三七綠紫過(guò)渡莖可溶性糖和蛋白質(zhì)及花色苷和三萜皂苷的含量

張洪玲， 趙昶靈， 曾曉玲， 文國(guó)松， 徐紹忠， 臧靈飛， 古朝山

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

云南省文山州生產(chǎn)的三七是享譽(yù)世界的三七道地藥材，因其花色苷的合成和積累量存在縱向上的不均勻性，該州大田種植的一年生三七(Panaxnotoginseng)綠紫過(guò)渡莖具有奇異的黃金分割式紫化現(xiàn)象，即過(guò)渡莖約1/3的莖段呈紫色，且紫色明顯集中于莖上、中部的黃金分割點(diǎn)處[1]。事實(shí)上，作為次生產(chǎn)物，花色苷和三萜皂苷均是三七過(guò)渡莖的特征性化合物，一方面，過(guò)渡莖皮層薄壁組織外側(cè)2～3層細(xì)胞中積累的花色苷決定了莖的紫色[1-2]，另一方面，與三七其他營(yíng)養(yǎng)器官一樣，過(guò)渡莖也含三七的藥理活性成分三萜皂苷[3]。前期初步研究表明，從頂端至基部，過(guò)渡莖中的花色苷和三萜皂苷含量不均一，且在縱向上的變化表現(xiàn)出迥異的趨勢(shì)[1,4]，理論上這種現(xiàn)象與可溶性糖和蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性應(yīng)主要源于合成方面的原因，同時(shí)該現(xiàn)象也可能與莖的脅迫響應(yīng)需求有關(guān)。從生物合成角度看，三七過(guò)渡莖細(xì)胞中可溶性糖和蛋白質(zhì)均應(yīng)與花色苷和三萜皂苷合成密切關(guān)聯(lián)，一方面，在花色苷和三萜皂苷合成途徑共有的成苷反應(yīng)中，糖是底物之一，即花色苷和三萜皂苷元在爭(zhēng)奪糖時(shí)存在競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，故細(xì)胞中可溶性糖含量同時(shí)制約了花色苷和三萜皂苷的合成與積累量[5-6]，但其制約程度仍不清楚；另一方面，高等植物細(xì)胞中的可溶性蛋白質(zhì)絕大部分是酶，故過(guò)渡莖細(xì)胞中可溶性蛋白質(zhì)含量可能與細(xì)胞中花色苷和三萜皂苷的合成能力存在差異性相關(guān)[7]。此外，在微生態(tài)和脅迫響應(yīng)的角度，三七過(guò)渡莖在縱向上的不同部位面臨紫外光-B強(qiáng)度和病菌種群與數(shù)量等不完全相同，可溶性糖和蛋白質(zhì)及2種苷因在脅迫響應(yīng)中的功能差異而以不同數(shù)量共同積累于莖的不同部位，如可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和花色苷可發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)活性[8-9]，可溶性蛋白質(zhì)和花色苷又同時(shí)具備紫外光-B吸收活性[9-10]，而皂苷則主要發(fā)揮抗菌作用[11]。迄今，文山州一年生三七綠紫過(guò)渡莖中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、總花色苷和總?cè)圃碥蘸靠v向變化之間的相關(guān)性仍為研究空白，因此，筆者等以一年生三七綠紫過(guò)渡莖為材料，并以各莖段可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、花色苷及三萜皂苷4種化合物含量為研究切入點(diǎn)，通過(guò)對(duì)三七綠紫過(guò)渡莖中4種化合物含量縱向變化之間相關(guān)性的分析，解析綠紫過(guò)渡莖中花色苷和三萜皂苷合成的關(guān)聯(lián)特征及可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)對(duì)花色苷及三萜皂苷合成的差異性貢獻(xiàn)，旨在為三七綠紫過(guò)渡莖中花色苷和三萜皂苷合成相關(guān)性及三七抗性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集與預(yù)處理

2017年9-12月于云南省文山州的苗鄉(xiāng)三七科技有限公司種植園(23°31′48″N，104°19′21″E，海拔1 540 m)采集三七綠紫過(guò)渡莖植株。三七以壟作種植，壟寬150 cm，壟高30 cm，壟溝寬30 cm、深20 cm。棚頂及棚四周覆2層黑色聚乙烯遮陽(yáng)網(wǎng)，棚頂遮陽(yáng)網(wǎng)距壟面約1.45 m。采樣時(shí)，隨機(jī)采集健康的綠紫過(guò)渡莖植株80株，重復(fù)3次(共240株)，將植株假植于紙杯中?；貙?shí)驗(yàn)室后，在葉柄基部剪去復(fù)葉、在根莖交界處剪去根狀莖，將地上莖均分為18段，從莖的頂端向基部，依次將莖段編號(hào)為1～18；加液氮將莖段研磨成粉，置-80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 三七綠紫過(guò)渡莖莖段可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、總花色苷和總?cè)圃碥蘸康臏y(cè)定

1.2.1 可溶性糖 莖段的可溶性糖含量(soluble sugar content，SSC)用硫酸-蒽酮法測(cè)定、以蔗糖為標(biāo)樣[12]，取莖段粉0.200 g，加5 mL水磨成勻漿；轉(zhuǎn)入25 mL具塞試管，用15 mL水分5次洗滌乳缽；將試管置沸水浴30 min，取出，冷至室溫，過(guò)濾、定容至100 mL。

1.2.2 可溶性蛋白質(zhì) 莖段的可溶性蛋白質(zhì)含量(soluble protein content，SPC)用考馬斯亮藍(lán)G250(Bio-Rad,USA)法測(cè)定、以牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich,St. Louis,USA)為標(biāo)樣[12]，取莖段粉0.200 g，加10 mL水磨成勻漿，定容至100 mL；加5 mL 100 μg/mL G250液進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.3 總花色苷 莖段的總花色苷含量(total anthocyanin content,TAC)以“色價(jià)”度量[13-14]，取莖段粉0.500 g，加含1%濃鹽酸(v/v)的甲醇30 mL磨成勻漿，在黑暗中濾入50 mL容量瓶，定容；檢測(cè)濾液在529.8 nm和657.0 nm處的吸光值，分別記為A529.8和A657.0；莖段TAC=(A529.8-0.25A657.0)/g FW。

1.2.4 總?cè)圃碥?莖段的總?cè)圃碥蘸?total triterpenenoid saponin content,TTSC)以香草醛-高氯酸比色法測(cè)定，以人參皂苷Rgl(上海源葉生物科技有限公司)為標(biāo)樣[14]：取莖段粉0.5000 g至25 mL容量瓶中，加75%乙醇20 mL，用超聲波(50 Hz，100 W)處理20 min，過(guò)濾、定容至100 mL；取0.3 mL提取液進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

化合物含量的檢測(cè)均重復(fù)2次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析和雙因素相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七綠紫過(guò)渡莖可溶性糖含量的縱向變化特征

從圖1看出，三七綠紫過(guò)渡莖可溶性糖含量(SSC)從莖頂端向基部總體表現(xiàn)為逐漸上升的3峰曲線，3個(gè)峰分別出現(xiàn)在4、7和11莖段，且莖段11的SSC最高，約為64.68 mg/g FW，而莖段2的最低，約為17.57 mg/g FW。此外，莖段10～18的SSC總和約為444.92 mg/g FW，約為莖段1～8總和的1.89倍。因此，在一年生三七綠紫過(guò)渡莖中，可溶性糖主要集中在莖的下半段。方差分析結(jié)果顯示，三七綠紫過(guò)渡莖SSC在各莖段間的差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。

圖1 三七綠紫過(guò)渡莖莖段的可溶性糖含量

Fig.1 Soluble sugar content in stem segments of green-purple transitional stem ofP.notoginseng

2.2 三七綠紫過(guò)渡莖可溶性蛋白質(zhì)含量的縱向變化特征

從圖2看出，三七綠紫過(guò)渡莖可溶性蛋白質(zhì)含量(SPC)從莖頂端向基部總體表現(xiàn)為波浪形上升曲線。莖段1的SPC最低，約為0.06 mg/g FW，莖段15的SPC最高，約為1.65 mg/g FW。此外，莖段1～6、7～12和8～13的SPC之和分別為2.27 mg/g FW、7.34 mg/g FW和8.47 mg/g FW。因此，在一年生三七綠紫過(guò)渡莖中，可溶性蛋白質(zhì)主要集中在莖的中、下部。方差分析表明，一年生三七綠紫過(guò)渡莖SPC在各莖段的差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。

圖2 三七綠紫過(guò)渡莖莖段的可溶性蛋白質(zhì)含量

Fig.2 Soluble protein content in stem segments of green-purple transitional stem ofP.notoginseng

2.3 三七綠紫過(guò)渡莖總花色苷含量的縱向變化特征

從圖3看出，三七綠紫過(guò)渡莖總花色苷含量(TAC)從莖頂端向基部表現(xiàn)為單峰曲線，峰值出現(xiàn)在莖段7，該莖段TAC約為1.45(A529.8-0.25A657.0)/g FW，即峰出現(xiàn)在莖中上部紫色最集中的黃金分割點(diǎn)處，這與文獻(xiàn)[1]和文獻(xiàn)[15]報(bào)道的結(jié)果一致。莖段1～9和10～18的TAC總和分別約為10.26(A529.8-0.25A657.0)/g FW和3.31(A529.8-0.25A657.0)/g FW，前者比后者高約209.97%。說(shuō)明一年生三七綠紫過(guò)渡莖的花色苷主要集中在莖的中、上部。方差分析結(jié)果顯示，三七綠紫過(guò)渡莖TAC在各莖段間的差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

圖3 三七綠紫過(guò)渡莖莖段的總花色苷含量

Fig.3 Total anthocyanin content in stem segments of green-purple transitional stem ofPanaxnotoginseng

2.4 三七綠紫過(guò)渡莖總?cè)圃碥蘸康目v向變化特征

三七綠紫過(guò)渡莖總?cè)圃碥蘸?TTSC)從莖頂端向基部表現(xiàn)為 “V形”曲線(圖4)。莖段7(莖中上部的黃金分割點(diǎn)處)的TTSC最低，約為0.75 mg/g FW，與文獻(xiàn)[1]和[15]報(bào)道的結(jié)果一致。莖段1～3、4～13和14～18的TTSC分別約為4.39 mg/g FW、9.46 mg/g FW和7.93 mg/g FW。因此，一年生三七綠紫過(guò)渡莖的三萜皂苷主要集中在莖的頂部和基部。方差分析結(jié)果顯示，三七綠紫過(guò)渡莖不同莖段TTSC的差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)，說(shuō)明三萜皂苷在三七過(guò)渡莖中的縱向分布趨于均勻。

圖4 三七綠紫過(guò)渡莖莖段的總?cè)圃碥蘸?/p>

Fig.4 Total triterpenoid saponin content in stem segments of green-purple transitional stem ofP.notoginseng

2.5 三七綠紫過(guò)渡莖莖段可溶性糖、可溶性蛋白、總花色苷和總?cè)圃碥蘸康南嚓P(guān)性

從表1看出一年生三七綠紫過(guò)渡莖莖段可溶性糖(SSC)、可溶性蛋白質(zhì)(SPC)、總花色苷(TAC)和總?cè)圃碥?TTSC)4種化合物含量縱向變化之間呈不同的相關(guān)性。SSC與SPC、SSC與TTSC及SPC與TTSC之間均呈正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著；SPC與TAC之間呈顯著負(fù)相關(guān)，SPC與TAC以及TAC與TTSC之間均呈極顯著負(fù)相關(guān)。

SSC與TTSC的相關(guān)系數(shù)(0.449)大于SSC與TAC的相關(guān)系數(shù)(-0.738**)，且SPC與TTSC間的相關(guān)系數(shù)(0.088)也大于SPC與TAC間的相關(guān)系數(shù)(-0.587*)，因此推測(cè)，在一年生三七綠紫過(guò)渡莖中，可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)均優(yōu)先貢獻(xiàn)于三萜皂苷合成?；ㄉ蘸腿圃碥找蛟诔绍辗磻?yīng)中存在對(duì)糖的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系而表現(xiàn)為含量上的極顯著負(fù)相關(guān)(-0.772**)[5-6]。

表1三七綠紫過(guò)渡地上莖莖段可溶性糖、可溶性蛋白、總花色苷和總?cè)圃碥蘸康腜earson相關(guān)系數(shù)

Table 1 Pearson correlation coefficients between soluble sugar,soluble protein,total anthocyanin and total triterpenoid saponin content in stem segments of green-purple transitional stem ofP.notoginseng

項(xiàng)目 Item可溶性蛋白質(zhì)含量 SPC總花色苷含量 TAC總?cè)圃碥蘸?TTSC可溶性糖含量SSC0.440-0.738??0.449可溶性蛋白質(zhì)含量SPC1-0.587?0.088總花色苷含量TAC1-0.772??

注：**和*分別表示在P<0.01和P<0.05水平上相關(guān)性顯著.

Note: ** and * indicate significance of difference atP<0.01 andP<0.05 level respectively.

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，從一年生三七綠紫過(guò)渡莖的頂端到基部，莖的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、總花色苷和總?cè)圃碥盏暮靠傮w上分別表現(xiàn)為逐漸上升的3峰、波浪形上升、單峰和V形曲線，其中，總花色苷含量的最大值和總?cè)圃碥蘸康淖钚≈稻霈F(xiàn)在莖的上、中部即黃金分割點(diǎn)處；可溶性糖含量和可溶性蛋白質(zhì)含量在各莖段間的差異均達(dá)極顯著水平，總花色苷含量差異達(dá)顯著水平，而總?cè)圃碥蘸坎町愇催_(dá)顯著水平?？扇苄蕴呛亢涂扇苄缘鞍踪|(zhì)含量均與總花色苷含量呈負(fù)相關(guān)、與總?cè)圃碥蘸砍收嚓P(guān)，總花色苷含量和總?cè)圃碥蘸恐g則呈極顯著負(fù)相關(guān)。因此，在一年生三七綠紫過(guò)渡莖中，可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)均優(yōu)先貢獻(xiàn)于三萜皂苷的合成。

云南省文山州大田種植三七的營(yíng)養(yǎng)器官因強(qiáng)烈紫外光-B、低溫和干旱等文山低緯高原的特殊生態(tài)因子而普遍發(fā)生紫化，但地上莖是紫化出現(xiàn)最早、最明顯的器官[16]，而且，一年生三七的綠紫過(guò)渡莖還存在神奇的黃金分割式紫化[1,15]。因此，綠紫過(guò)渡莖因同時(shí)合成花色苷和三萜皂苷而成為探究三七花色苷和三萜皂苷合成相關(guān)性的合適器官[1]。但是，對(duì)于三七過(guò)渡莖，花色苷積累展示的紫化更多地屬于表象層次的、次要的反應(yīng)，而三萜皂苷的合成是綠紫過(guò)渡莖在生存中更深層次的、基本的需要；在細(xì)胞、組織層次，花色苷和三萜皂苷分別定位于莖皮層薄壁組織外側(cè)和維管束中[1]，這可能是因?yàn)榫G紫過(guò)渡莖在微生境中面臨的病原菌等誘導(dǎo)三萜皂苷合成的脅迫比紫外光-B、低溫和干旱等誘導(dǎo)花色苷合成的脅迫嚴(yán)重得多、發(fā)生的頻率高得多或持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)得多[5,11]。

作為次生產(chǎn)物，花色苷和三萜皂苷在三七綠紫過(guò)渡莖中的同時(shí)合成與積累均是響應(yīng)脅迫的結(jié)果[5-6,11]，但花色苷和三萜皂苷合成存在相關(guān)性的生化機(jī)制目前還不完全清楚。作為解析生化機(jī)制的前提之一，花色苷和三萜皂苷合成生化途徑中的唯一關(guān)聯(lián)處是成苷反應(yīng)，該反應(yīng)需以糖作為底物之一[5，17]，這意味著綠紫過(guò)渡莖細(xì)胞中可溶性糖的積累量應(yīng)與花色苷和三萜皂苷的合成強(qiáng)度相關(guān)。同時(shí)，催化花色苷和三萜皂苷合成的酶存在于細(xì)胞的可溶性蛋白質(zhì)中[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在三七綠紫過(guò)渡莖中，可溶性糖含量和可溶性蛋白質(zhì)含量均與總花色苷含量呈顯著負(fù)相關(guān)、與總?cè)圃碥蘸砍收嚓P(guān)。其中，可溶性糖含量與總花色苷含量呈負(fù)相關(guān)，與秋冬變色期歐洲鵝耳櫪(Carpinusbetulus)葉片中的情況相反[18]，但可溶性蛋白質(zhì)含量與總花色苷含量呈負(fù)相關(guān)卻與秋冬變色期歐洲鵝耳櫪(C.betulus)葉片中的情況一致[18]，這可能是因程龍霞等[18]的研究?jī)H僅涉及花色苷而不涉及皂苷的含量；可溶性糖含量與總?cè)圃碥蘸砍收嚓P(guān)與無(wú)患子(Sapindusmukorossi)果實(shí)發(fā)育中的可溶性糖和皂苷含量存在正相關(guān)的情況類(lèi)似[19]，但與發(fā)育的大豆(Glycinemax)種子中可溶性糖和大豆皂苷含量存在顯著負(fù)相關(guān)的情況相反[20]，此外，可溶性蛋白質(zhì)含量與總?cè)圃碥蘸砍收嚓P(guān)也與發(fā)育的大豆(G.max)種子中可溶性蛋白質(zhì)和大豆皂苷含量存在顯著負(fù)相關(guān)的情況相反[20]，可能是因KIM等[20]的研究?jī)H僅涉及皂苷而不涉及花色苷的含量?？梢?jiàn)，在不同植物中或同株植物的不同器官中，可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)及總花色苷和總皂苷含量之間的相關(guān)性是不一致的。對(duì)于花色苷和皂苷同時(shí)合成的三七綠紫過(guò)渡莖而言，可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、總花色苷和總?cè)圃碥蘸恐g的相關(guān)性模式具有明顯的特殊性；在三七綠紫過(guò)渡莖中，三萜皂苷合成比花色苷合成更強(qiáng)勢(shì)，故可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)均與皂苷在含量上呈正相關(guān)，從而使莖中總花色苷含量與總?cè)圃碥蘸砍蕵O顯著負(fù)相關(guān)。