麥鯪(Cirrhina mrigola)肌肉組織在孔雀石綠陽性環(huán)境中的殘留消除規(guī)律

劉書貴，李麗春，單奇，尹怡，馬麗莎，趙城，戴曉欣，鄭光明

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)種質(zhì)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室(廣州)，農(nóng)業(yè)部休閑漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380)

孔雀石綠(malachite green, MG)又名堿性綠，是一類具有較強(qiáng)殺菌能力的染料類藥物，被廣泛用于紡織業(yè)、制陶業(yè)和皮革業(yè)，也作為食品染色劑和細(xì)胞化學(xué)染色劑等[1]使用，也曾被用于預(yù)防或治療水產(chǎn)動物的多種疾病，如水霉病、爛鰓病和小瓜蟲病等，特別在治療水霉病上具有顯著作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，若MG及其代謝物無色孔雀石綠(leucomalachite green, LMG)通過食物富集到人體內(nèi)，會對人體造成潛在致癌、致畸和致突變危害[4-5]。因此，多個國家水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)已禁用MG，中國水產(chǎn)養(yǎng)殖也在2002 年規(guī)定禁用MG[6]。但由于MG抗菌效果好、價格便宜等因素，偶有養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用。

MG 用于水產(chǎn)動物病害防治時通常采用藥浴全魚或魚卵的方式，偶有養(yǎng)殖戶為節(jié)省成本采用全塘潑灑的方式。劉書貴等[7]將200 μg/L MG進(jìn)行全塘潑灑，結(jié)果表明，2周后水體中檢測不到MG和LMG。但楊秋紅等[8]以全池潑灑的投藥方式，研究MG(池塘中MG的理論濃度為 1 mg/L)及LMG在斑點(diǎn)叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)肌肉和皮膚以及養(yǎng)殖水體和底泥中的殘留消除規(guī)律，發(fā)現(xiàn)MG和LMG至360 d時仍有檢出(5.92±1.23)μg/kg。程杏安等[9]監(jiān)測珠江三角洲10個池塘底泥中MG和LMG殘留，研究結(jié)果表明10個池塘中均有MG檢出。目前，MG 在水產(chǎn)動物體內(nèi)殘留消除規(guī)律的研究主要集中在雜交鱧(斑鱧Channamaculata♀×烏鱧Channaargus♂)[7]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[10]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[11]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[12]、鰻鱺(A．a(chǎn)nguilla)[13]、鯽(Carassiusauratus)[14]、羅非魚(Oreochromisspp．)[15-16]、斑點(diǎn)叉尾鮰(IetalurusPunetaus)[17]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[18]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[19-20]等品種。MG及其代謝物L(fēng)MG在水產(chǎn)動物體內(nèi)的代謝規(guī)律問題已引起高度關(guān)注。

麥鯪(Cirrhinamrigola)屬于硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、鯪屬(Cirrhinus)，是一種亞熱帶雜食性底層魚類，具有肉質(zhì)鮮嫩、養(yǎng)殖周期短、生長快、耐凍、病害少及可高密養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。自1982年從孟加拉國引入中國以來迅速得到推廣，現(xiàn)已成為華南地區(qū)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類和加工附加值較高的魚類之一[21]。又因其具與鱖(Sinipercachuatsi)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)等名貴魚類相似的生活習(xí)性，現(xiàn)常被作為餌料魚大量供應(yīng)于名優(yōu)魚類的高密度養(yǎng)殖中。值得關(guān)注的是，目前關(guān)于MG在麥鯪肌肉組織中代謝規(guī)律的相關(guān)研究尚未見報道，另經(jīng)MG陽性環(huán)境池塘養(yǎng)殖的麥鯪是否會造成以其為餌的名優(yōu)魚類體內(nèi)MG及其代謝產(chǎn)物L(fēng)MG的殘留問題的相關(guān)研究亦未見報道。

為探明上述問題，本研究模擬自然養(yǎng)殖條件，將潑灑過MG 的池塘換水后放養(yǎng)麥鯪，研究不同放養(yǎng)時間下麥鯪肌肉中的MG及其代謝物L(fēng)MG殘留量情況，探討MG/LMG在其體內(nèi)的殘留消除規(guī)律，以期豐富MG在魚類的代謝富集研究，同時為加強(qiáng)MG的違規(guī)使用監(jiān)管及溯源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與養(yǎng)殖場所

無MG及LMG殘留的麥鯪由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所良種基地提供，平均體重為(2.68±0.51)g，體長為(5.50±0.50)cm，約20 000尾，養(yǎng)殖場所位于廣東省高要市中國水產(chǎn)科學(xué)研究院高要良種科技園2個水泥養(yǎng)殖池 (池面積12 m2)。

1.1.2 試劑與藥品

MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)品，純度 ≥ 95%(Dr.Ehrenstorfer公司)；孔雀石綠-D5(D5-MG)和無色孔雀石綠-D6(D6-LMG)標(biāo)準(zhǔn)品，純度>99%(Witega公司)。甲酸購自日本TCI公司，乙腈和甲醇購自德國Merck公司，石墨化炭黑(GCB)購自Agela公司。乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)，冰乙酸、無水乙酸銨均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.1.3 主要儀器

包括e2695-Quattro Micro API三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(Waters 公司)；超聲波水浴(寧波新芝公司)；DL-5M離心機(jī)(上海飛鴿公司)；IKA MS3漩渦振蕩器(德國IKA公司)；IKA T18勻漿機(jī)(德國IKA公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Eyela公司)等。

1.2 殘留消除實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

兩個養(yǎng)殖池(4.0 m×3.0 m×0.8 m)分別鋪10 cm無MG和LMG殘留的底泥，待底泥硬化后蓄水，然后潑灑MG使之質(zhì)量濃度為1 mg/L，放置7 d后換水，并分別放2 500尾麥鯪進(jìn)行試驗(yàn)。1年后對其分別換水，使水位和初始水位保持一致，再分別放7 500尾麥鯪進(jìn)行試驗(yàn)，用陰性飼料喂養(yǎng)并測定水溫。

1.2.2 樣品采集

初次放養(yǎng)麥鯪后，于0、0.5、1、2、3、5、10、15、20和30 d取麥鯪樣品；次年再次放養(yǎng)后于0、1、2、5、10、15、20、30、40、50、70、90、120、150和180 d取麥鯪樣品，每個時間點(diǎn)從2個水泥池中分別采集4個樣品，每個樣品重量以滿足檢測為宜。去頭和內(nèi)臟后取肌肉組織于-20 ℃條件下保存，待測。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可考慮采集更長時間點(diǎn)的樣品。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液依據(jù)參考文獻(xiàn)[22]配制。

1.3.2 樣品前處理

稱取5.0 g已絞碎肌肉組織樣品于50 mL離心管中，加入200 μL 100 ng/mL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入5 g無水硫酸鎂和11 mL乙腈，超聲波振蕩提取2 min，8 000 r/min勻漿提取30 s，4 200 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中；另取一支50 mL離心管加入11 mL乙腈，洗滌刀頭10 s，洗滌液移入前一離心管中；用玻璃棒搗碎離心管中沉淀，渦旋振蕩30 s，超聲波振蕩5 min，4 200 r/min離心5 min，上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25 mL，搖勻備用。

準(zhǔn)確移取5.00 mL樣液于磨口玻璃管中，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，準(zhǔn)確加入2.00 mL乙腈5 mmol/L乙酸銨溶液(1∶1，V/V)后轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，加入50 mg PSA+10 mg GCB，渦旋混合1 min，12 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜后供HPLC-MS/MS測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為XTerra MS C18柱，100.0 mm×2.1 mm(i.d.)，粒度3.5 μm。流動相A為乙酸銨緩沖溶液(5 mmol/L，pH 4.5)，流動相B為乙腈，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，流速0.20 mL/min，梯度洗脫條件見表1。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子化模式為ESI+；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流速 700 L/h；電離電壓3.5 kV；掃描模式為反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Conditions of gradient elution

注：流動相A為乙酸銨緩沖溶液，流動相B為乙腈。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters

注：標(biāo)注“*”的子離子用作定量分析。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與測定

將“1.3.1”中的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制成0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0和200.0 ng/mL，共8個質(zhì)量濃度注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，在0.5～200.0 ng/mL范圍內(nèi)，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)Y、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.6 回收率及精密度的測定

在空白樣品中加入5.0、10.0和100.0 μg/kg 3個含量水平MG及其LMG標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3.2”樣品處理方法進(jìn)行處理，每個加標(biāo)水平測定6份平行樣，計算方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)以衡量方法的精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

在質(zhì)量濃度1.0～200.0 ng/mL范圍內(nèi)，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)Y、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，MG和LMG的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y=1.035 78X+0.854 70和Y=1.475 25X+0.258 50，相關(guān)系數(shù)r分別為0.999 4和0.998 2。因而在該濃度范圍內(nèi)MG和LMG分別呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。該方法檢出限與定量限均為0.50 μg/kg。

2.2 回收率和精密度

在加標(biāo)水平5.0～100.0 μg/kg范圍內(nèi)時，所得到的MG和LMG的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。MG在5.0～100.0 μg/kg范圍內(nèi)平均回收率為92.50%～101.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.36%～7.57%，而LMG在5.0～100.0 μg/kg范圍內(nèi)平均回收率為89.40%～94.60%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.26%～5.21%。

表3 空白樣品加標(biāo)回收率和精密度Tab.3 Recoveries of spiked samples and RSDs n=6

2.3 首次放養(yǎng)MG和LMG在麥鯪肌肉中的殘留量分析

首年6月份將麥鯪首次放養(yǎng)于水溫(31±1.5)℃池中30 d，記錄肌肉中MG和LMG在不同時間點(diǎn)的殘留量(表4)及變化趨勢(圖1)。MG殘留量先隨時間波動式上升后逐漸下降至160.00 μg/kg左右達(dá)到動態(tài)平衡, LMG殘留量同樣先隨時間波動式上升后逐漸下降至3 370.00 μg/kg左右并達(dá)到動態(tài)平衡。2 d時MG和LMG殘留量結(jié)果變化較大，可能由于其內(nèi)臟去除不完全導(dǎo)致。本實(shí)驗(yàn)中，首次樣本放養(yǎng)量預(yù)估不足，導(dǎo)致采樣時間只持續(xù)30 d，為此在次年放養(yǎng)中將每池塘的放養(yǎng)量由2 500尾增加至7 500尾。

表4 MG浸染池塘中養(yǎng)殖鯪肌肉組織中MG和LMG的殘留量Tab.4 Residues of MG and LMG in Cirrhinamrigola samples from pond pretreated with MG

2.4 次年再次放養(yǎng)MG和LMG在麥鯪肌肉中的殘留量分析

次年6月相同水溫的池塘再次放養(yǎng)麥鯪后，記錄肌肉中MG和LMG在實(shí)驗(yàn)過程中不同時間點(diǎn)的殘留量(表5)及變化趨勢(圖2)。0～70 d 期間，MG一直維持在(1.43±2.45)～(4.98±2.01)μg/kg，直到90 d后未檢出， LMG在0～5 d殘留量從(3.10±2.31)μg/kg上升到(105.30±8.25)μg/kg，隨后波動式下降直至180 d低于定量限(0.50 μg/kg)。這可能是因?yàn)槭啄晁w中MG被底泥吸附，次年經(jīng)換水放養(yǎng)麥鯪后，麥鯪將通過食底泥中有機(jī)物而富集其中的MG。楊秋紅等[8]將MG在水中溶解后進(jìn)行全池潑灑，在用藥后在水體MG含量為1 mg/L時左右采集水樣和底泥進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示泥底中MG在0～270 d一直維持在(0.50±0.01)～(1.83±0.01)μg/kg范圍內(nèi)，而LMG呈現(xiàn)出近似于蓄積的趨勢，起始含量小于0.5 μg/kg，隨后含量逐步增高，直至360 d出現(xiàn)最高含量(5.92±1.23) μg/kg；水樣中LMG 除在第1、3、15 天檢出，其余均未檢出。而 MG在水樣中的變化更為直觀，第1 天質(zhì)量濃度最高為(46.44±7.39) μg/L，隨后急劇降至1 μg/L左右，并保持穩(wěn)定。由此可推測，養(yǎng)殖水體中 MG和LMG殘留量迅速下降，底泥可吸附水體中MG。本研究中，次年將陽性池塘中的水換掉后再次放養(yǎng)麥鯪，其肌肉中仍有MG和LMG檢出，說明使用過MG的池塘難以在短時間(1～2年)內(nèi)徹底清除MG，對養(yǎng)殖對象產(chǎn)生一定的影響。

圖1 首次放養(yǎng)麥鯪肌肉中MG和LMG殘留量的變化(n=4)Fig.1 The changes of residues of malachite green and leucomalachite green in Cirrhina mrigola muscles in the first year (n=4)

表5 MG浸染池塘次年放養(yǎng)鯪組織中MG和LMG的殘留量Tab.5 Residues of MG and LMG in Cirrhina mrigola samples from pond pretreated with MG in the following year

取樣時間/dSampling timeMG殘留量/(μg·kg-1)Residues of MGLMG殘留量/(μg·kg-1)Residues of LMG取樣時間/dSampling timeMG殘留量/(μg·kg-1)Residues of MGLMG殘留量/(μg·kg-1)Residues of LMG01.58±0.753.10±2.31401.80±2.5822.92±8.5611.68±4.8115.62±5.24501.43±2.4517.85±0.2522.28±2.6542.65±6.57702.02±1.0127.00±4.5654.88±1.23105.30±8.2590ND18.40±9.35104.98±2.01101.80±9.12120ND7.05±1.03154.35±1.2376.50±10.78150ND1.48±0.29203.15±3.0250.45±1.23180NDND302.40±2.3120.85±3.24210NDND

注：ND代表未檢出。

圖2 次年放養(yǎng)麥鯪肌肉中MG和LMG殘留量的變化(n=4)Fig.2The changes of residues of malachite green and leucomalachite green in Cirrhina mrigola muscles in the following year (n=4)

3 討論

3.1 受試對象的選擇

麥鯪屬底層魚類，適應(yīng)性強(qiáng)，食性雜，產(chǎn)量高，無論在池塘還是在山塘、江河都能正常生長。麥鯪作為名貴淡水魚鱖的餌料魚，在鱖養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中廣泛應(yīng)用。由于過去MG的危害不為人熟知，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用于預(yù)防或治療水霉、寄生蟲等疾病，造成了MG在環(huán)境中的殘留。通過測定MG陽性環(huán)境中養(yǎng)殖麥鯪體內(nèi)有無MG或LMG殘留，不但可說明使用過MG的養(yǎng)殖池塘對養(yǎng)殖麥鯪是否有影響，而且還可為探明經(jīng)MG陽性環(huán)境池塘養(yǎng)殖的麥鯪是否會造成以其為餌的名優(yōu)魚類體內(nèi)MG及其代謝產(chǎn)物L(fēng)MG的殘留提供參考依據(jù)。故本研究以麥鯪為受試對象，探討在模擬人工養(yǎng)殖條件下，麥鯪在MG陽性環(huán)境中是否存在富集效應(yīng)，為市場監(jiān)督抽查中麥鯪陽性樣品的MG可能來源提供參考，為加強(qiáng)對MG的監(jiān)督和管理工作提供理論依據(jù)，為水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估提供技術(shù)支撐。

3.2 首次放養(yǎng)麥鯪肌肉中MG及LMG變化趨勢

0～1 d，麥鯪肌肉 MG殘留量逐漸上升，2 d時MG和LMG殘留量結(jié)果變化較大，3 d后逐漸達(dá)到動態(tài)平衡，這可能因?yàn)辂滝N體內(nèi)對MG的富集和消除達(dá)到動態(tài)平衡。張彤晴等[23]研究結(jié)果表明，不同濃度MG水溶液經(jīng)30 d后，底泥中MG的殘留量隨時間推移逐漸上升，且底泥中MG以及LMG殘留量與水體初始MG濃度成正相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)在自然條件下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程中環(huán)境變化(降水或干旱)造成池中水面的自然上升或下降，不會影響底泥中的MG和LMG含量變化，水體中基本無MG和LMG檢出。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹辉谟隍?yàn)證使用過MG的養(yǎng)殖池塘對養(yǎng)殖麥鯪是否有影響，進(jìn)而為高端魚類鱖的健康養(yǎng)殖提供參考。因時間及樣品量的限制，并未對與肌肉樣品采集相應(yīng)時間點(diǎn)的水體及底泥進(jìn)行采集，因此未能對兩年的殘留數(shù)據(jù)進(jìn)行全面的比較分析。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可考慮增加環(huán)境樣品的采集，充實(shí)數(shù)據(jù)以完善相關(guān)研究。

3.3 次年放養(yǎng)麥鯪肌肉中MG及LMG變化趨勢

次年同一池塘再次放養(yǎng)麥鯪后,從0～30 d，麥鯪肌肉 MG殘留量為(1.58±0.75)～(4.98±2.01) μg/kg，直到90 d后未檢出， LMG從0～30 d殘留量為(3.10±2.31)～(105.30±8.25)μg/kg，隨后波動式下降直至180 d時低于定量限(0.50 μg/kg)。而首年0～30 d ，麥鯪肌肉MG殘留量范圍為(74.75±0.75)～(835.20±1.28)μg/kg， LMG為(122.40±3.24)～(6 244.00±8.24)μg/kg。兩次放養(yǎng)麥鯪體內(nèi)LMG殘留量都是先上升隨后下降到某個值后達(dá)到平衡，而MG殘留量水平相較于LMG一直處于較低水平。次年池塘養(yǎng)殖麥鯪體內(nèi)的MG和LMG殘留量水平遠(yuǎn)低于首年放養(yǎng)麥鯪體內(nèi)殘留， 這可能是池塘中MG殘留量通過魚體消除、換水、光照和生物降解等方式減少。次年池塘通過換水再次放養(yǎng)麥鯪后仍能檢出MG和LMG，這說明池塘水體中MG和LMG可能被底泥吸附。張彤晴等[23]的研究指出，在有底泥的池塘中，水體中絕大部分MG和LMG被底泥吸附，其研究結(jié)果與本研究一致。本研究表明，使用過MG的養(yǎng)殖池塘對麥鯪的養(yǎng)殖確有影響，如果以之作為其他肉食魚類如鱖、筍殼魚(Oxyeleotrismarmoratus)等的餌料魚，可能會造成肉食魚類體內(nèi)MG或LMG殘留風(fēng)險。如果養(yǎng)殖戶在大塘中違法使用MG，由此造成對池塘底質(zhì)的影響將是長遠(yuǎn)的。清塘、翻耕、曝曬不僅能殺滅底泥中的有害病菌，陽光還有降解水體及底泥中MG的作用[23]，因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖中清塘過程非常重要。應(yīng)采用翻耕、暴曬及微生物制劑綜合降解MG來提高養(yǎng)殖產(chǎn)品質(zhì)量和安全，增強(qiáng)中國水產(chǎn)品在國際市場上的競爭力。

4 結(jié)論

本研究模擬自然養(yǎng)殖條件，全池潑灑1 mg/L MG，放置7 d后，換水并放養(yǎng)麥鯪。建立高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定麥鯪肌肉組織中MG 和LMG殘留量。方法的檢出限和定量限均為0.5 μg/kg。

對連續(xù)兩年度的放養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中麥鯪肌肉中的MG和LMG代謝規(guī)律研究表明，首次放養(yǎng)，0～30 d肌肉中MG殘留量先隨時間波動式上升后逐漸下降，至160.00 μg/kg左右達(dá)動態(tài)平衡；同時肌肉中LMG殘留量以同樣的趨勢至3 370.00 μg/kg左右，并達(dá)動態(tài)平衡。次年相同池塘再次放養(yǎng)與首年體長、質(zhì)量相近的麥鯪后，0 ～ 70 d期間，其體內(nèi)MG一直維持在(1.43±2.45)～(4.98±2.01)μg/kg，直到90 d后未檢出； LMG在0～5 d殘留量從(3.10±2.31)μg/kg上升到(105.30±8.25)μg/kg，隨后波動式下降，直至180 d低于定量限(0.50 μg/kg)。

綜上說明，養(yǎng)殖池塘中若使用過MG，有可能會造成養(yǎng)殖魚類特別是底棲魚類(麥鯪)體內(nèi)MG及LMG殘留，次年180 d才低于檢測限。若將這些底棲魚類(麥鯪)進(jìn)一步作為其他肉食魚類如鱖、筍殼魚等的餌料魚，可能會造成肉食魚類體內(nèi)MG或LMG殘留風(fēng)險。對于底泥中有殘留MG的池塘應(yīng)當(dāng)禁養(yǎng)麥鯪。