黃顙魚腹水征病原菌的分離與鑒定

周勇，江南，曾佳，范玉頂，劉文枝，司凱歌，曾令兵*

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223； 2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院，上海 201316)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)隸屬于鯰形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黃顙魚屬(Pelteobagrus)，廣泛分布于中國(guó)的江河湖泊中，是中國(guó)重要的特種淡水養(yǎng)殖品種[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年中國(guó)黃顙魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量為48萬(wàn) t，比上年增長(zhǎng)15%[2]。然而，隨著黃顙魚養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，養(yǎng)殖集約化程度的提高以及養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加，黃顙魚的病害發(fā)生日漸嚴(yán)重，特別是由細(xì)菌引起的病害問(wèn)題尤為突出，已威脅到黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3]。黃顙魚細(xì)菌性疫病包括潰瘍病[3]、紅頭病[4]、腹水征[5]、敗血癥[6]等。近年來(lái)，黃顙魚腹水征的發(fā)病頻率日趨增高，其主要癥狀表現(xiàn)為腹腔內(nèi)含有大量淡紅色積水，鰭條充血、肛門紅腫、魚體表面潰爛等[5,7-8]。

2017年7月，湖北省荊州市黃顙魚主養(yǎng)區(qū)域的池塘暴發(fā)黃顙魚腹水征，引起養(yǎng)殖黃顙魚大規(guī)模死亡。其發(fā)病的主要癥狀為腹部膨大、腹腔中充滿大量半透明積水，但并無(wú)鰭條充血、肛門紅腫、魚體表面潰爛等特征，與以往報(bào)道的腹水征癥狀有所不同。本研究從該區(qū)域患病黃顙魚肝臟中分離到一株細(xì)菌。通過(guò)菌體形態(tài)觀察、回歸感染試驗(yàn)、細(xì)菌生化鑒定和16S rDNA序列分析等方法對(duì)該菌進(jìn)行了鑒定，同時(shí)，開展了患病魚組織病理觀察以及該菌敏感藥物的篩選等研究，旨在查明該例黃顙魚腹水征的病原，為該病的診斷與防控技術(shù)的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.2 主要試劑與儀器

Taq DNA聚合酶、10×PCR 緩沖液、dNTPs、DNA marker 購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；藥敏試劑盒購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；BUG液體培養(yǎng)基和BHI液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司；Biolog細(xì)菌鑒定試劑盒和IF-A接種液購(gòu)自美國(guó)Biolog公司；全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)(Biolog GENIII OmniLog型)購(gòu)自美國(guó)Biolog公司；PCR擴(kuò)增儀(T-professional型)購(gòu)自德國(guó)Biometra公司；凝膠成像系統(tǒng)(Chemidoc XRS型)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原分離與形態(tài)觀察

用70%酒精將患腹水征黃顙魚的體表消毒后，置于生物安全柜中進(jìn)行解剖，取出肝臟，涂布于BHI瓊脂平板上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取平板中優(yōu)勢(shì)菌落，重新劃線培養(yǎng)于BHI瓊脂平板上，于相同的條件下培養(yǎng)，得到純化的單菌落。挑取單菌落接種到5 mL BHI液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。待菌液OD600=0.5時(shí)，取出部分菌液用于革蘭氏染色和負(fù)染觀察[9-10]，菌液加入甘油后分裝到1.5 mL EP管中，置于-86 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩７蛛x的菌株命名為XJH01。

1.2.2 回歸感染試驗(yàn)

將超低溫保存的XJH01菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。待菌液OD600=0.5時(shí)，4 000 r/min離心菌液2 min。棄上清，沉淀用無(wú)菌PBS洗滌，重復(fù)離心洗滌3次。經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定出細(xì)菌濃度后，用無(wú)菌PBS將細(xì)菌10倍稀釋至106、107、108和109CFU/mL。將暫養(yǎng)的健康黃顙魚隨機(jī)分成5組(感染試驗(yàn)4組和對(duì)照試驗(yàn)1組)，每組30尾，感染試驗(yàn)組腹腔注射0.3 mL不同濃度的細(xì)菌稀釋液，對(duì)照組注射0.3 mL無(wú)菌PBS，養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)條件保持一致。感染后，連續(xù)14 d觀察記錄發(fā)病和死亡情況?；貧w感染試驗(yàn)重復(fù)3次后，采用Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)[11]，并將感染試驗(yàn)組中出現(xiàn)典型腹部膨大的黃顙魚進(jìn)行細(xì)菌再分離和鑒定。

1.2.3 細(xì)菌生化鑒定

將XJH01菌株和回歸感染試驗(yàn)中分離到的菌株分別進(jìn)行BHI固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。根據(jù)Biolog細(xì)菌鑒定試劑盒操作要求，將平板上生長(zhǎng)出的單菌落劃線培養(yǎng)于BUG固體培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng)24～36 h。用無(wú)菌棉簽挑取BUG固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，重懸于IF-A接種液中。將Biolog細(xì)菌鑒定板以每孔100 μL的劑量接種含有XJH01的接種液后，置于Biolog 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行鑒定，記錄鑒定結(jié)果。

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1.2.4 細(xì)菌16S rDNA 序列分析

通過(guò)引物16S rDNA 27F：5′-AGAGTTTGATCAT GGCTCAG-3′和16S rDNA 1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′對(duì)XJH01菌株的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物置于1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)?；厥贞?yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。利用NCBI中Blast檢索系統(tǒng)，對(duì)XJH01菌株的16S rDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析。選擇常見水產(chǎn)病害致病菌的16S rDNA序列，采用鄰接法(neighbor-joining method)，構(gòu)建XJH01菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 組織病理學(xué)觀察

取正常黃顙魚和患病黃顙魚的鰓、脾臟、腎臟和腸組織，經(jīng)固定、包埋、切片及蘇木精-伊紅染色(HE染色)等過(guò)程后，觀察患病黃顙魚組織病理變化情況[12]。

1.2.6 藥物敏感試驗(yàn)

在無(wú)菌環(huán)境下，取200 μL XJH01菌株的培養(yǎng)液，涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，并將藥敏試紙均勻的分布到該固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

患病黃顙魚臨床癥狀表現(xiàn)為浮于水面、游動(dòng)緩慢、腹部膨大(圖1A)。解剖后發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)有大量積水、脾臟和腎臟失血等(圖1B)。將從自然發(fā)病黃顙魚肝臟中分離得到的XJH01菌株，經(jīng)人工培養(yǎng)后，感染健康的黃顙魚。感染后，患病黃顙魚的癥狀與自然發(fā)病魚體的癥狀一致(圖1C和圖1D)，表明該菌是被檢黃顙魚病例的病原菌。

2.2 病原分離與形態(tài)觀察

XJH01菌株生長(zhǎng)在BHI瓊脂平板上，菌落整齊、呈圓形、中央隆起、邊緣光滑、灰白色、半透明，經(jīng)革蘭氏染色后呈紅色，表明該菌為革蘭氏陰性菌，菌體呈單個(gè)或成對(duì)排列(圖2A)。菌體經(jīng)2%磷鎢酸負(fù)染后，在透射電鏡下觀察呈短桿狀(圖2B)。

圖1 黃顙魚腹水征的臨床癥狀A(yù)-B：自然發(fā)病黃顙魚；C-D：人工感染患病黃顙魚。Fig.1Clinical signs of ascites disease of Pelteobagrus fulvidracoA-B: ascites disease of Pelteobagrus fulvidraco with natural infection; C-D: ascites disease of Pelteobagrus fulvidraco with artificial inoculation.

圖2 XJH01菌株的革蘭氏染色和負(fù)染A：革蘭氏染色(100×)；B：負(fù)染(5 000×)。Fig.2Gram staining and negative staining of bacterium XJH01A: Gram staining (100×); B: Negative staining (5 000×).

2.3 回歸感染試驗(yàn)

用不同濃度的XJH01菌液注射感染健康黃顙魚后，各感染試驗(yàn)組的黃顙魚在14 d天內(nèi)出現(xiàn)了不同程度的患病癥狀或死亡，對(duì)照組黃顙魚未出現(xiàn)魚體死亡(表1)。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算出XJH01菌的半數(shù)致死量為(2.27±0.33)×106CFU/mL。取感染試驗(yàn)組瀕臨死亡的黃顙魚解剖后發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)有大量積水(圖1C和圖1D)。從感染組瀕死的黃顙魚肝臟中分離得到一株細(xì)菌后進(jìn)行再鑒定，確認(rèn)分離菌的致病性。

2.4 組織病理變化

采集自然發(fā)病黃顙魚和健康黃顙魚的鰓、脾臟、腎臟和腸道等器官進(jìn)行組織切片，通過(guò)觀察比較，發(fā)現(xiàn)患病魚的各組織結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著的變化。健康黃顙魚的鰓絲及鰓小片結(jié)構(gòu)完整、排列整齊(圖3A)；患病魚的鰓絲上皮細(xì)胞壞死、脫落，部分鰓小片增大，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分鰓小片有融合現(xiàn)象(圖3E)。健康黃顙魚的脾臟細(xì)胞排列緊密，紅髓和白髓清晰(圖3B)；患病魚脾臟細(xì)胞壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，紅髓和白髓界限不明顯(圖3F)。健康黃顙魚的腎臟細(xì)胞排列緊密結(jié)構(gòu)清晰(圖3C)；患病魚腎臟出現(xiàn)廣泛壞死，腎小球腫脹、壞死，腎小管細(xì)胞空泡化壞死(圖3G)。健康黃顙魚的腸道柱狀上皮細(xì)胞排列緊密，肌層平整，腸絨毛完整，排列有序(圖3D)；患病魚腸道黏膜上皮細(xì)胞腫脹壞死，下層有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3H)。

表1 不同濃度XJH01菌感染黃顙魚死亡結(jié)果Tab.1 Mortality of Pelteobagrus fulvidraco infected with strain XJH01 at different concentrations

圖3 黃顙魚正常組織和腹水征病理組織觀察(標(biāo)尺： 50 μm)A：正常鰓組織；B：正常脾臟組織；C：正常腎臟組織；D：正常腸組織；E：患病魚鰓組織；F：患病魚脾臟組織；G：患病魚腎臟組織；H：患病魚腸組織；綠色箭頭：炎性細(xì)胞；黑色箭頭：壞死細(xì)胞。Fig.3Histopathological observation of tissues in Pelteobagrus fulvidraco from normal group and the ascites diseased group(bar scale: 50 μm)A: normal gill tissue; B: normal spleen tissue; C: normal kidney tissue; D: normal intestinal tissue; E: the gill tissue from diseased Pelteobagrusfulvidraco; F: the spleen tissue from diseased Pelteobagrus fulvidraco; G: the kidney tissue from diseased Pelteobagrus fulvidraco;H: the intestinal tissue from diseased Pelteobagrus fulvidraco. The green arrow: inflammatory cells;the black arrow: necrotic cells.

2.5 細(xì)菌生化鑒定

通過(guò)Biolog全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)XJH01菌株和回歸感染試驗(yàn)中分離到的菌株分別進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，兩株分離菌均為維氏氣單胞菌，置信度高達(dá)85%。具體的反應(yīng)項(xiàng)目及結(jié)果見表2。

2.6 細(xì)菌16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

通過(guò)引物16S rDNA 27F/16S rDNA 1492R對(duì)XJH01菌株的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 400 bp的序列。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果置于NCBI Blast系統(tǒng)中比對(duì)，結(jié)果顯示，XJH01菌株16S rDNA基因序列與維氏氣單胞菌的16S rDNA序列相似性達(dá)99%。利用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建XJH01菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果顯示，XJH01菌株與維氏氣單胞菌(基因號(hào)：KC210794.1、MG063198.1、MF716720.1)聚合為1支(圖4)。

表2 XJH01菌株的Biolog鑒定結(jié)果Tab.2 Results of Biolog identification of strain XJH01

續(xù)表2,Tab.2 Continued

注：P表示陽(yáng)性；N表示陰性；B表示臨界值；L表示低于對(duì)照組A1。

圖4 基于16S rDNA構(gòu)建的XJH01菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(數(shù)字代表自展值)Fig.4Phylogenetic tree of strain XJH01 based on 16S rRNA (The number represents bootstrap value)

2.7 藥物敏感試驗(yàn)

按照藥敏試劑盒使用說(shuō)明，根據(jù)抑菌圈直徑大小，確定XJH01菌株對(duì)藥物的敏感性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株對(duì)哌啦西林、克拉霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、米諾環(huán)素、左氟沙星、多粘霉素B和復(fù)方新諾明等8種抗生素高度敏感；對(duì)麥迪霉素、氨芐西林、大觀霉素、萬(wàn)古霉素、克林霉素、新霉素、妥布霉素和卡那霉素等8種抗生素中度敏感；對(duì)苯唑西林、阿米卡星和鏈霉素等3種抗生素不敏感(表3)。

表3 藥物敏感性試驗(yàn)Tab.3 Antibiotic susceptibility test

注: d代表抑菌圈直徑，S表示敏感(d>15 mm)；I表示中度敏感(6 mm

3 討論

隨著中國(guó)黃顙魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，關(guān)于黃顙魚疾病研究的報(bào)道不斷增多，主要為細(xì)菌性疾病。目前，已報(bào)道的黃顙魚細(xì)菌性病原菌主要有遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[13]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[5]、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)[14]、耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)[15]和維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[16]等。本研究從患腹水征黃顙魚體內(nèi)分離到一株病原菌XJH01，經(jīng)菌體形態(tài)觀察、回歸感染試驗(yàn)、生化鑒定和16S rDNA序列分析等方法，確認(rèn)了該病原菌為維氏氣單胞菌。維氏氣單胞菌是一種人-獸-魚共同致病病原菌[17-18]，該菌在水生動(dòng)物中流行廣泛，已從患病的羅非魚(Oreochromisniloticus)[19]、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)[20]、西伯利亞鱘(Acipenserbaeri)[21]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[22]、巖原鯉(Procyprisrabaudi)[23]、異育銀鯽(Carassiusauratus)[24]、框鏡鯉(Cyprinuscarpio)[25]、中華鱘(Acipensersinensis)[26]和鱖(Sinipercachuatsi)[27]等水生動(dòng)物體中分離得到該病原菌。已有報(bào)道表明，維氏氣單胞菌[16]的感染能引起黃顙魚出現(xiàn)腹部膨大、腹腔內(nèi)含有大量淡紅色積水、鰭條充血、肛門紅腫、魚體表面潰爛等癥狀[5, 7-8]。而本研究中發(fā)病黃顙魚的主要癥狀為腹部膨大、腹腔中充滿大量半透明積水，無(wú)鰭條充血、體表潰爛等癥狀，與前述研究描述的臨床癥狀有明顯差異。可能是由于維氏氣單胞菌和養(yǎng)殖環(huán)境的共同作用，導(dǎo)致了患病特征的變化。

張濤等[8]發(fā)現(xiàn)黃顙魚腹水病主要是由腎組織病變所致，與本研究中患病魚腎臟出現(xiàn)廣泛壞死，腎小球腫脹、壞死，腎小管細(xì)胞空泡化壞死的結(jié)果相一致。此外，本研究中患病黃顙魚的鰓、脾臟和腸道等組織器官均發(fā)生不同程度病變，對(duì)各部位的組織功能均造成一定影響。由此推測(cè)，XJH01菌株感染黃顙魚后，魚鰓組織損壞導(dǎo)致魚體缺氧、浮游于水面，而脾臟、腎臟和腸道等組織的壞死可能是導(dǎo)致魚體最終死亡的主要原因。

有效抗菌藥物的篩選是防治黃顙魚腹水征的關(guān)鍵。本研究使用的19種抗生素中，XJH01菌株高度敏感的抗生素有8種，中度敏感的抗生素有8種，不敏感的抗生素有3種。與已報(bào)道的黃顙魚源維氏氣單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比，XJH01菌株對(duì)鏈霉素、新霉素、妥布霉素等抗生素的敏感性由敏感變?yōu)橹卸让舾谢虿幻舾校@種對(duì)抗生素敏感性的變化可能是因不同地域來(lái)源或不同血清型菌株間的差異造成的，也可能與不規(guī)范使用抗生素導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性相關(guān)[3,28-30]。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中防治由該菌引起的黃顙魚腹水征時(shí)，需結(jié)合藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，選擇正確的抗生素和使用濃度。

4 結(jié)論

本研究從患腹水征的黃顙魚體內(nèi)分離鑒定了一株致病的維氏氣單胞菌，該菌株對(duì)黃顙魚的半數(shù)致死劑量為(2.27±0.33)×106CFU/mL。回歸感染試驗(yàn)表明，分離到的維氏氣單胞菌具有致病性?；疾↑S顙魚的鰓結(jié)構(gòu)崩解，脾、腎組織及腸上皮細(xì)胞壞死。該株維氏氣單胞菌對(duì)哌啦西林、克拉霉素、恩諾沙星和氟苯尼考等8種抗生素敏感。本研究結(jié)果不僅對(duì)黃顙魚腹水征病原的診斷有重要意義，也為該病的防治提供了一定的參考依據(jù)。