人工牛黃微生物限度檢查方法適用性實(shí)驗(yàn)*

王永智，吳宏斌，邱文娜，方朝東，饒玲，聶利芳

(1.泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心，泰州 225300；2.江蘇大同盟制藥有限公司，泰州 225300)

人工牛黃制劑處方中含有牛膽粉等多種具有抑菌活性的成分[1-2]，抑菌成分可能影響供試品中污染的微生物，從而影響微生物檢測結(jié)果準(zhǔn)確性[3]。筆者在檢查方法、菌種選擇、培養(yǎng)基使用和限度標(biāo)準(zhǔn)制定等方面參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則1105，1106和1107[4]要求，考察微生物限度檢查方法的適用性，以期客觀反映供試品中的微生物情況，確保檢測方法的可控及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性[5-6]，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1儀器 GNP-9080生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；MJPS 150生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；生物安全柜[型號：Thermo Forma/1300，賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；超凈工作臺(型號：SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.2試藥 人工牛黃(江蘇某制藥有限公司，批號：20170402，20170512，20170527)。

1.3培養(yǎng)基 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號：1702042)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (批號：1702132)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號：161205)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基 (批號：1603022)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：1601142)、麥糠凱液體培養(yǎng)基(批號：161227)、麥糠凱瓊脂培養(yǎng)基(批號：160225)、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基 (批號：1602152)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基 (批號：161130)、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基(批號：151221)均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

1.4實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) [CMCC(B)26 003]；大腸埃希菌(Escherichiacoli) [CMCC (B)44 102]；銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[ CMCC ( B )10 104]；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[ CMCC(B)63 501]；白念珠菌(Candidaalbicans) [CMCC(F)98 001]；黑曲霉(Aspergilllusniger)[CMCC(F)98 003]；乙型副傷寒沙門菌(SalmonellaparatyphiB) [CMCC(B)50 094]均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1需氧菌菌落計(jì)數(shù)方法適用性實(shí)驗(yàn)

2.1.1菌液的制備 分別接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，分別取上述培養(yǎng)物用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，依次稀釋制成每毫升含菌數(shù)<100 菌落形成單位(colony-forming unit，cfu)菌懸液；分別取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，分別取上述培養(yǎng)物用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每毫升含菌數(shù)為100～10 000 cfu菌懸液；接種白念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，20～25 ℃培養(yǎng)2～3 d，取此培養(yǎng)物用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，稀釋制成每毫升含菌100～10 000 cfu的菌懸液；將黑曲霉斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d，使大量孢子成熟。加入含0.05%聚山梨酯80的pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液3～5 mL，將孢子洗脫。然后用管口帶有薄無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管吸出孢子懸液至無菌試管，用含0.05%聚山梨酯80的pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每毫升含孢子100～10 000 cfu的孢子懸液。

2.1.2供試液的制備 稱取供試品10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 mL，充分振搖使混勻，作為1：10供試液；取1：10供試液10 mL，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 mL，充分振搖使混勻，作為1：100供試液。

2.1.3計(jì)數(shù)方法及回收率計(jì)算 取稀釋級別分別為1：10，1：100供試液9.9 mL與每毫升含菌數(shù)為100～10 000 cfu的各實(shí)驗(yàn)菌0.1 mL混勻，作為實(shí)驗(yàn)組。以稀釋級別1：10，1：100 供試液9.9 mL和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基0.1 mL混勻作為供試品對照組；以9.9 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基和每毫升含菌數(shù)為100～10 000 cfu的各實(shí)驗(yàn)菌0.1 mL混勻，同法操作，作為菌液對照組。分別吸取上述各處理組1 mL注入平皿，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，混勻，凝固，于30～35 ℃倒置培養(yǎng)3 d，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)菌回收率，實(shí)驗(yàn)組菌回收率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%。結(jié)果見表1。

由表1可知，采用稀釋級別為1：10及1：100的供試液對人工牛黃需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法進(jìn)行驗(yàn)證，部分實(shí)驗(yàn)菌株實(shí)驗(yàn)組回收率<50%，不滿足《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則1105中對于實(shí)驗(yàn)組菌落回收率的要求。采用含3%聚山梨酯80及0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋液稀釋供試品，去除供試品抑菌活性，重新進(jìn)行需氧菌計(jì)數(shù)方法適用性實(shí)驗(yàn)。

表1實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1Resultsofrecoverytestonthebacteriainexperimentalgroup

%

2.2需氧菌菌落計(jì)數(shù)方法適用性實(shí)驗(yàn)(第2次)

2.2.1供試液的制備 以含3%聚山梨酯80及0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋液配制樣品。取供試品10 g，加上述稀釋液至100 mL，充分振搖混勻，作為1：10供試液；取1：10供試品20 mL，加上述稀釋液至100 mL，充分振搖使混勻，作為1：50供試液。

2.2.2計(jì)數(shù)方法及回收率計(jì)算 按“2.1.3”項(xiàng)方法制備各實(shí)驗(yàn)菌株實(shí)驗(yàn)組、菌液對照組、供試品對照組并培養(yǎng)計(jì)數(shù)，同時(shí)以含3%聚山梨酯80及0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基代替供試液，作為中和劑對照組，按“2.1.3”項(xiàng)方法處理。分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)組菌株回收率及中和劑對照組菌落數(shù)回收率，結(jié)果見表2。

表2實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2Resultsofrecoverytestonthebacteriainexperimentalgroup

%

由表2可知，以含3%聚山梨酯80及0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑，采用1：50 稀釋級別進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性實(shí)驗(yàn)時(shí)，所有菌種實(shí)驗(yàn)組回收率均在50%～200%，采用該方法對批號為20170512，20170527樣品再獨(dú)立進(jìn)行兩次需氧菌計(jì)數(shù)方法適用性實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)該方法的可靠性。結(jié)果見表3。

表3實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3Resultsofrecoverytestonthebacteriainexperimentalgroup

%

2.3真菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性實(shí)驗(yàn) 按照“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試液；以白念珠菌、黑曲霉作為實(shí)驗(yàn)菌株，按照“2.1.3”項(xiàng)方法制備各實(shí)驗(yàn)菌株實(shí)驗(yàn)組、菌液對照組；按照“2.2.2”項(xiàng)方法制備中和劑對照組。分別吸取上述各組1 mL注入平皿，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，混勻，凝固，于20～25 ℃倒置培養(yǎng)5 d點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，結(jié)果見表4。

表4實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.4Resultsofrecoverytestonthebacteriainexperimentalgroup

%

由表4結(jié)果可知，以含聚山梨酯80及0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑，采用1：10稀釋級別進(jìn)行真菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性實(shí)驗(yàn)時(shí)，所有菌種實(shí)驗(yàn)組回收率均符合要求，采用此方法對批號為20170512，20170527的樣品再獨(dú)立進(jìn)行兩次真菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)該方法的可靠性。結(jié)果見表5。

表5實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.5Resultsofrecoverytestonthebacteriainexperimentalgroup

%

2.4控制菌檢查方法適用性實(shí)驗(yàn) 依據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則1107中非無菌微生物限度標(biāo)準(zhǔn)要求[4]，本品控制菌檢查項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)為：不得檢出大腸埃希菌(1 g)；不得檢出沙門菌(10 g)；耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于102(1 g)。

2.4.1大腸埃希菌檢查方法適用性實(shí)驗(yàn) 取1：10供試液10 mL，每毫升含菌數(shù)<100 cfu的大腸埃希菌菌懸液1 mL，加至約100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，作為實(shí)驗(yàn)組；取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基10 mL，加至約100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，作為陰性對照組；取每毫升含菌數(shù)<100 cfu大腸埃希菌菌懸液1 mL，加至約100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為陽性對照組。以上各處理組均置于30～35 ℃培養(yǎng)18 h。

分別取各組培養(yǎng)物1 mL，接種至含100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，42～44 ℃培養(yǎng)24 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上30～35 ℃培養(yǎng)18 h，結(jié)果見表6。

表6大腸埃希菌檢查方法適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.6ResultsofapplicabilitytestonthemethodofEscherichiacoli

供試品201704022017051220170527實(shí)驗(yàn)組+++陽性對照組+++陰性對照組---

+表示培養(yǎng)基有菌生長或呈陽性；-表示培養(yǎng)基無菌生長或呈陰性

+ represents the growth of bacteria in the medium or the positive result；- represents no bacteria growth in the medium of the negative result

2.4.2乙型副傷寒沙門菌檢查方法適用性實(shí)驗(yàn) 取10 g供試品和每毫升含菌數(shù)不大于100 cfu的沙門菌菌懸液1 mL，置100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，作為實(shí)驗(yàn)組；取10 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，置100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，作為陰性對照組；取每毫升含菌數(shù)不大于100 cfu沙門菌菌懸液1 mL，置100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，作為陽性對照組；各處理組置于30～35 ℃培養(yǎng)18 h。

分別取上述培養(yǎng)物各0.1 mL，分別接種至10 mLRV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。用接種針挑取疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18 h。結(jié)果見表7。

2.4.3耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢查方法適用性實(shí)驗(yàn) 稱取供試品10 g，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 mL制成1：10供試液，混勻，20～25 ℃培養(yǎng)2 h，分別取此供試液1，0.1，0.01 mL(相當(dāng)于供試品0.1，0.01，0.001 g)，接種至10 mL腸道菌增菌液體培養(yǎng)基，分別加入不大于100 cfu的大腸埃希菌懸液1 mL，作為實(shí)驗(yàn)組，同法制備銅綠假單胞菌實(shí)驗(yàn)組；將1 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種至腸道增菌液體培養(yǎng)基10 mL中，加入不大于100 cfu的大腸埃希菌懸液1 mL，作為陽性對照組，同法制備銅綠假單胞菌陽性對照組；將1 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種至腸道增菌液體培養(yǎng)基10 mL中，作為陰性對照組。以上各處理組于30～35 ℃培養(yǎng)24 h。

表7乙型副傷寒沙門菌檢查方法適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.7ResultsofapplicabilitytestonthemethodofSalmonellaparatyphiB

供試品201704022017051220170527實(shí)驗(yàn)組+++陽性對照組+++陰性對照組---

+表示培養(yǎng)基有菌生長或呈陽性；-表示培養(yǎng)基無菌生長或呈陰性

+ represents the growth of bacteria in the medium or the positive result；- represents no bacteria growth in the medium of the negative result

分別將各組培養(yǎng)物劃線接種至紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，于30～35 ℃培養(yǎng)24 h。結(jié)果見表8。

3 討論

采用平皿法對人工牛黃進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性檢查發(fā)現(xiàn)，稀釋級別為1：10及1：100的實(shí)驗(yàn)組均有部分實(shí)驗(yàn)菌株回收率不滿足50%～200%的要求。通過以含3%聚山梨酯80及0.3%卵磷脂胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋液溶解、稀釋樣品，結(jié)果表明當(dāng)稀釋級別為1：50時(shí)，成功消除了人工牛黃的抑菌活性，各實(shí)驗(yàn)菌株的回收率均滿足要求。

在進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)藥品不同的抑菌活性采用適宜的方法。對于無抑菌活性的藥品，可直接采用平皿法進(jìn)行檢查方法適用性驗(yàn)證[7]。如藥品有抑菌活性則需要通過增大稀釋液或培養(yǎng)基體積、加入中和劑或滅活劑、采用薄膜過濾法或上述幾種方法的聯(lián)合使用等手段去除樣品的抑菌活性[4]，才能反映藥品真實(shí)的微生物污染情況[8]并驗(yàn)證藥品抑菌作用去除的有效性，以及去除方法對污染菌生長檢出的影響[6]，若使用中和劑或滅活劑，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對照組，即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同實(shí)驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對微生物無毒性。

表8耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.8Resultsofapplicabilitytestonthemethodofbile-tolerantgram-negativebacteria

供試品濃度大腸埃希菌201704022017051220170527實(shí)驗(yàn)組0.1+++0.01+++0.001+++陽性對照組++陰性對照組--供試品濃度銅綠假單胞菌201704022017051220170527實(shí)驗(yàn)組0.1+++0.01+++0.001+++陽性對照組+++陰性對照組---

+表示培養(yǎng)基有菌生長或呈陽性；-表示培養(yǎng)基無菌生長或呈陰性

+ represents the growth of bacteria in the medium or the positive result；- represents no bacteria growth in the medium of the negative result