嗜水氣單胞菌氣溶素的表達(dá)純化和活性實驗

董靖，劉永濤，胥寧，楊秋紅，楊移斌，艾曉輝

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223)

嗜水氣單胞菌 (Aeromonashydrophila)是一種人獸魚共患病原菌，廣泛分布于水體、土壤和環(huán)境中，能夠引起淡水養(yǎng)殖魚類、陸生動物和人的多種疾病[1]。嗜水氣單胞菌及其他運動性氣單胞菌是可在世界范圍內(nèi)傳播的水產(chǎn)動物致病菌，國內(nèi)外的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)常因嗜水氣單胞菌感染而導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失[2]。嗜水氣單胞菌感染魚類后可以引起運動性氣單胞菌敗血癥和出血性敗血癥，使患病魚出現(xiàn)爛鰓、爛尾、豎鱗和潰瘍等癥狀[3-4]。此外，Yousr等[5]研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌可以通過水和未煮熟的水產(chǎn)品傳染給人類。人感染該菌后能夠?qū)е履c胃炎、敗血癥及全身性感染，嚴(yán)重時甚至可危及生命[6]?？股厥悄壳坝糜谥委熂?xì)菌性疾病的主要手段，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，嗜水氣單胞菌感染的治療也主要依賴于抗生素，但由于長期不合理的藥物使用，導(dǎo)致該病原菌產(chǎn)生耐藥性[7]。此外，抗生素的不合理使用會造成水產(chǎn)品中藥物殘留超標(biāo)和水體中抗生素含量超標(biāo)，引起食品質(zhì)量安全問題和生態(tài)安全問題[8]。因此，近年來以毒力因子為靶標(biāo)的藥物研究受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[2]。

近年來，大量研究表明，嗜水氣單胞菌的致病力與其自身攜帶的毒力因子種類密切相關(guān)[9]。其中，嗜水氣單胞菌分泌的外毒素氣溶素是極其重要的毒力因子之一，是該菌引起各種疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，可以作為鑒別致病菌株的標(biāo)志[10]。氣溶素是一種水溶性蛋白，其前體經(jīng)蛋白酶酶切后成為具有生物學(xué)活性的氣溶素，具有細(xì)胞毒性、溶血性和腸毒性[11]。氣溶素通過特定的糖蛋白受體結(jié)合到真核細(xì)胞表面，形成具有孔道的七聚體插入到脂質(zhì)雙分子層中，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。

基于以上情況，本研究通過研究重組氣溶素的純化方法和生物活性，以期篩選能抑制氣溶素活性的小分子化合物，為抗嗜水氣單胞菌藥物的研發(fā)提供新思路。目前國內(nèi)學(xué)者對氣溶素的表達(dá)、純化和生物活性測定進行了大量的研究，但大部分研究得到的主要目的產(chǎn)物為包含體，且未對重組蛋白進行精細(xì)純化[13-15]，不利于藥物篩選和功能性試驗的開展。因此，本研究在總結(jié)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用含有谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽的pGEX-6p-1 載體構(gòu)建了重組載體，以期提高重組蛋白的可溶性。通過優(yōu)化表達(dá)溫度和誘導(dǎo)時間，建立了氣溶素前體(Pre-AerA)可溶性蛋白的表達(dá)方法，同時建立了氣溶素的離子交換純化方法，得到了純度95%以上的目的產(chǎn)物，并對其溶血活性進行了測定，為進一步研究以氣溶素為靶標(biāo)的抗嗜水氣單胞菌的小分子藥物開展鋪墊性工作。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

嗜水氣單胞菌ATCC7966購自中國科學(xué)院微生物研究所，原核表達(dá)載體pGEX-6p-1、大腸桿菌克隆菌株DH5α、表達(dá)菌株BL21(DE3)購自武漢擎科生物科技公司，DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶和IPTG購自Thermo Scientific公司，DNA片段凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega公司，Glutathione Sepharose 4B購自美國GE Healthcare公司。

1.2 目的基因擴增

根據(jù)GenBank中嗜水氣單胞菌ATCC7966株的基因組序列(NC008570.1)設(shè)計特異性引物，為了便于連接載體分別在上下游引物的5′端添加BamHI和NotI酶切位點。以ATCC7966菌株的全基因組為模板擴增全長的氣溶素(aerA)基因，用DNA片段凝膠回收試劑盒純化DNA片段。

1.3 分子克隆和鑒定

將純化回收的aerA片段和pGEX-6p-1載體用BamHI和NotI雙酶切，回收后將片段與載體以3∶1(V/V)混合后加入T4 DNA連接酶,置于16 ℃水浴中過夜連接。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中并涂布到含有100 μg/mL氨芐西林抗生素的LB平板上，平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。隨機挑取平板上的單菌落,置于含有100 μg/mL氨芐西林抗生素的液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)16 h，提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，陽性質(zhì)粒進行雙酶切鑒定并測序。

1.4 誘導(dǎo)表達(dá)分析

選取測序正確的質(zhì)粒樣品轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，從LB平板上挑取單菌落，接種至含有100 μg/mL氨芐西林抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)后的菌液按1∶100(V/V)的比例接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中(含有100 μg/mL氨芐西林)擴大培養(yǎng)，檢測培養(yǎng)物的OD600nm吸收值。當(dāng)OD600nm達(dá)到0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)6 h后于10 000 r/min下離心收集菌體，用PBS重懸后，通過12% SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。

1.5 表達(dá)形式分析

為了得到具有活性的可溶性蛋白，本實驗研究了溫度對重組蛋白表達(dá)形式的影響。當(dāng)菌液OD600nm達(dá)到0.6～0.8時，將菌液分別放置在37 ℃和16 ℃搖床中，分別加入終濃度為1 mmol/L和0.2 mmol/L的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)6 h后收集菌體。菌體用PBS重懸后，分別加入終濃度為1 mg/mL的溶菌酶，于冰上反應(yīng)30 min，結(jié)束后以15 000 r/min離心10 min，分別收集上清和沉淀，通過12% SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀中的目的蛋白。

1.6 誘導(dǎo)時間優(yōu)化

為了使重組蛋白表達(dá)量最大化，分析了不同誘導(dǎo)時間下的蛋白表達(dá)量。分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的4、8、12、16和20 h收集菌體，通過12% SDS-PAGE電泳分析誘導(dǎo)時間對蛋白表達(dá)量的影響。

1.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組菌株接種至20 mL含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)過夜，然后按照1∶100(V/V)的比例將菌液轉(zhuǎn)接至1 L含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃中培養(yǎng)至OD600nm為0.6時將菌液降溫至16 ℃，然后加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，置于16 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)16 h。5 000 r/min收集菌體，并重懸于PBS溶液中。

將收集的菌體超聲破碎，4 ℃條件下16 000 r/min離心30 min,收集裂解上清，加入到Glutathione SepharoseTM4B 親和層析柱中，以重力反復(fù)過柱3次，然后用PBS洗脫雜蛋白，加入PreScission蛋白酶(1 mg/mL)在4 ℃中酶切過夜。用PBS洗脫目的蛋白,收集的目的蛋白用超濾管超濾脫鹽，將緩沖液替換為離子交換A液(20 mmol/L Bis-Tris，pH 6.8)。脫鹽后的目的蛋白過Hitrap Q陰離子交換柱，以離子交換B液(20 mmol/L Bis-Tris，500 mmol/L NaCl，pH 6.8)洗脫目的蛋白，收集含有目的蛋白的組分，進行SDS-PAGE分析。將純度較高的目的蛋白合并，通過超濾法將緩沖液替換為AerA儲存液(25 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，pH 8.2)，測定濃度后置于-80 ℃冰箱保存。

1.8 重組Pre-AerA的溶血活性測定

取純化的Pre-AerA，加入胰蛋白酶使其終濃度為10 μg/mL，在室溫條件下酶切10 min以激活，然后加入10倍濃度的胰蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)。AerA的溶血活性通過其對綿羊紅細(xì)胞的溶解能力來測定。在溶血緩沖液(20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，pH 7.2)中分別加入質(zhì)量濃度為64、32、16、8、4和2 ng/mL的AerA，然后加入25 μL脫纖維綿羊紅細(xì)胞，在37 ℃中孵育15 min，10 000 r/min離心后測定上清液OD543nm吸收值，以1% Triton X-100代替AerA作為陽性對照，溶血百分比計算公式見式(1)。一個單位的溶血活性(HU)定義為能夠?qū)е戮d羊紅細(xì)胞釋放出一半血紅蛋白需要的AerA的量。

式(1)

式(1)中，A表示吸光值。

2 結(jié)果

2.1 aerA-pGEX-6p-1表達(dá)載體構(gòu)建

通過PCR擴增得到了編碼Pre-AerA的DNA片段，圖1所示為aerA基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，發(fā)現(xiàn)在1 500 bp附近有特異性擴增條帶，其分子量大小與預(yù)期一致。該片段和載體經(jīng)雙酶切、連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中，挑取的4個單菌落經(jīng)菌液PCR鑒定后發(fā)現(xiàn)菌落1、3、4、5含有aerA基因，2號菌落為空載體菌液PCR對照(圖2)。提取陽性克隆菌落的質(zhì)粒后，經(jīng)雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)有5 kb左右的質(zhì)粒條帶和1.5 kb左右的目的基因條帶(圖3)，最終通過測序確定該片段與嗜水氣單胞菌ATCC7966菌株氣溶素基因同源性為100%。

圖1 aerA基因PCR電泳圖M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1和2: aerA基因。Fig.1Electrophoretogram of aerA gene by PCR amplificationM: DNA marker; 1 and 2: PCR product of aerA.

2.2 Pre-AerA的表達(dá)和條件優(yōu)化

重組表達(dá)菌在37 ℃、1 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，取菌體進行12% SDS-PAGE分析。從圖4中可以看到，與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的大腸桿菌在分子量約為81 kDa處有融合蛋白表達(dá)條帶，與理論分子量81 kDa一致，說明該重組載體在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中能夠表達(dá)。

圖2 菌液PCR鑒定電泳圖M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1, 3, 4, 5: 含有重組載體的菌液； 2: 空載體菌液。Fig.2Electrophoretogram of bacteria liquid PCRM: DNA marker; 1，3，4，5: PCR of recombinant vector; 2: PCR of blank vector.

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切電泳鑒定圖M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：質(zhì)粒雙酶切。Fig.3Electrophoretogram of double digestion of the recombinant plasmidM: DNA marker; 1: double digestion of the plasmid.

為了分析重組蛋白在不同溫度下的表達(dá)形式，分別分析了37 ℃和16 ℃兩個溫度誘導(dǎo)下的表達(dá)情況。收集的菌體經(jīng)溶菌酶裂解后高速離心，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。如圖5所示，16 ℃條件誘導(dǎo)下目的蛋白大部分位于裂解上清中，說明于16 ℃表達(dá)時該蛋白為可溶性表達(dá)；而37 ℃表達(dá)時目的蛋白位于裂解后的沉淀中，說明于37 ℃表達(dá)時該蛋白的表達(dá)形式為包含體。如圖6所示，為了得到最大表達(dá)量，對誘導(dǎo)時間進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入IPTG誘導(dǎo)16 h后，氣溶素融合蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大。因此，為了得到具有生物學(xué)活性的可溶性蛋白，在試驗中選擇的表達(dá)溫度為16 ℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)時間為16 h。

圖4 氣溶素融合蛋白預(yù)表達(dá)SDS-PAGE電泳圖M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 誘導(dǎo)前；2: 37 ℃誘導(dǎo)6 h。Fig.4SDS-PAGE gel of pre-AerA expressionM: protein marker; 1: before induction; 2: induced at 37 ℃ for 6 h.

圖5 不同溫度下的表達(dá)形式SDS-PAGE電泳圖M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 誘導(dǎo)前；2: 16 ℃誘導(dǎo)后菌體裂解上清；3: 16 ℃誘導(dǎo)后菌體裂解沉淀；4: 37 ℃誘導(dǎo)后菌體裂解上清；5: 37 ℃誘導(dǎo)后菌體裂解沉淀。Fig.5SDS-PAGE gel of the expressional form in different temperaturesM: protein marker; 1: before induction; 2: bacterial lysis supernatant after induced at 16℃; 3: bacterial lysis precipitation after induced at 16 ℃; 4: bacterial lysis supernatant after induced at 37 ℃; 5: bacterial lysis precipitation after induced at 37 ℃.

2.3 蛋白純化

將表達(dá)后的菌體超聲破碎和離心后，收集裂解上清液進行親和層析,得到初步純化的蛋白。將所得蛋白合并脫鹽后進行離子交換純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測得到純度較高的目的蛋白(圖7)。重組蛋白純度經(jīng)BandScan (Glyko)軟件初步計算大于95%，符合試驗要求。

圖6 不同誘導(dǎo)時間表達(dá)量SDS-PAGE電泳圖M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；0：誘導(dǎo)前；4：誘導(dǎo)4 h后；8：誘導(dǎo)8 h后；12：誘導(dǎo)12 h后；16：誘導(dǎo)16 h后；20：誘導(dǎo)20 h后。Fig.6SDS-PAGE gel of target protein induced with IPTG in different timesM: protein marker; 0: before induction; 4: induced for 4 h; 8: induced for 8 h; 12: induced for 12 h; 16: induced for 16 h; 20: induced for 20 h.

圖7 離子交換純化后的蛋白SDS-PAGE電泳圖M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 純化的氣溶素前體蛋白。Fig.7SDS-PAGE gel of recombinant protein after anion exchange purificationM: protein marker; 1: purified pro-aerolysin.

2.4 重組Pre-AerA的溶血活性

將胰蛋白酶激活的Pre-AerA蛋白加入到溶血體系中進行溶血試驗，結(jié)果如圖8所示，隨著AerA濃度的增加，其溶血活性逐漸增強。將受試蛋白能引起一半紅細(xì)胞裂解的量作為一個溶血單位(hemolytic unit，HU)，經(jīng)測定在本實驗條件下AerA對綿羊紅細(xì)胞的溶血單位為54.17 HU/μg。

圖8 不同質(zhì)量濃度氣溶素下綿羊紅細(xì)胞的溶血活性Fig.8 Hemolysis assay of aerolysin by sheep red blood cells

3 討論

很多病原菌通過分泌毒素導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，其中有一部分毒素能夠在靶細(xì)胞表面產(chǎn)生孔道致細(xì)胞損傷，這類毒素被稱為成孔毒素[16]。成孔毒素分為兩類，一類是能夠在細(xì)胞表面產(chǎn)生多孔結(jié)構(gòu)域而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的酶；另一類破壞細(xì)胞的滲透壓導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這一類也被稱為溶細(xì)胞素[17]。目前已發(fā)現(xiàn)和鑒定了多種細(xì)菌分泌的溶細(xì)胞素，其中AerA是最重要、研究最多的溶細(xì)胞素之一[18]。通過動物實驗已經(jīng)證明AerA是嗜水氣單胞菌的主要毒力因子，并與嗜水氣單胞菌的致病力密切相關(guān)[19]。AerA單體是分子量約為52 kDa的水溶性蛋白，在細(xì)菌中以前體形式表達(dá)并分泌到細(xì)胞外，能被細(xì)胞表面的弗林蛋白酶、消化酶或細(xì)菌分泌的蛋白酶酶切形成有活性的單體形式[20]。AerA單體本身不具備孔道結(jié)構(gòu)，為了成孔，需要結(jié)合到細(xì)胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPIs)受體上，聚合成孔后插入細(xì)胞膜中。GPIs受體是一組廣泛存在于真核細(xì)胞細(xì)胞膜上的糖脂復(fù)合物，因此多數(shù)真核細(xì)胞對AerA敏感[18]。

目前得到AerA純蛋白有從胞外成分中分離純化和原核表達(dá)純化兩種方式。從胞外成分中分離的蛋白具有較好的生物學(xué)活性，但其操作復(fù)雜且產(chǎn)率較低，因此近年來原核表達(dá)成為獲得AerA蛋白的主要方式。Pre-AerA是一種外分泌性蛋白，為了得到可在大腸桿菌胞內(nèi)高表達(dá)的Pre-AerA融合蛋白以便于后期純化，在設(shè)計PCR引物時去除了1～23位氨基酸的信號肽區(qū)域，以保證該基因在大腸桿菌胞內(nèi)的高效表達(dá)[21]。杜娜等[14]、盧強等[15]分別在PET28b和PET32a質(zhì)粒上構(gòu)建了氣溶素重組載體，但其表達(dá)形式為包含體。廖鏖等[22]采用pGEX-4T-1載體成功表達(dá)了含有GST標(biāo)簽的林蛙嗜水氣單胞菌氣溶素，但未對溫度和誘導(dǎo)劑濃度進行優(yōu)化，得到的重組蛋白均為包含體形式。朱大玲[13]研究了不同溫度下重組工程菌的表達(dá)形式，發(fā)現(xiàn)重組菌株在25 ℃時有少量Pre-AerA以可溶性蛋白形式表達(dá)，但大部分仍位于包含體中。本實驗為了提高Pre-AerA重組蛋白的可溶性表達(dá)，降低目的蛋白的包含體含量，選擇了能提高重組蛋白可溶性的pGEX-6p-1載體，該載體在重組蛋白N端含有分子量為26 kDa的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽。但在37 ℃，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時重組蛋白表達(dá)形式仍為包含體(圖5)。根據(jù)Vera等[23]研究發(fā)現(xiàn)降低溫度可以提高蛋白的正確折疊，使目的蛋白包含體形成最小化。因此本實驗嘗試將溫度降低至16 ℃，IPTG濃度降低為0.2 mmol/L后進行誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該條件下重組蛋白為可溶性表達(dá)(圖5)。

重組蛋白在親和層析后加入PreScission蛋白酶切除N端GST標(biāo)簽，在重組蛋白N端仍含有標(biāo)簽蛋白的5個氨基酸殘基(GPLGS)，但從溶血試驗結(jié)果分析，殘留的氨基酸未對Pre-AerA的功能產(chǎn)生影響。龔暉等[24]通過親和層析法純化得到了嗜水氣單胞菌氣溶素，發(fā)現(xiàn)其對綿羊紅細(xì)胞的溶血效價為6.4 HU/μg，涂小林等[25]通過硫酸銨沉淀、纖維素層析和凝膠過濾純化得到了氣溶素，發(fā)現(xiàn)其對鯽紅細(xì)胞的溶血效價為15.23 HU/μg。通過溶血單位比較發(fā)現(xiàn)本實驗所得到的氣溶素溶血活性遠(yuǎn)高于以上兩種方式，初步分析原因可能與溶血試驗方法、純化溫度條件、純化方法及終產(chǎn)物純度等因素有關(guān)。此外，氣溶素對不同動物來源的紅細(xì)胞的敏感性也有較大差異[25]。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了aerA-pGEX-6p-1原核表達(dá)載體，通過在目的蛋白N端融合提高可溶性的GST標(biāo)簽、降低表達(dá)溫度和誘導(dǎo)劑濃度等方法，在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中成功表達(dá)得到了可溶性Pre-AerA融合蛋白。融合蛋白經(jīng)Glutathione SepharoseTM4B親和層析柱初步純化并切除標(biāo)簽蛋白后，根據(jù)等電點選擇陰離子交換法對蛋白進行精細(xì)純化，最終得到了純度較高、電荷一致的重組蛋白。本實驗建立了重組氣溶素溶血活性的測定方法，其對綿羊紅細(xì)胞的溶血單位為54.17 HU/μg，為下一步藥物篩選和機制研究有較好的指導(dǎo)作用。