一對非綜合征型耳聾夫婦家系的遺傳分析

傅雅麗 查樹偉 呂年青 鄒文霓 周定杰 黃麗麗 許豪勤

江蘇省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所(南京，210036)

遺傳性耳聾具有廣泛的遺傳異質(zhì)性，根據(jù)是否伴有其他器官的異常，分為綜合征型耳聾(SHI)和非綜合征型耳聾(NSHI)。NSHI占所有遺傳性耳聾的70%，主要有常染色體顯性、常染色體隱性、X-連鎖和線粒體突變母系遺傳4種遺傳方式，Y-連鎖遺傳較罕見[1-2]。截止到2015年5月，全世界學(xué)者共鑒定出97個綜合征型耳聾基因和152個非綜合征型耳聾基因位點(diǎn)[3]。本文報(bào)告對NSHI夫婦家系應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩查致病基因分型，分析遺傳學(xué)特征，為遺傳咨詢和生育指導(dǎo)提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

江蘇省淮安市漣水縣的一對NSHI夫婦家系，共3代15人，其中7人為耳聾患者。除有特殊家庭情況(Ⅱ-5和Ⅱ-6)及年齡尚小(Ⅲ-1)的家系成員以外，其余12名均收集到詳細(xì)的臨床資料及血樣。

1.2 家系調(diào)查方法

調(diào)查耳聾患者病史，包括發(fā)病年齡、原因、有無致聾性藥物應(yīng)用史、有無頭部外傷史，以及母親妊娠史等。調(diào)查的家系共15人，其中12人(包括4例耳聾者)接受了全身檢查，包括全身及耳鼻咽喉專科查體。根據(jù)調(diào)查結(jié)果繪制家系遺傳圖譜，依照特異的遺傳學(xué)規(guī)律及臨床特點(diǎn)對家系遺傳方式進(jìn)行分析。

1.3 主要試劑和儀器

基因組試劑盒(天根生物技術(shù)公司)；晶芯九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測試劑盒(北京博奧生物工程公司)；PCR擴(kuò)增試劑d NTP、Taq DNA聚合酶(北京博奧生物工程公司)；PCR擴(kuò)增儀(ABI公司)。Bio MixerTMII芯片雜交儀；晶芯LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀(北京博奧生物工程公司)。

1.4 標(biāo)本采集及DNA提取

家系成員均簽署知情同意書，收集耳聾患者血樣4份，聽力正常者血樣8份，提取DNA，測定濃度和純度，被檢測基因組DNA需滿足濃度90～100 ng/μl，純度260/280＝1.7～2.0，儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 基因芯片檢測[4]

采用基因芯片技術(shù)對中國人耳聾相關(guān)的常見4個基因9個位點(diǎn)(包括GJB2基因的35 del G、176 del 16、235 del C和299 del AT，GJB3基因的538C＞T，SLC26A4基因的IVS 7-2 A＞G，2168A＞G以及線粒體12S r RNA基因的1555 A＞G和1494 C＞T)進(jìn)行檢測[5-6]，通過芯片雜交，掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 家系表型

該家系3代15人中，7例耳聾患者無任何其他系統(tǒng)癥狀。7例耳聾患者：先證者(Ⅱ-3)，男性，34歲，先天性耳聾，無語言能力，無明顯致聾性藥物應(yīng)用史，智力、體格正常，其父母聽力正常；先證者弟弟(Ⅱ-1)，28歲，患耳聾，無明顯致聾性藥物應(yīng)用史；先證者妻子(Ⅱ-4)，36歲，先天性耳聾，無語言能力，無明顯致聾性藥物應(yīng)用史，其父母聽力正常；先證者妻子的哥哥(Ⅱ-5)，患耳聾；先證者及妻子育有1兒1女，均聽力正常。另外先證者弟妹(Ⅱ-2，23歲)、先證者侄子(Ⅲ-1，8個月)、先證者妻子的嫂子(Ⅱ-6)，為語前耳聾或先天性耳聾。見圖1。

圖1 非綜合征型耳聾家系圖譜

2.2 基因芯片檢測結(jié)果

對家系中12位成員進(jìn)行耳聾基因篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ⅰ代夫妻(Ⅰ-1和Ⅰ-2)聽力正常，基因型均為野生型，其所生的2個兒子(Ⅱ-1和Ⅱ-3)都為耳聾患者，基因型也均為野生型；先證者弟妹(Ⅱ-2)基因型為野生型；Ⅰ代夫妻(Ⅰ-3和Ⅰ-4)聽力正常，但先證者妻子的母親(Ⅰ-4)的基因型為線粒體DNA 12S r RNA 1555 A＞G均質(zhì)突變型。其所生的2個兒女(Ⅱ-4和Ⅱ-5)也均為耳聾患者，其中先證者妻子(Ⅱ-4)基因型和其母親相同，為線粒體DNA 12S r RNA 1555 A＞G均質(zhì)突變型，先證者妻子的哥哥(Ⅱ-5)和嫂子(Ⅱ-6)均為耳聾患者，但由于特殊家庭情況暫未檢測。Ⅱ代夫妻(Ⅱ-3和Ⅱ-4)所生的2個兒女(Ⅲ-2和Ⅲ-3)聽力均正常，但基因型為線粒體DNA 12S r RNA 1555 A＞G均質(zhì)突變型；Ⅱ代夫妻(Ⅱ-5和Ⅱ-6)所生的2個兒女(Ⅲ-4和Ⅲ-5)聽力均正常，基因型均為野生型；Ⅱ代夫妻(Ⅱ-1和Ⅱ-2)所生的1子(Ⅲ-1)由于年齡尚小暫未檢測。

3 討論

線粒體DNA 12S r RNA基因上常見的兩個突變位點(diǎn)是1555 A＞G和1494 C＞T。1993年P(guān)rezant等[7]最早發(fā)現(xiàn)1555 A＞G是最常見的與氨基糖苷類抗生素致耳聾(AAID)和母系遺傳NSHL相關(guān)的人類線粒體DNA突變。由于該突變會在線粒體DNA12S r RNA高度保守的A位上形成1494C-G1555堿基對，導(dǎo)致12Sr RNA在二級結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌的16S r RNA的相應(yīng)區(qū)域更加相似，使其與氨基糖苷類抗生素(Am An)的結(jié)合更加容易，從而抑制線粒體的氧化磷酸化過程造成耳毒性，導(dǎo)致聽力損失[8]。研究表明1555 A＞G基因位點(diǎn)突變的耳聾患者中由Am An誘導(dǎo)發(fā)生的僅為18%，其他約80%耳聾患者并無Am An的接觸史[9]。Lu等[10]分析了69個攜帶1555 A＞G突變的中國家系的臨床與遺傳特征，結(jié)果顯示在無Am An使用史時，家系成員耳聾平均外顯率為17.6%，平均發(fā)病年齡20歲；而在有Am An使用史時，家系成員耳聾平均外顯率為29.5%，平均發(fā)病年齡為14.5歲。

另外，1555 A＞G突變攜帶者的臨床表型差異很大，既有極重的先天性耳聾，也有遲發(fā)型聽力損傷，甚至有部分人聽力終生正常。戴樸等[11]對1555 A＞G或1494 C＞T突變家系進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，部分突變攜帶者有Am An應(yīng)用史，但未出現(xiàn)明顯聽力下降，表明臨床表型不同可能是與除Am An以外的環(huán)境因素、線粒體基因、核修飾基因等遺傳因素以及兩者共同作用的結(jié)果[12]。管敏鑫[13]研究顯示，線粒體DNA原發(fā)突變是導(dǎo)致耳聾的首要因子，Am An對其表型有促進(jìn)或誘導(dǎo)作用，而線粒體DNA單倍體和修飾基因在耳聾的發(fā)病過程中也起著重要作用。

本次研究家系成員中患者均除耳聾之外，無其他異常。芯片篩查結(jié)果顯示：先證者父母聽力正常，但先證者及其弟弟均表現(xiàn)為先天性耳聾，基因篩查均為野生型，尚未進(jìn)一步檢測致聾原因?，F(xiàn)階段檢測基本排除上述常見4個基因9個位點(diǎn)的突變導(dǎo)致耳聾的遺傳可能性，環(huán)境因素可能性大，尚不能排除未檢測的耳聾基因突變致聾的可能性；先證者妻子檢測結(jié)果為線粒體DNA 12S r RNA 1555 A＞G均質(zhì)突變型先天性耳聾；其母系成員檢測結(jié)果相同，但并未表現(xiàn)出聽力損失。根據(jù)家系資料調(diào)查，上述1555 A＞G突變的成員均是有血緣關(guān)系的母系成員，因此推斷耳聾致病原因很可能和線粒體DNA相關(guān)。雖然家系成員均自述無明確的Am An用藥史，但也不能排除該先證者妻子家系中母系成員可能對Am An敏感。在我國，Am An因具有抗菌譜廣、作用強(qiáng)、價格低等優(yōu)點(diǎn)，但其潛在性耳腎毒性反應(yīng)，對其易感人群，即使正?；蛭⒘克幬锒加锌赡茉斐陕犃p失[14]。本研究中先證者妻子1555 A＞G突變的母系成員應(yīng)避免Am An的使用，避免噪聲刺激，定期做聽力評估，做到早發(fā)現(xiàn)早干預(yù)。

本文為現(xiàn)階段工作總結(jié)，結(jié)果存在一定的局限性：由于和該家系的溝通欠佳，調(diào)查尚不完整，耳聾的臨床檢查結(jié)果較少，無法區(qū)分家系成員中患者的臨床亞型。研究所用的基因芯片僅包含常見的4個基因9個位點(diǎn)，未覆蓋全部突變位點(diǎn)。如先證者及其弟弟都表現(xiàn)為先天性耳聾，基因篩查結(jié)果顯示均為野生型，并不能確定受檢者是否有耳聾相關(guān)基因其他位點(diǎn)的突變。先證者妻子的母系成員均是1555 A＞G突變攜帶者，但臨床表型不一致。單純的線粒體DNA突變尚不足以造成耳聾的表型，不能排除該家系可能存在其他修飾因子如Am An、繼發(fā)突變、線粒體單體型、核基因等會對A1555突變的耳聾外顯率有影響，有待進(jìn)一步研究。目前已廣泛應(yīng)用的新一代測序技術(shù)(Solexa、454和SoLiD測序技術(shù))則是一種低成本、高通量、高效率的檢測技術(shù)[15]。如果條件允許，可以完善家系調(diào)查，采用多種方法測序，進(jìn)一步明確此家系耳聾發(fā)生的致病因素。