止吐六味散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)*

陳香梅，鮑布日額，蘇日娜，新紅

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，通遼 028000)

止吐六味散是蒙醫(yī)臨床常用藥之一，由甘草、小茴香、蔓荊子、粳米(微炒)、芫荽子和柿子或酸梨干等量配制，共研末制成散劑。本方出自《診治明醫(yī)典》，具有止吐功效，用于嘔吐、妊娠嘔吐等[1-2]。筆者檢索發(fā)現(xiàn)，該藥的相關(guān)研究甚少。除制劑方法、性能、主治外，其他研究近乎空白。該方的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究至今筆者尚未見報(bào)道[3-8]。因此，筆者在本實(shí)驗(yàn)對(duì)止吐六味散進(jìn)行質(zhì)量研究，以期為制定該方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Nikon E200電子顯微鏡和DS-U3拍照裝置(北京恒三江儀器銷售有限公司)，T-1700M馬弗爐(鄭州天縱電氣設(shè)備有限公司)，DHG-9023A型電熱恒溫箱(寧波江南儀器廠)，ULMATE3000高效液相色譜儀(Thermo Fisher科技公司)，AUY-120電子天平(max 210 g，感量：0.01 mg，日本島津公司)，KQ-100E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 止吐六味散(錫盟蒙醫(yī)研究所提供，批準(zhǔn)文號(hào)：內(nèi)藥制字M13040163，批號(hào)：20160616，20160809，20150417，20160325，20150313，20160719，20160703，20161004)，陰性對(duì)照藥(內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院制劑實(shí)驗(yàn)室制)，乙腈(色譜級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20141106，含量≥99.9%)；甲醇(色譜級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170606，含量≥99.9%)；芳樟醇對(duì)照品(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20161031，含量≥98%)，甘草苷對(duì)照品(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20161031，含量≥98%)，甘草酸單銨鹽對(duì)照品(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20160824，含量>98%)，茴香醛對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y14M7C11129，含量≥98%)，酸梨干對(duì)照藥材(內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局提供，批號(hào)：20160717，山梨醇含量：23.874 mg·g-1)。

2 方法與結(jié)果

2.1粉末的鑒定 取止吐六味散適量(批號(hào)：20160616)，水合氯醛、稀甘油制片進(jìn)行顯微觀察，生物光學(xué)顯微鏡下觀察顯微特征，鑒別結(jié)果見圖1。

2.1.1晶鞘纖維 晶鞘纖維是甘草區(qū)別于其他五味藥的粉末特征，多形成束，直徑8～20 μm。

2.1.2復(fù)粒淀粉 淀粉粒是止吐六味散中最多見的顯微特征，而復(fù)粒淀粉則是粳米區(qū)別于其他五味藥的粉末特征。多由2～8個(gè)分粒組成，2個(gè)或多個(gè)臍點(diǎn)，呈多面體形，層紋及臍點(diǎn)不明顯。

2.1.3非腺毛 非腺毛為蔓荊子在止吐六味散中區(qū)別于其他組分的粉末顯微特征，頂端細(xì)，基部較粗，長(zhǎng)14～68 μm，多彎曲，有疣狀突起。

2.1.4石細(xì)胞 酸梨干中石細(xì)胞較多，有單一散著或多數(shù)堆在一起，次生壁很厚，直徑約40 μm，細(xì)胞壁上有紋孔道。

2.1.5網(wǎng)紋細(xì)胞 小茴香中有網(wǎng)紋細(xì)胞呈卵圓形網(wǎng)狀壁孔，直徑4～10 μm，長(zhǎng)7～20 μm。

2.2成分測(cè)定

2.2.1水分測(cè)定 依照《中華人民共和國藥典》(2015年版)附錄ⅨH水分測(cè)定法(烘干法)測(cè)定止吐六味散中水分含量[9]。其測(cè)定結(jié)果見表1，其中M1為恒重后稱量瓶質(zhì)量；M2為試樣加稱量瓶質(zhì)量；M3為烘干后試樣加稱量瓶質(zhì)量。平均水分含量7.37%，RSD=5.96%。

2.2.2灰分測(cè)定 依照《中華人民共和國藥典》(2015年版)附錄ⅨK總灰分測(cè)定法和酸不容性灰分測(cè)定法對(duì)止吐六味散的灰分含量及酸不溶性灰分含量進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見表2，其中M1為恒重后的坩堝質(zhì)量；M2為試樣加坩堝的質(zhì)量；M3為烘干后的試樣加坩堝的質(zhì)量；M4為殘?jiān)佰釄遒|(zhì)量。平均灰分含量4.27%，RSD=0.043%；平均酸不溶性灰分含量1.4%，RSD=3.78%。

2.2.3浸出物含量測(cè)定 依照《中華人民共和國藥典》(2015年版)附錄ⅩA浸出物測(cè)定法中水溶性浸出物測(cè)定法測(cè)定止吐六味散水溶性浸出物含量。結(jié)果見表3，其中M1為恒重后浸出物加表面皿恒重質(zhì)量；M2為浸出物加表面皿蒸干后恒重質(zhì)量。平均浸出物含量21.84%，RSD=1.75%。

2.3薄層鑒別

2.3.1止吐六味散中芫荽子的TLC鑒別 取止吐六味散4.0 g，加入乙醚12 mL冷浸4 h，濾過，濾液揮干，殘?jiān)尤燃淄? mL溶解，作為供試品溶液，同法制備芫荽子單味藥及陰性對(duì)照；吸取供試品各2 μL，芳樟醇對(duì)照品2 μL，分別點(diǎn)于本實(shí)驗(yàn)室自制硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯(8：2)為展開系統(tǒng)，5%磷鉬酸無水乙醇溶液顯色，105 ℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰[10]。結(jié)果見圖2。

2.3.2止吐六味散中小茴香的TLC鑒別 按照《中華人民共和國藥典》(2015年版一部)“小茴香”條薄層鑒別方法，取止吐六味散3.0 g，加入乙醚30 mL，超聲處理10 min，濾過，取濾液揮干，殘?jiān)尤燃淄? mL溶解，作為供試品溶液，同法制備小茴香單味藥及陰性對(duì)照；茴香醛對(duì)照品制備成每毫升含1 μL溶液。吸取供試品各10 μL，茴香醛對(duì)照品溶液1 μL分別點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)室自制硅膠G板上，以石油醚-乙酸乙酯(8：2)為展開系統(tǒng)，用二硝基苯肼顯色[9]。結(jié)果見圖2。

A.晶鞘纖維；B.復(fù)粒淀粉；C.非腺毛；D.石細(xì)胞；E.網(wǎng)紋細(xì)胞

Tab.1MoisturedeterminationofZhituliuweisan

g

表2止吐六味散灰分測(cè)定

Tab.2AshdeterminationofZhituliuweisan

g

2.3.3止吐六味散中甘草的TLC鑒別 取止吐六味散2.0 g，加入乙醚50 mL，加熱回流1 h，濾過，殘?jiān)尤爰状?0 mL繼續(xù)加熱回流1 h，濾過，濾液揮干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用正丁醇提取3次，合并正丁醇液，用水洗滌 3次，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取甘草酸單銨鹽對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。同法制備甘草單味藥及陰性對(duì)照；吸取供試品各2 μL，分別點(diǎn)于GF254板上，以乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水(8：1：1：1)為展開系統(tǒng)，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[11-13]。結(jié)果見圖2。

表3止吐六味散浸出物測(cè)定

Tab.3DeterminationofwaterextractiveinZhituliuweisan

g

2.3.4止吐六味散中酸梨干的TLC鑒別 取止吐六味散3.0 g，加入石油醚30 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)尤燃淄? mL溶解，作為供試品溶液，同法制備酸梨干對(duì)照藥材，單味藥及陰性對(duì)照；吸取供試品各5 μL，分別點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)室自制硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯(8：2)為展開系統(tǒng)，5%磷鉬酸無水乙醇溶液顯色，105 ℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰[14]。結(jié)果見圖2。

2.4止吐六味散中甘草苷和甘草酸含量測(cè)定

2.4.1色譜條件 色譜柱Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：38 ℃，流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸，流速：1 mL·min-1，波長(zhǎng)：263 nm[15-16]。

1.對(duì)照品或?qū)φ账幉模?.止吐六味散；3.單味藥；4.相應(yīng)陰性對(duì)照

Fig.2TLCofFuructusCoriandri(A),FuructusFoeniculi(B),RadixGlycyrrhizae(C),PyrusussuriensisMaxin.(D)inZhituliuweisan

2.4.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘草苷對(duì)照品適量，加70%乙醇制成每毫升含甘草苷30 μg的溶液。以此為母液，分別配制成6.0，12.0，18.0，24.0，30.0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。精密稱取甘草酸銨對(duì)照品適量，加70%乙醇制成每毫升含甘草酸39 μg溶液，以此為母液分別配制成7.8，156，23.4，31.2，39.0 μg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.4.3供試品溶液的制備 稱取止吐六味散約1.2 g，加70%乙醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(250 W，40 Hz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4.4線性關(guān)系考察 精密吸取上述各濃度甘草苷對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，各3次，得相對(duì)峰面積。以甘草苷對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=22.622X-0.0691，r=0.9999。甘草苷在0.06～3.00 μg之間呈良好的線性關(guān)系。

精密吸取上述各濃度甘草酸對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，各3次，得相對(duì)峰面積。以甘草酸對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=14.06X-0.0026，r=0.9999。甘草酸在0.0784～0.3920 μg呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取止吐六味散(批號(hào)：20160616)，按“2.4.3”項(xiàng)方法制備，精密吸取10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次。甘草苷、甘草酸相對(duì)峰面積的RSD為0.57%，0.71%。結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.4.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取止吐六味散(批號(hào)：20160616)，按“2.4.3”項(xiàng)方法制備，精密吸取10 μL，分別在0，2，4，6，8，10，12 h注入液相色譜儀。甘草苷、甘草酸相對(duì)峰面積RSD為0.46%，0.02%。結(jié)果表明止吐六味散供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)止吐六味散(批號(hào)：20160616)6份，按“2.4.3”項(xiàng)方法制備，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，每一份各3次進(jìn)樣。甘草苷、甘草酸相對(duì)相對(duì)峰面積RSD為0.53%，0.03%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.8回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批止吐六味散(批號(hào)：20160616)各9份，每份約1.2 g，分別以1：0.8，1：1，1：1.2含量加入甘草苷對(duì)照品和甘草酸對(duì)照品，按“2.4.3”項(xiàng)方法制備，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，得甘草苷、甘草酸相對(duì)峰面積，RSD分別為0.33%～1.82%，0.78%～1.33%。平均回收率分別為99.06%～101.90%，99.66%～100.83%。結(jié)果見表4。

表4止吐六味散加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.4ResultsofrecoverytestonZhituliuweisan

成分稱樣量/g原有量加入量測(cè)得量mg回收率平均回收率RSD%甘草苷1.202 41.136 20.908 92.034 698.841.214 11.147 30.913 82.051 198.9199.060.231.201 21.135 10.910 82.040 799.431.201 31.135 21.113 62.239 899.191.201 91.135 71.145 22.250 297.3298.150.971.202 41.136 21.127 62.240 597.931.210 31.143 71.380 12.524 0100.011.201 71.135 61.378 22.540 9101.96101.901.821.200 51.134 51.218 72.398 5103.71甘草酸1.203 12.929 52.340 05.268 799.971.202 52.928 12.297 65.280 2102.37100.831.331.200 32.922 72.343 65.269 5100.141.201 72.926 12.930 75.856 699.991.200 52.923 22.987 65.901 899.70100.290.781.200 12.922 22.919 85.876 5101.181.211 72.950 43.530 56.490 2100.261.203 12.929 53.515 56.397 798.6599.660.891.200 22.922 53.555 16.480 6100.08

2.4.9樣品測(cè)定 精密稱取止吐六味散8批，按“2.4.3”項(xiàng)方法制備，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)得甘草苷、甘草酸相對(duì)峰面積，計(jì)算甘草苷、甘草酸含量。結(jié)果見表5。

表58批止吐六味散中甘草苷與甘草酸含量測(cè)定結(jié)果

Tab.5ContentdeterminationonLiquiritinandGlycyrrhizicacidineightbatchesofZhituliuweisanmg·g-1

編號(hào)批號(hào)提供方甘草苷甘草酸Z120160616內(nèi)蒙古錫盟蒙醫(yī)研究所0.9452.435Z220160809內(nèi)蒙古錫盟蒙醫(yī)研究所0.8052.439Z320150417內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院0.9112.417Z420160325內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院1.3652.165Z520150313內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院0.9941.874Z620160719內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院0.6062.155Z720160703內(nèi)蒙古錫盟正藍(lán)旗蒙醫(yī)醫(yī)院0.5762.582Z820161004內(nèi)蒙古錫盟正藍(lán)旗蒙醫(yī)醫(yī)院0.5522.289

3 討論

止吐六味散配伍組分中除芫荽子外，均有區(qū)別于其他五味單藥的粉末顯微特征。顯微鑒別中專屬性特征是其關(guān)鍵因素，有些單味藥的特征缺乏專屬性，這對(duì)于有相同顯微特征的成藥的檢查帶來不便，如止吐六味散中芫荽子的顯微特征糊粉粒和簇晶在小茴香中均存在，木化細(xì)胞也存在于甘草中，其粉末特征專屬性較缺乏，造成交叉干擾。為避免檢查出錯(cuò)，該藥定性鑒別需以薄層色譜法佐證。

從芫荽子的TLC鑒別結(jié)果可看出，止吐六味散和芫荽子與芳樟醇對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同暗綠色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，Rf值約0.51，分離明顯，陰性則無干擾；止吐六味散和小茴香與茴香醛對(duì)照品在相應(yīng)位置顯相同橙色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，Rf約0.62，分離明顯，陰性無干擾；止吐六味散和甘草單味藥與甘草酸對(duì)照品在相應(yīng)位置顯黃棕色斑點(diǎn)，Rf值約0.42，陰性無干擾；止吐六味散和酸梨干與酸梨干對(duì)照藥材在相應(yīng)位置有相同暗綠色斑點(diǎn)，分離清晰，Rf值約0.64，陰性無干擾。以上方法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可作為鑒別止吐六味散中芫荽子、小茴香、甘草和酸梨干的薄層鑒別方法。

賈善學(xué)等[17]報(bào)道，同一品種，不同廠家不同批號(hào)的中成藥總灰分含量有一定差異，但差異不大，偽品灰分含量極其高。華佗再造丸正品總灰分3.9%，偽品灰分含量78.4%。為保證藥品質(zhì)量制定灰分標(biāo)準(zhǔn)非常必要。中成藥中水分、浸出物等均有必要制定限定標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)中，由內(nèi)蒙古錫盟蒙醫(yī)研究所提供的止吐六味散，測(cè)得水分含量6.89%～7.75%；灰分含量4.06%～4.40%，酸不溶性灰分含量1.24%～1.44%，水溶性浸出物含量21.17%～22.63%。

甘草為該方君藥，因而選擇甘草酸和甘草苷作為止吐六味散的定量控制指標(biāo)，按照《中華人民共和國藥典》(2015年版一部)甘草的含量測(cè)定方法，測(cè)定8批止吐六味散樣品甘草苷、甘草酸含量。甘草苷含量0.552～1.365 mg·g-1；甘草酸含量1.874～2.582 mg·g-1，其中內(nèi)蒙古錫盟正藍(lán)旗蒙醫(yī)醫(yī)院提供的樣品中甘草苷的含量較其他少，而甘草酸含量與其他提供樣品相似。

目前國家藥品監(jiān)督管理局公布的第2批 《國家非處方藥藥品目錄》 中收載了蒙藥止吐六味散[18]，本研究為止吐六味散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考依據(jù)。