利用CRISPR-Cas9基因編輯技術制備牛MSTN基因編輯胚胎

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(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所/河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002； 3.鄭州外國語學校，河南 鄭州 450001)

雙肌性狀是指由于肌肉中肌纖維增多、全身肌肉總量顯著增加而形成的一種表型。動物的雙肌性狀最先在牛中被發(fā)現(xiàn)。牛雙肌性狀的最顯著特征是肌纖維的普遍肥大，可引起牛的肌肉質(zhì)量平均增加25%。除此之外，牛雙肌性狀的優(yōu)良性還表現(xiàn)在肌內(nèi)脂肪下降約50%，肌肉的結締組織成分下降20%～30%，并且飼料消耗比下降約9%。由于雙肌性狀具有顯著的肉用優(yōu)勢，所以一直是優(yōu)質(zhì)肉用家畜培育的一個研究熱點[1]。相關研究表明，肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)的基因功能異常是導致動物具有雙肌性狀的遺傳基礎[2-3]。MSTN是骨骼肌有效的負調(diào)控因子，研究表明，MSTN基因敲除小鼠具有由肌纖維增生和肥大引起的肌肉質(zhì)量顯著增加的雙肌效應，而MSTN基因過表達小鼠則表現(xiàn)為極度消瘦[2,4]。目前，在牛的MSTN基因上共發(fā)現(xiàn)6個自然發(fā)生的功能缺陷型突變，其中nt821(del11)是在MSTN基因的編碼區(qū)缺失了第818—828位核苷酸，從而引起了MSTN蛋白失活，這是比利時藍牛的雙肌遺傳基礎；p.C313Y是在MSTN基因編碼區(qū)第938位核苷酸發(fā)生了G到A的突變，從而引起了第313位氨基酸由半胱氨酸(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?Y)，最終導致蛋白質(zhì)失活，這是皮埃蒙特牛的雙肌遺傳基礎[2,5]。

基因編輯技術是近年來發(fā)展起來的可以對基因組實現(xiàn)精確修飾的生物技術，用于在基因組水平對基因進行定點突變、插入、刪除等工作。其中CRISPR-Cas9基因編輯技術僅需要合成1條gRNA就可以實現(xiàn)對基因組靶位點的識別，進而實現(xiàn)對基因組的定點編輯。由于其簡潔高效的特性，CRISPR-Cas9技術也被稱為“基因魔剪”[6-7]。目前，包括小鼠、豬、羊等在內(nèi)的多種動物，均已通過CRISPR-Cas9技術獲得了基因編輯個體，進一步證明了該技術在制備基因編輯動物上的普適性和高效性[8-11]。為了利用基因編輯技術的優(yōu)勢特性以及基因工程的手段來創(chuàng)造新的雙肌性狀肉用家畜品種，本研究利用CRISPR-Cas9基因編輯技術制備牛MSTN基因編輯胚胎，旨在為未來肉牛育種提供新的遺傳素材。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 供試牛卵巢樣品及胚胎培養(yǎng)主要試劑 供試牛卵巢共86對，均采集自鄭州市弓馬莊牛屠宰車間。TCM-199培養(yǎng)液、添加氨基酸的合成輸卵管液(SOFaa)、牛體外培養(yǎng)(Bo-IVC)液、體外成熟(IVM)基礎液、IVM液、體外受精(IVF)洗精液、IVF液配制參照文獻[11-13]。

1.1.2 陽性囊胚鑒定主要試劑 PCR試劑盒(生工生物，上海)、PCR產(chǎn)物純化試劑盒(天根，北京)、T7EI內(nèi)切酶(NEB，北京)等。

1.2 試驗儀器

1.2.1 牛胚胎培養(yǎng)主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，H240i)、臺式低速離心機(北京醫(yī)學儀器廠，800型)、體視鏡(Nikon，C-DS)、倒置顯微鏡(ZEISS，AXIOI)等。

1.2.2 顯微注射主要儀器 拉針儀(WPI，PUL-1)、斷針儀(NARISHIGE，MF-900)、顯微注射系統(tǒng)(Eppendorf，TransferMan NK 2)等。

1.3 牛卵母細胞的體外受精與受精卵的體外培養(yǎng)

1.3.1 牛卵母細胞的收集 共開展4次有效的牛胚胎體外培養(yǎng)試驗，將收集到的牛卵巢放入37 ℃、含有青鏈霉素的生理鹽水中，于4～6 h內(nèi)帶回進行后續(xù)試驗。首先，用預熱的生理鹽水將收集的牛卵巢沖洗3次，去除雜質(zhì)和血水，并用剪刀剔除卵巢表面的脂肪塊、結締組織和輸卵管等，再用生理鹽水將修剪后的卵巢清洗1次，將處理后的牛卵巢放于加入生理鹽水(含雙抗)的燒杯中，置于37 ℃恒溫臺上備用。然后，用10 mL注射器(帶有8號針頭)對卵巢表面直徑2～8 mm大小的卵泡內(nèi)容物進行抽吸，將卵泡液移至60 mm培養(yǎng)皿中，體視顯微鏡下用口吸管收集卵丘-卵母細胞復合體(Cumulus oocyte complex,COC)。

1.3.2 牛卵母細胞的體外成熟 將挑選出來的COC在IVM基礎液(預先平衡2 h)中清洗3遍，在IVM液中清洗2遍，將洗凈的COC移入IVM液微滴并置于成熟盤中。然后將成熟盤置于38.5 ℃、5%CO2、100%濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h，觀察牛卵母細胞成熟情況。

1.3.3 牛卵母細胞的體外受精 從液氮罐中取出凍精，放入38 ℃溫水中解凍5 s。將解凍后的精液于1 500 r/min離心5 min后，洗滌2次，棄除上清，向離心管中加入1.5 mL受精液，調(diào)整精子密度為5×106個/mL。將成熟后的卵母細胞和精子放入IVF液中，精卵共孵育8 h后完成體外受精。

1.3.4 牛受精卵在Bo-IVC液中的體外培養(yǎng) 精卵共孵育8 h后，用Bo-IVC液清洗3次，洗凈受精卵外圍精子及雜質(zhì)后移入Bo-IVC液中，統(tǒng)計24 h卵裂率、144 h桑胚率及168 h囊胚率。

1.4 靶向牛MSTN基因gRNA的設計

1.4.1 靶向牛MSTN基因gRNA序列的設計 根據(jù)NCBI上牛的MSTN基因序列(登錄號：NM_001001525)，利用在線軟件(http://crispr.mit.edu/)共設計了4條gRNA(表1)。

表1 靶向牛MSTN基因的gRNA序列

注：表中劃線部分為gRNA的前間隔序列鄰近基序(PAM)。

Note：The underlined part of the table is the protospacer adjacent motif (PAM) of the gRNAs.

1.4.2 gRNA的體外合成與體外切割活性驗證 將設計好的gRNA委托北京唯尚立德生物科技有限公司(http://www.v-solid.com/)進行體外合成及體外切割活性驗證。

1.5 顯微注射

將Cas9 mRNA和驗證后體外切割活性最高的gRNA進行稀釋后混合，使混合液中Cas9 mRNA最終的質(zhì)量濃度為50 ng/μL，gRNA最終的質(zhì)量濃度為25 ng/μL。將混合液裝入注射針中后，使用顯微注射系統(tǒng)，對受精卵進行逐個注射，受精卵膨脹至原來的1.25倍時立即停止注射，注射后的受精卵置于Bo-IVC液中繼續(xù)培養(yǎng)168 h，然后統(tǒng)計囊胚率。

1.6 囊胚樣品中MSTN基因編輯效率的檢測

1.6.1 囊胚收獲 將顯微注射后的受精卵置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待受精卵發(fā)育至囊胚時，將囊胚置于酸性臺式液中去除透明帶，然后將去除透明帶的囊胚在TCM-199培養(yǎng)液中反復清洗3次，以去除酸性臺式液。

1.6.2 體外切割活性最高gRNA切割靶位點的巢式PCR擴增 首先根據(jù)巢式PCR試劑盒操作說明準備外側(cè)擴增體系，最后將去除透明帶的囊胚直接加入PCR擴增體系中作為擴增模板進行擴增。引物序列為MSTNg5BT-osF：5′-ACCCAAATGTTGCTTCTTT-3′，MSTNg5BT-osR：5′-TCCTTCTTCTCCTGGTTCT-3′，預期擴增產(chǎn)物長度為343 bp。外側(cè)擴增結束后，以外側(cè)擴增產(chǎn)物為模板，進行內(nèi)測擴增，引物序列為MSTNg5BT-isF：5′-AAAGGCCCAACTGTGGATA-3′，MSTNg5BT-isR：5′-CAATGCTCTGCCAAATACC-3′，預期最終擴增產(chǎn)物長度為164 bp。

1.6.3 T7EI核酸內(nèi)切酶檢測 使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化擴增產(chǎn)物，然后將純化后的PCR產(chǎn)物兩兩混合，得到用于T7EI核酸內(nèi)切酶檢測的樣品，將混合好的樣品進行退火后，使用T7E1核酸內(nèi)切酶來鑒定樣品中發(fā)生突變的情況。酶切體系為15.0 μL：退火后的產(chǎn)物10.0 μL，10×Buffer2 1.5 μL，T7EI核酸內(nèi)切酶1.0 μL，用超純水補至15.0 μL。將其置于37 ℃溫育1 h，然后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。若PCR樣品中發(fā)生了基因編輯，則相鄰的2個混合樣品都會出現(xiàn)酶切條帶。

1.6.4 測序驗證 將T7EI核酸內(nèi)切酶檢測鑒定為陽性的PCR擴增純化產(chǎn)物，再次進行PCR擴增后，送至生工生物工程有限公司(上海)進行測序驗證。

2 結果與分析

2.1 牛胚胎的體外培養(yǎng)

如表2所示，成熟的卵母細胞在體外受精后，平均卵裂率為61.18%；進一步在體外培養(yǎng)受精卵，統(tǒng)計得其平均桑胚率為24.91%，平均囊胚率為21.28%。如圖1所示，體外培養(yǎng)的牛COC胞質(zhì)均勻且外圍顆粒細胞包裹均勻緊密，獲得的囊胚內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層界限清晰，囊胚腔明顯，細胞團體積充滿透明帶內(nèi)腔，表明成功實現(xiàn)了牛卵母細胞體外受精和體外培養(yǎng)。

表2 牛胚胎體外培養(yǎng)情況

A：體外培養(yǎng)的牛COC；B：體外培養(yǎng)168 h后獲得的牛囊胚

2.2 牛MSTN基因的gRNA序列與切割活性驗證結果

由圖2所示，對設計的4條牛MSTN基因gRNA進行切割活性驗證，結果表明，gRNA5、gRNA6、gRNA7、gRNA9的體外切割活性分別為96.00%、60.00%、93.00%、90.00%，其中，gRNA5的活性最高，可以用于進一步的胚胎驗證。

2.3 囊胚樣品中MSTN基因的編輯效率檢測結果

將獲得的330枚形態(tài)質(zhì)量較好的受精卵進行顯微注射，共注射成功282枚，在體外培養(yǎng)中共有163枚發(fā)生卵裂，最終獲得40枚囊胚。在最終獲得的40枚囊胚中，隨機選取13枚用于MSTN基因編輯效率的檢測。由圖3所示，利用巢式PCR擴增MSTN基因gRNA5切割靶位點的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，擴增產(chǎn)物長度為164 bp，與預期相符合。將所得13枚囊胚樣品的PCR擴增產(chǎn)物兩兩混合進行T7EI內(nèi)切酶檢測，結果表明，13個混合樣品中，有3個相鄰的樣品能夠檢測到酶切條帶，說明有2個PCR產(chǎn)物發(fā)生了基因編輯，基因編輯陽性率為15.40%(圖4)。將T7EI酶切檢測出的發(fā)生了基因編輯的PCR產(chǎn)物進行測序驗證，結果表明，在gRNA5靶點的下游出現(xiàn)了雙峰，說明在gRNA5靶點位置存在片段缺失從而造成了移碼突變(圖5)。結果表明，成功獲得了牛MSTN基因編輯胚胎。

1—4：靶向牛MSTN基因的gRNA5、gRNA6、gRNA7、gRNA9處理；5：標準陽性對照1(代表30%的切割活性)；6：標準陽性對照2(代表90%的切割活性)；7：標準陰性對照1(不添加gRNA)；8：標準陰性對照2(不添加gRNA和Cas9)；M：DL2000 DNA Marker

1—4:Treating by gRNA5,gRNA6,gRNA7,gRNA9 targeting bovineMSTNgene;5:The positive control 1 (represents 30% of cleavage activity);6:The positive control 2 (represents 90% cleavage activity);7:The negative control 1 (without gRNA);8:The negative control 2 (without gRNA and Cas9);M:DL2000 DNA Marker

圖24條靶向牛MSTN基因的gRNA的體外切割活性驗證

Fig.2Cleavageactivitydetectionof4gRNAstargetingbovineMSTNgene

1—6：抽檢的6個巢式PCR擴增產(chǎn)物；M：DL600 DNA Marker1—6:6 nested PCR amplification products sampled;M:DL600 DNA Marker圖3 gRNA5切割靶位點的巢式PCR擴增結果Fig.3 Nest PCR amplification results for the gRNA5 targeting site

圖4 13枚囊胚樣品中MSTN基因編輯效率的T7EI酶切檢測結果

圖5 gRNA5在牛MSTN基因上識別靶點的測序驗證

3 結論與討論

目前，牛胚胎體外生產(chǎn)技術的成功率已經(jīng)大幅度提高，平均的囊胚率可達30%左右，但仍然存在著總體效率低、體系不穩(wěn)定等問題。本研究中，牛胚胎體外培養(yǎng)的平均卵裂率為61.18%，平均桑胚率為24.91%，平均囊胚率為21.28%，低于國內(nèi)目前的平均水平。分析原因可能是試驗次數(shù)較少，許多試驗環(huán)節(jié)還需要進一步的優(yōu)化。王艷萍等[14]研究表明，添加10%的牛卵泡液對于牛卵母細胞的成熟具有顯著的提高作用，而本研究前期分析了牛卵泡液對顆粒細胞培養(yǎng)的影響發(fā)現(xiàn)，添加10%的牛卵泡液能夠顯著改善顆粒細胞的生長速度和生長狀態(tài)(未展示的結果)。除此之外，在牛胚胎體外培養(yǎng)過程中，胚胎細胞內(nèi)容易形成活性氧基團，活性氧可以損害胚胎的體外發(fā)育。有研究表明，低氧環(huán)境組(5% O2)的囊胚發(fā)育率顯著高于高氧環(huán)境組(20% O2)[15]。由于本研究受試條件的限制，尚未嘗試使用低氧環(huán)境來培養(yǎng)胚胎。鑒于氧化應激對胚胎培養(yǎng)的損傷作用，添加適量的抗氧化應激物質(zhì)，例如谷胱甘肽、吡格列酮和褪黑激素等[16-18]，也被證明能顯著提高牛胚胎體外培養(yǎng)的效果。因此，在未來的研究中，考慮組合添加營養(yǎng)物質(zhì)和抗氧化應激物質(zhì)，配合改善氧氣濃度，以期能夠進一步提高胚胎的體外發(fā)育效率。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)被認為是目前最高效的基因編輯技術，但篩選1條能夠在體內(nèi)高效切割靶位點的gRNA是提高基因編輯效率的關鍵[19]。在不同的研究中，針對不同的基因和不同的位點，所獲得的切割效率也各不相同。例如，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)定點突變豬MSTN基因的研究中，獲得的突變效率為38%，在人類293T細胞中突變AAVS1的效率為10%～25%[20]。雖然本研究中gRNA5在體外切割驗證時活性很高，可達到96.00%，但在牛胚胎中的基因編輯陽性率僅為15.40%，低于在豬上的類似研究。分析原因可能是RNA在注射時部分降解、顯微注射的RNA質(zhì)量濃度或注射量需要進一步優(yōu)化、供試動物體內(nèi)外環(huán)境存在差異。在未來的研究中將優(yōu)化試驗各步條件，以進一步提高gRNA在胚胎中的切割效率，從而提高MSTN基因編輯的效率。

胚胎移植是指將體內(nèi)、體外生產(chǎn)的哺乳動物早期胚胎移植到同種生理狀態(tài)相同的雌性動物體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成正常個體的生物技術。胚胎移植技術在提高優(yōu)秀母畜的繁殖力、加快遺傳進展、增加雙胎率、克服母畜不孕癥、降低引種費用以及減少疾病傳播等方面均具有重要價值。我國牛的胚胎移植技術目前比較成熟，凍胚的移植妊娠率為40%～50%。將本研究所得的MSTN基因編輯胚胎27枚進行凍存儲備，按照所得15.40%的陽性率，其中約包含4枚MSTN基因編輯胚胎，在未來有開展胚胎移植的合適條件下，預期能夠生產(chǎn)1～2頭MSTN基因編輯的“雙肌臀”牛。

本研究開展了牛卵母細胞體外受精和體外培養(yǎng)，結果表明，牛胚胎體外培養(yǎng)的平均卵裂率為61.18%，平均桑胚率為24.91%，平均囊胚率為21.28%。同時，本研究獲得多條能夠在體外高效編輯牛MSTN基因的gRNA序列，其中gRNA5的體外切割活性為96.00%。使用Cas9 mRNA和gRNA5顯微注射330枚牛受精卵后獲得40枚囊胚，檢測其中的13枚囊胚發(fā)現(xiàn)，有2枚中存在突變，基因編輯陽性率為15.40%。將陽性個體進行測序驗證表明，發(fā)生突變的陽性樣品在gRNA5靶位點存在片段缺失，從而造成了移碼突變。綜上，說明本研究利用CRISPR-Cas9基因編輯技術成功獲得了牛MSTN基因編輯胚胎，為我國未來的肉牛種質(zhì)創(chuàng)新提供了素材，對我國的肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的意義。