)等13個(gè)常規(guī)性狀；通過(guò)8個(gè)解剖學(xué)坐標(biāo)點(diǎn)：A：吻端、B：頭部末端、C：背鰭起點(diǎn)、D：尾鰭背部起點(diǎn)、E：峽部末端、F：腹鰭起點(diǎn)、G：臀鰭起點(diǎn)、H：尾鰭腹部起點(diǎn)構(gòu)建框架結(jié)構(gòu)，測(cè)量AB、BC、CD、DH、HG、GF、FE、EA、EB、EC、FB、FC、CG、GD、HC等15個(gè)框架結(jié)構(gòu)測(cè)量性狀間距離，形態(tài)測(cè)量精確到0.1mm。測(cè)量示意圖見(jiàn)圖1。為消除異速生長(zhǎng)帶來(lái)的變動(dòng)，將除體長(zhǎng)外的27個(gè)形態(tài)測(cè)量值按ELLIOTT等[21]的方法標(biāo)準(zhǔn)化處理后，通過(guò)SPSS22.0軟件對(duì)27個(gè)度量特征進(jìn)行主成分分析、判別分析和聚類(lèi)分析。

1.2 DNA條形碼實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)處理

參照樂(lè)小亮等[22]方法提取魚(yú)類(lèi)樣本DNA。使用本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的引物Cx1F2：5′-ACCTGTGGCAATCACACGCTGAT-3′，Cx1R2：5′-CATGCCCATGTAGCCGAATGG-3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送往華大基因測(cè)序。從GenBank和BOLD下載中國(guó)及其鄰近海域鲾科魚(yú)類(lèi)同源序列，通過(guò)MEGA6.0[23]軟件進(jìn)行人工校對(duì)，分析序列特征，計(jì)算基于Kimura 2-parameter(K2P)模型的遺傳距離；構(gòu)建鄰接(Neighbor-Joining)樹(shù)，經(jīng)1000次重復(fù)抽樣(Bootstraps)檢測(cè)分支置信度。采用自動(dòng)條形碼間隙檢索方法(automatic barcode gap discovery,ABGD)[24]將全部序列自動(dòng)分組。本研究用于條形碼分析的序列如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鲾科魚(yú)類(lèi)形態(tài)測(cè)量多元分析

對(duì)147 尾 28個(gè)形態(tài)參數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，發(fā)現(xiàn)測(cè)量值與標(biāo)準(zhǔn)體長(zhǎng)間無(wú)顯著相關(guān)性，表明成功消除了因異速生長(zhǎng)造成的體長(zhǎng)效應(yīng)，使分析結(jié)果更準(zhǔn)確。在主成分分析中，KMO(0.845)值接近1；Bartlett值為5 484.638，27個(gè)形態(tài)特征值種間差異極顯著(P<0.001)；說(shuō)明主成分分析結(jié)果較為理想。第1、2主成分的累積貢獻(xiàn)率為65.35%。其中對(duì)主成分1有主要貢獻(xiàn)的是FB、FE、體高等，對(duì)主成分2有主要貢獻(xiàn)的是臀鰭長(zhǎng)、背鰭長(zhǎng)和尾柄長(zhǎng)等。主成分散點(diǎn)圖(圖2)顯示，第一主成分中各種魚(yú)類(lèi)重疊部分較多，因此無(wú)法只通過(guò)主成分1區(qū)分不同魚(yú)類(lèi)；第二主成分中短棘鲾和仰口鲾與其它種類(lèi)重疊部分較少。逐步判別分析結(jié)果(圖2)顯示，短吻鲾有3尾判入頸帶鲾，2尾判入細(xì)紋鲾，判別成功率為78.8%。頸帶鲾有4尾判入短吻鲾，判別率為84.6%。短棘鲾有1尾判入為帶紋鲾，判別率為95.0%。其余7種魚(yú)類(lèi)判別成功率為100%。在交互驗(yàn)證分析中，G.sp.A、細(xì)紋鲾、仰口鲾判別結(jié)果與逐步判別分析結(jié)果相同，均為100%。堅(jiān)鲾?shù)呐袆e率為0.0%，有且只有1尾判入小牙鲾；短棘鲾判別率為95%，有1尾被判入帶紋鲾；帶紋鲾判別率則為5%，有且只有1尾判入短棘鲾；小牙鲾、黃斑鲾、短吻鲾?shù)慕Y(jié)果低于逐步判別分析結(jié)果。逐步判別分析和交互驗(yàn)證分析的總體判別率分別為91.5%和85.2%。形態(tài)聚類(lèi)圖上(圖3)，短吻鲾與細(xì)紋鲾首先聚類(lèi)，其次細(xì)紋鲾、小牙鲾、黃斑鲾、仰口鲾、短棘鲾、堅(jiān)鲾依次加入聚類(lèi)；其中頸帶鲾和短吻鲾、G.sp.A和小牙鲾、帶紋鲾和短棘鲾聚類(lèi)。

表1 本研究中用于COI分析的鲾科魚(yú)類(lèi)樣本的信息Tab1 Specimens information of Leiognathidae in the present study

圖1 鲾科魚(yú)類(lèi)框架結(jié)構(gòu)示意圖(引自中國(guó)臺(tái)灣魚(yú)類(lèi)資料庫(kù))Fig.1 Schematic drawing of morphomertric measurements of Leiognathidae(adopted from fishdb.sinica.edu.tw)注：1：體長(zhǎng)；2：體高；3：頭長(zhǎng)；4：頭高；5：吻長(zhǎng)；6：眼徑；7：尾柄長(zhǎng)；8：尾柄高；9：背鰭長(zhǎng)；10：胸鰭長(zhǎng)；11：腹鰭長(zhǎng)；12：臀鰭長(zhǎng)；13：全長(zhǎng)。A：吻端；B：頭部末端；C：背鰭起點(diǎn)；D：尾鰭背部起點(diǎn)；E：峽部末端；F：腹鰭起點(diǎn)；G：臀鰭起點(diǎn)；H：尾鰭腹部起點(diǎn)。Note：1: body length; 2: body height; 3: head length; 4: head height; 5: snout length; 6: eye diameter; 7: caudal peduncle length; 8: caudal peduncle height; 9: dorsal fin length; 10: pectoral fin length; 11: ventral fin length; 12:anal fin length; 13: full length. A: rostral side; B: head end; C: dorsal fin starting point; D: caudal fin back starting point; E: isthmus end; F: pectoral fin starting point; G: anal fin starting point; H: caudal fin ventral starting point.

圖2 10種鲾科魚(yú)類(lèi)主成分得分散點(diǎn)圖(左)和判別函數(shù)得分(右)Fig.2 Scatter plot of component factor score (left) and discriminant scores (right) of 10 Leiognathid species

圖3 基于形態(tài)測(cè)量的鲾科魚(yú)類(lèi)聚類(lèi)圖Fig 3 Dendrogram of morphological characters of 10 Leiognathid species

2.2 鲾科魚(yú)類(lèi)線粒體COI序列特征與DNA條形碼分析

在105條平均長(zhǎng)度為643bp(552～652bp)的序列中，沒(méi)有堿基插入和缺失，多態(tài)位點(diǎn)225個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)218個(gè)；A、T、C、G堿基組成分別是24.7%、29.0%、28.7%、17.5%。A+T含量(53.7%)高于C+G含量(46.2%)，呈現(xiàn)出明顯的堿基組成偏向性，與WARD等[14]的硬骨魚(yú)研究一致；顛換比(R)為2.93，大于2.0，表明突變未達(dá)到飽和，適合系統(tǒng)發(fā)育分析。在鄰接樹(shù)上(圖4)，12種魚(yú)聚類(lèi)成11個(gè)bootstrap支持率為100%分支(Clade)，分支間平均遺傳距離[18.6%(7.9%～23.6%)]是分支內(nèi)[0.3%(0.0%～1.0%)]的62倍。黃斑鲾聚類(lèi)在2個(gè)分支：在Clade1中與短吻鲾混雜，平均遺傳距離為0.2%；在Clade5則無(wú)混雜而獨(dú)立成支。本研究測(cè)序的黃斑鲾L.bindusQ.BoA1、L.bindusQ.SanY1,4、L.bindusQ.HaiW1,3均聚類(lèi)在Clade 5。曳絲鲾在Clade3中與細(xì)紋鲾混雜，Clade 3進(jìn)一步分為subclade 1和subclade 2，subclade 1與細(xì)紋鲾混雜，subclade 2中曳絲鲾獨(dú)立成支，平均遺傳距離subclade間(5.8%)是subclade分支內(nèi)(0.1%)的58倍。subclade1中細(xì)紋鲾與曳絲鲾種間遺傳距離(0.2%)與種內(nèi)(0.2%)相當(dāng)，推測(cè)二者為同種。G.sp.A與小牙鲾種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離79倍，與寬身小牙鲾是35倍，支持了其為獨(dú)立物種。其余種類(lèi)單獨(dú)聚類(lèi)成支。根據(jù)ABGD遞歸分析(圖5)，當(dāng)種內(nèi)先驗(yàn)遺傳距離范圍為0.46%～3.59%時(shí)，本研究鲾科劃分為12個(gè)假設(shè)種與上述形態(tài)學(xué)與分子結(jié)果分析相對(duì)應(yīng)。另發(fā)現(xiàn)廣東陽(yáng)江堅(jiān)鲾、海南博鰲帶紋鲾、G.sp.A等為3個(gè)新紀(jì)錄種。

圖4 COI序列K2P模型的鲾科NJ樹(shù)Fig4 K2P-based NJ tree of COI sequences of Leiognathidae注：圖中劃線部分為混雜分支Note:The underlined part of the graph are branch intertwined with different species

圖5 鲾科魚(yú)類(lèi)的ABGD圖Fig.5 Automatic barcode gap discovery analyses of Leiognathidae注:橫坐標(biāo)表示先驗(yàn)種內(nèi)分化值，縱坐標(biāo)表示劃分類(lèi)群的數(shù)量Note: Abscissa means prior intraspecific divergence, ordinate means the number of groups produced

3 討論

3.1 短吻鲾、黃斑鲾和頸帶鲾?shù)姆诸?lèi)地位

DNA條形碼序列用于物種鑒定的一般標(biāo)準(zhǔn)是種內(nèi)遺傳距離通常低于2%，且種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的10倍以上[12-14]。在圖3 Clade1中從GenBank下載的黃斑鲾與短吻鲾混雜在平均遺傳距離(0.2%)小于≤2%的Clade1中；但本研究測(cè)定黃斑鲾L.bindusQ.BoA1、L.bindusQ.SanY1,4、L.bindusQ.HaiW1,3均聚類(lèi)在Clade5上，2個(gè)分支間遺傳距離為18.4%是分支內(nèi)(0.15%)的123倍。因TALWAR等[25]否定了短吻鲾和黃斑鲾為同物異名的可能性，故推測(cè)混雜在Clade1中的黃斑鲾為短吻鲾，ABGD分析也支持這一推測(cè)。短吻鲾和頸帶鲾?shù)谝缓偷诙鞒煞侄茧y以區(qū)分；形態(tài)聚類(lèi)圖上(圖3)首先獨(dú)自聚類(lèi)，在判別分析圖中重心沒(méi)有重疊，表明二者表觀形態(tài)較為相似，但也仍具有一些差異，需要仔細(xì)測(cè)量以避免形態(tài)鑒定出錯(cuò)。短吻鲾(Clade1)和頸帶鲾(Clade2)分支間遺傳距離為8.1%是分支內(nèi)(0.15%)的54倍，支持將二者作為獨(dú)立物種的觀點(diǎn)。

3.2 細(xì)紋鲾與曳絲鲾?shù)姆诸?lèi)地位

細(xì)紋鲾與曳絲鲾間遺傳距離僅為0.2%，不滿足DNA條形碼的分種標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。一方面，二者體型相似，體側(cè)均有蠕蟲(chóng)狀細(xì)紋，區(qū)別僅在于細(xì)紋鲾背鰭第二棘條短于體高，曳絲鲾背鰭第二棘條呈絲狀延長(zhǎng)，長(zhǎng)于體高；而魚(yú)類(lèi)捕撈及保存過(guò)程中操作不當(dāng)，易使絲狀的棘條殘缺，影響物種鑒定。另一方面，種間生殖隔離機(jī)制薄弱時(shí)易出現(xiàn)雜交情況[26]，雜交后代可能會(huì)偏向其中一種親本的形態(tài)，而線粒體為母系遺傳，造成鄰接樹(shù)上出現(xiàn)不同物種混雜在同一分支上的情況；推測(cè)二者為同種或?yàn)殡s交所致。由于曳絲鲾序列僅為GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載，因此需要獲得曳絲鲾標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)和DNA條形碼分析，補(bǔ)充測(cè)定核基因序列，并開(kāi)展生物學(xué)特征研究，方可準(zhǔn)確判斷物種分類(lèi)地位。

綜上所述，本研究鑒定了中國(guó)常見(jiàn)10種鲾科魚(yú)類(lèi)，表明DNA條形碼能夠用于快速鑒定鲾科魚(yú)類(lèi)。由于線粒體為母系遺傳，不能區(qū)分雜交物種，因而對(duì)于混雜成支的種類(lèi)，需要進(jìn)行詳細(xì)形態(tài)特征的統(tǒng)計(jì)分析，并使用雙親遺傳的核基因標(biāo)記綜合分析。由于本研究仍未能涉及所有中國(guó)鲾科魚(yú)類(lèi)物種，今后應(yīng)擴(kuò)大采樣范圍，增加樣品種類(lèi)及數(shù)量，并妥善保存樣本的鱗式及鰭式等性狀特征，以進(jìn)一步明確中國(guó)鲾科魚(yú)類(lèi)的分類(lèi)地位，為中國(guó)海洋漁業(yè)調(diào)查、種質(zhì)資源的管理和開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。