瑞芬太尼通過miR-206/GOLPH3調(diào)控胃癌細胞增殖和凋亡的實驗研究

陳曉軍,沈鑫寧,陳 亮

陳曉軍,沈鑫寧,義烏市中心醫(yī)院麻醉科 浙江省義烏市 322000

陳亮,義烏市中心醫(yī)院腫瘤科 浙江省義烏市 322000

核心提要: 瑞芬太尼能夠通過調(diào)節(jié)miR-206和GOLPH3表達抑制AGS細胞增殖并誘導凋亡.

0 引言

胃癌(gastric cancer,GC)是世界常見的消化道惡性腫瘤,據(jù)統(tǒng)計[1],2015年全球GC新發(fā)病例約130萬,死亡82萬例; 其中,僅我國GC新發(fā)病例就高達67萬,死亡50萬例,已成為繼肺癌之后的第二大常見惡性腫瘤[2]. 采用手術(shù)除術(shù)、放化療等綜合治療方式治療早期GC患者效果顯著,5年生存率達90%[3-5]; 但因GC早期缺乏明顯癥狀,多數(shù)患者就診時已處于進展期,大大增加了治療難度,導致患者預后較差,僅有10-12 mo的中位生存期,總體5年生存率約10%[6]. 針對晚期GC治療的瓶頸是易產(chǎn)生耐藥性. 因此,新藥的研發(fā)對晚期GC治療具有重要意義. 瑞芬太尼(Remifentanil)是一種μ型受體激動劑,具鎮(zhèn)痛作用,能夠通過組織和血液中的非特異性酯酶進行代謝,為臨床上常用的麻醉劑[7]. 多項研究[8,9]表明,瑞芬太尼能夠有效體外抑制結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤細胞增殖,同時促進細胞凋亡. 本研究通過使用40 nmol/L瑞芬太尼處理AGS、MKN-45人GC細胞檢測細胞活力和凋亡,以探討瑞芬太尼對AGS、MKN-45細胞增殖、凋亡的影響及其作用靶點.

1 材料和方法

1.1 材料 AGS、MKN-45人GC細胞購自ATCC; 胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自美國Gibco-BRL公司; MTT購自美國Sigma公司; 二甲基亞砜(DMSO)、ECL發(fā)光液、RIPA裂解液、PVDF膜購自北京Solarbio公司; Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司; GOLPH3 siRNA、control siRNA由山東維真生物科技有限公司公司設計合成; pcDNAGOLPH3過表達載體由金瑞斯生物科技公司構(gòu)建;miR-206 mimics、control mimics、miR-206 inhibitors、control inhibitors由上海吉瑪基因公司設計合成; 兔抗GOLPH3、GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購自美國Abcam公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司; 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司; Trizol試劑購自北京天根生化科技有限公司; TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa實時熒光定量試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司; NanoDrop微量核酸測定儀購自美國賽默飛世爾科技公司; ELx808吸收光酶標儀購自賽默飛世爾科技有限公司; Forma TM Steri-cycle TM i160 CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司; CFX96 Touch TM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)、ChemiDoc TM MP凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組: 將AGS、MKN-45細胞放入37 ℃恒溫水浴鍋中以融化細胞,800 g離心收集. 使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細胞,胰酶消化后重懸,調(diào)整細胞懸液濃度為1×105個/mL并接種于24孔板. 待細胞生長至匯合度約45%,按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將miR-206 mimics、control mimics、miR-206 inhibitors、control inhibitors、GOLPH3 siRNA、control siRNA、pcDNA、pcDNA-GOLPH3轉(zhuǎn)染至AGS、MKN-45細胞,并依次標記為miR-206組、miR-NC組、anti-miR-206組、anti-miR-NC組、si-GOLPH3組、si-NC組.

將AGS、MKN-45細胞分為Re組、Con組、Re+anti-miR-206組、Re+anti-miR-NC組、Re+pcDNAGOLPH3組、Re+pcDNA組. 處理方法: 使用0.9%氯化鈉完全溶解瑞芬太尼并使用無菌過濾器過濾. Re組:細胞培養(yǎng)液中加入瑞芬太尼溶液并調(diào)整終濃度為40 nmol/L[9]; Con組: 細胞培養(yǎng)液中加入等量0.9%氯化鈉;Re+anti-miR-206組: 轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitors的細胞使用含終濃度為40 nmol/L瑞芬太尼的培養(yǎng)液培養(yǎng); Re+antimiR-NC組: 轉(zhuǎn)染control inhibitors的細胞使用含終濃度為40 nmol/L瑞芬太尼的培養(yǎng)液培養(yǎng); Re+pcDNA-GOLPH3組: 轉(zhuǎn)染pcDNA-GOLPH3的細胞使用含終濃度為40 nmol/L瑞芬太尼的培養(yǎng)液培養(yǎng); Re+pcDNA組: 轉(zhuǎn)染pcDNA的細胞使用含終濃度為40 nmol/L瑞芬太尼的培養(yǎng)液培養(yǎng). 每組6個復孔,實驗重復3次.

1.2.2 qRT-PCR: 收集各組對數(shù)生長期的細胞,充分研磨后加入Trizol試劑提取總RNA,微量核酸測定儀檢測其純度和濃度. 使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系,以GAPDH為內(nèi)參置于實時熒光定量PCR儀上進行擴增,每個樣品重復3次,實驗結(jié)果分析采用F= 2-△△Ct法. GAPDH引物:正向: 5'-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3',反向: 5'-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3'; miR-206引物: 正向: 5'-AGTTCACCTTGATGCCGTTCT-3',反向: 5'-CAGTGCTTCAGCC GCTACCC-3'; GOLPH3引物: 正向: 5'-AAGCCGTTCTTGACAAATGG-3',反向: 5'-AGGGGCCATCCACAGTCCTTC-3'.

1.2.3 MTT法檢測細胞活力: 分別在各組細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT,繼續(xù)孵育4 h; 去除多余培養(yǎng)液后加入150 μL DMSO振蕩反應10 min,酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值. 細胞活力 =(對照組OD值-實驗組OD值)/實驗組OD值×100%.

1.2.4 細胞凋亡檢測: 取生長狀態(tài)良好的各組細胞,0.25%胰蛋白酶消化后4 ℃、300 g離心10 min,棄上清收集細胞. 使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI,輕輕混勻后室溫避光孵育15 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡.

1.2.5 Western blot: 收集各組細胞,加入RIPA裂解液置于冰上裂解,4 ℃,12000 g離心10 min,取上清液. 將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h. 分別加入兔抗GOLPH3(1:1000)和GAPDH(1:1000)多克隆抗體4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,每次10 min; 加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1:5000)室溫孵育2 h,TBST洗滌; ECL發(fā)光顯影,每個蛋白樣品重復3次.

1.2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒? Targetscan在線預測發(fā)現(xiàn)GOLPH3 3'UTR上存在miR-149的結(jié)合位點,為進一步驗證GOLPH3是否是miR-206的靶基因,按照Lipofectamine 2000使用說明書,將構(gòu)建好的野生型GOLPH3 3'UTR-WT(含GOLPH3 3'UTR片段)和突變型GOLPH3 3'UTR-MUT(GOLPH3 3'UTR片段突變體)載體分別與miR-206 mimics、control mimics共轉(zhuǎn)染至AGS細胞,培養(yǎng)24 h后檢測熒光素酶活性,相對熒光強度 =螢火蟲熒光強度/海腎熒光強度.

統(tǒng)計學處理使用GraphPad Prism 7和SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析,實驗數(shù)據(jù)以mean±SD表示,兩組間數(shù)據(jù)比較采用LSD-t檢驗,多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,P＜0.05具有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 瑞芬太尼對AGS 和MKN-45細胞miR-206表達和細胞增殖及凋亡的影響 以40 nmol/L瑞芬太尼處理AGS和MKN-45細胞,細胞中miR-206表達均上調(diào)(P＜0.05),對比Con組,Re組細胞活力均顯著降低(P＜0.05),凋亡率均顯著升高(P＜0.05)(圖1).

2.2 過表達miR-206抑制AGS和MKN-45細胞增殖并誘導凋亡 將miR-206 mimics轉(zhuǎn)染至AGS和MKN-45細胞后,細胞中miR-206表達水平均升高(P＜0.05),細胞活力均顯著降低(P＜0.05),同時細胞凋亡率均顯著上升(P＜0.05)(圖2).

圖1 瑞芬太尼對AGS和MKN-45細胞miR-206表達和增殖、凋亡的影響. A-C: 瑞芬太尼對AGS細胞中miR-206表達、增殖和凋亡的影響; D-F:瑞芬太尼對MKN-45細胞中miR-206表達、增殖和凋亡的影響; G: 瑞芬太尼對AGS和MKN-45細胞凋亡的影響. aP＜0.05,與Con組比較.

2.3 抑制miR-206表達對瑞芬太尼介導的AGS和MKN-45細胞增殖、凋亡的影響 由圖3可知,40 nmol/L瑞芬太尼能夠有效促進AGS和MKN-45細胞中miR-206表達(P＜0.05),抑制細胞活力(P＜0.05)并誘導細胞凋亡(P＜0.05),而將miR-206 inhibitors轉(zhuǎn)染至AGS和MKN-45細胞后,細胞中miR-206表達水平、細胞活力和凋亡率均有所恢復(P＜0.05).

2.4 miR-206靶向調(diào)控GOLPH3蛋白表達 通過Target scan預測發(fā)現(xiàn),GOLPH3 3'UTR上存在miR-206的結(jié)合位點,同時,miR-206 mimics與GOLPH3 3'UTR野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,熒光素酶活性降低(P＜0.05),而與GOLPH3 3'UTR突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,熒光素酶活性無明顯變化; 并且miR-206可把調(diào)控GOLPH3蛋白表達(P＜0.05)(圖4).

2.5 瑞芬太尼抑制AGS和MKN-45細胞中GOLPH3表達以40 nmol/L瑞芬太尼處理AGS和MKN-45細胞,細胞中GOLPH3在mRNA和蛋白水平的表達較Con組均顯著下調(diào)(P＜0.05)(圖5).

2.6 敲減GOLPH3對AGS和MKN-45細胞增殖、凋亡的影響 將GOLPH3 siRNA轉(zhuǎn)染至AGS和MKN-45細胞后,細胞中GOLPH3蛋白表達均下調(diào)(P＜0.05),對比si-NC組,si-GOLPH3組細胞活力均顯著降低(P＜0.05)而凋亡率均顯著升高(P＜0.05)(圖6).

圖2 過表達miR-206對AGS細胞增殖和凋亡的影響. A-C: 過表達miR-206對AGS細胞增殖、凋亡的影響; D-F: 過表達miR-206對MKN-45細胞增殖、凋亡的影響. aP＜0.05,與miR-NC組比較.

圖3 抑制miR-206表達對瑞芬太尼介導的AGS和MKN-45細胞增殖、凋亡的影響. A-C: 抑制miR-206表達對瑞芬太尼介導的AGS細胞增殖、凋亡的影響; D-F: 抑制miR-206表達對瑞芬太尼介導的MKN-45細胞增殖、凋亡的影響. aP＜0.05,與Con組比較; cP＜0.05,與Re+anti-miR-NC組比較.

2.7 過表達GOLPH3可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對AGS和MKN-45細胞的增殖抑制和凋亡促進作用 由圖7可知,40 nmol/L瑞芬太尼能夠有效抑制AGS和MKN-45細胞中GOLPH3表達和細胞活力(P＜0.05)、促進細胞凋亡(P＜0.05); 而將pcDNA-GOLPH3轉(zhuǎn)染至AGS和MKN-45細胞進行預處理后,細胞中GOLPH3蛋白表達水平、細胞活力和凋亡率均基本恢復至正常水平(P＜0.05).

3 討論

阿片類鎮(zhèn)痛藥在癌癥患者手術(shù)治療中具有廣泛的應用,其除鎮(zhèn)痛外,還具調(diào)節(jié)癌細胞增殖的作用[10,11]. 有研究報道,嗎啡具有促進癌細胞凋亡的作用,瑞芬太尼可抑制肺癌細胞生長[12]. 本研究運用qRT-PCR、Western blot檢測了瑞芬太尼處理的GC細胞AGS、MKN-45中miR-206、GOLPH3的表達發(fā)現(xiàn),瑞芬太尼可上調(diào)miR-206的表達,下調(diào)GOLPH3的表達.

圖4 miR-206靶向調(diào)控GOLPH3蛋白表達. A: GOLPH3 3'UTR上含有miR-206的互補序列; B: 雙熒光素酶活性檢測; C: GOLPH3蛋白表達檢測; D: miR-206調(diào)控GOLPH3蛋白表達. aP＜0.05,與miR-NC組比較; cP＜0.05,與anti-miR-NC組比較.

圖5 瑞芬太尼抑制AGS和MKN-45細胞中GOLPH3表達. A: 瑞芬太尼對AGS和MKN-45細胞中GOLPH3蛋白表達的影響; B和C: 瑞芬太尼對AGS細胞中GOLPH3 mRNA和蛋白表達的影響; C: 瑞芬太尼對MKN-45細胞中GOLPH3 mRNA和蛋白表達的影響. aP＜0.05,與Con組比較.

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約18～22nt的內(nèi)源性非編碼RNA分子,能夠通過與靶mRNA 3'UTR區(qū)互補配對使其降解或抑制其翻譯過程,從而調(diào)控多種基因表達,參與細胞生長、分化、胚胎發(fā)育、炎癥反應、免疫應答等生理過程,與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]. 已有證據(jù)[14,15]顯示,miR-519d、miR-138和miR-204等多種RNA分子在GC組織中異常表達,其表達水平與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),能夠通過調(diào)節(jié)細胞周期、基質(zhì)金屬蛋白酶表達抑制細胞增殖和轉(zhuǎn)移,從而發(fā)揮抑癌作用. 而miR-206由于首次在骨骼肌中被發(fā)現(xiàn),被認為與骨骼肌的生理病理過程有關(guān),其在骨骼肌發(fā)育及相關(guān)疾病中的研究較多[16]. 但近年來發(fā)現(xiàn),miR-206在肺臟、肝臟等組織器官中也有表達,并且在非小細胞肺癌、肺腺癌、肝癌、鼻咽癌等腫瘤組織或細胞中低表達,上調(diào)miR-206表達可通過阻滯細胞周期、促進細胞凋亡、抑制細胞轉(zhuǎn)移和血管生成發(fā)揮抑癌作用[17-19]. 此外,Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn),miR-206能夠通過靶向調(diào)節(jié)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子B亞家族成員1(ABCB1)表達降低乳腺癌細胞對紫杉醇的耐藥性.而在GC中,已有研究[21]表明,miR-206在GC組織中低表達,過表達miR-206能夠抑制腫瘤起始細胞的形成,并增強5-氟尿嘧啶的抗腫瘤作用.

圖6 敲減GOLPH3對AGS和MKN-45細胞增殖、凋亡的影響. A: 敲減GOLPH3對AGS和MKN-45細胞中GOLPH3蛋白表達的影響; B-D: 敲減GOLPH3對AGS細胞增殖、凋亡的影響; E-G: 敲減GOLPH3對MKN-45細胞增殖、凋亡的影響. aP＜0.05,與pcDNA組比較.

本文檢測發(fā)現(xiàn),過表達miR-206同樣能夠抑制細胞活力并誘導凋亡; 而下調(diào)miR-206表達則逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對AGS、MKN-45細胞活力的抑制和凋亡的促進作用. 提示,瑞芬太尼對AGS、MKN-45細胞增殖和凋亡的抑制或促進作用可能是通過調(diào)節(jié)miR-206表達來完成. 進一步預測miR-206的靶基因發(fā)現(xiàn),miR-206能夠與GOLPH3 3'UTR區(qū)的部分序列互補配對; 同時,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖estern blot結(jié)果顯示,miR-206能夠靶向調(diào)控GOLPH3蛋白表達. 提示,GOLPH3可能在瑞芬太尼調(diào)節(jié)miR-206表達抑制AGS、MKN-45細胞增殖并誘導凋亡的過程中發(fā)揮重要作用.

GOLPH3是一種新型癌基因,定位于人染色體5p13.3,主要存在于高爾基體囊泡反面的膜外圍、小管、質(zhì)膜等部位,參與蛋白糖基化修飾、促進蛋白從高爾基體到細胞膜的囊泡運輸、維持高爾基體結(jié)構(gòu)并影響高爾基體分泌功能[22]. 多項研究[23,24]表明: GOLPH3在結(jié)腸癌、上皮性卵巢癌等多種實體瘤組織中高表達,其表達水平與腫瘤生長、患者預后有關(guān). GOLPH3能夠通過磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)復合體的特定底物激活mTOR信號傳導,而mTOR信號通路與細胞生長、增殖、能量代謝等有關(guān); 并激活Wnt信號通路,促進癌細胞增殖,減少細胞凋亡; 對食管鱗狀細胞癌、肝癌等消化道腫瘤發(fā)揮促進作用[25,26]. 已有證據(jù)[27]表明,miR-134能靶向抑制GOLPH3表達從而抑制GC細胞增殖,過表達GOLPH3則逆轉(zhuǎn)miR-134對細胞增殖的抑制作用. 本文中,沉默GOLPH3表達可有效抑制細胞活力并促進細胞凋亡; 過表達GOLPH3則逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對細胞活力的抑制和凋亡的促進作用.

總之,瑞芬太尼可能是通過miR-206靶向調(diào)控GOLPH3表達、同時下調(diào)GOLPH3表達,從而抑制AGS、MKN-45細胞活力、誘導細胞凋亡; 單獨過表達miR-206或敲減GOLPH3,同樣能夠抑制細胞活力并誘導凋亡. 這一研究結(jié)果有望為瑞芬太尼用于GC的治療及miR-206和GOLPH3作為GC治療的新靶點提供實驗基礎.

圖7 過表達GOLPH3可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對AGS細胞增殖的抑制和凋亡的促進作用. A: 過表達GOLPH3對AGS和MKN-45細胞中GOLPH3蛋白表達的影響; B-D: 過表達GOLPH3對AGS細胞增殖、凋亡的影響; E-G: 過表達GOLPH3對MKN-45細胞增殖、凋亡的影響. aP＜0.05,與Con組比較; cP＜0.05,與Re+pcDNA組比較.

文章亮點

實驗背景

近些年,瑞芬太尼在癌癥治療中的新功能得到不斷開發(fā),但其對胃癌(gastric cancer,GC)細胞的作用機制國內(nèi)外尚未有人研究.

實驗動機

本研究旨在研究瑞芬太尼對GC細胞增殖、凋亡的影響,并探討其分子作用機制,以期望為解決GC治療過程中的耐藥問題提供線索.

實驗目標

探討瑞芬太尼抑制為癌細胞增殖,促進凋亡的作用及其機制,以期為GC的治療提供新藥.

實驗方法

將用40 nmol/L的瑞芬太尼處理的AGS和MKN-45細胞,分別隨機分成miR-206組、miR-NC組、anti-miR-206組、anti-miR-NC組、GOLPH3組、si-NC組、pcDNAGOLPH3組、pcDNA組、Re組、Con組、Re+antimiR-206組、Re+anti-miR-NC組、Re+pcDNA-GOLPH3組、Re+pcDNA組,用MTT法、流式細胞術(shù)分析GC細胞的增殖、凋亡,Western blot檢測GC細胞中GOLPH3的蛋白表達,雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-206與GOLPH3的靶向關(guān)系.

實驗結(jié)果

本研究建立瑞芬太尼治療的GC細胞發(fā)現(xiàn),瑞芬太尼通過上調(diào)miR-206,下調(diào)GOLPH3,發(fā)揮抑制GC細胞增殖,誘導其凋亡的治療作用. 上調(diào)GOLPH3或下調(diào)miR-206均能逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對GC的治療功效.

實驗結(jié)論

瑞芬太尼可抑制GC細胞的增殖,誘導為癌細胞的凋亡,其可能與調(diào)控miR-206/GOLPH3通路有關(guān),提示瑞芬太尼具有治療GC的潛力.

展望前景

本研究僅在體外研究瑞芬太尼對GC細胞增殖、凋亡的影響,后期還需增加瑞芬太尼對GC細胞的增殖、凋亡的裸鼠體內(nèi)對比實驗,以更清晰的展示瑞芬太尼對GC細胞的治療價值,也為瑞芬太尼治療GC提供更充分的理論依據(jù).