• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    外源Ca2+提高百合耐熱性的生理機制初探

    2019-03-06 04:24:56,,,,,
    河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年2期
    關(guān)鍵詞:耐熱性脯氨酸百合

    ,,, ,,

    (1.聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山東 聊城 252059; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095;3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/花卉發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控北京市重點實驗室,北京 100193)

    百合(Liliumspp.)為百合科百合屬球根花卉,具有重要的觀賞、食藥用價值。百合性喜冷涼、濕潤氣候,耐熱性較差,高溫造成百合生長停滯、植株矮小、少花盲花、莖稈軟、病蟲害嚴(yán)重等現(xiàn)象,嚴(yán)重影響切花的產(chǎn)量和質(zhì)量,并造成種球退化。我國大部分地區(qū)夏季炎熱,嚴(yán)重影響百合商品化周年生產(chǎn)[1]。所以,提高百合耐熱性是解決這一問題的關(guān)鍵。

    作為植物生長發(fā)育所必需的大量元素,Ca2+是細(xì)胞壁的組成成分,是細(xì)胞膜的穩(wěn)定劑,也是細(xì)胞內(nèi)多種酶的活化劑,同時作為第二信使,Ca2+與其受體蛋白如鈣調(diào)蛋白(CaM)、類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(CBL)、鈣離子結(jié)合蛋白激酶(CDPK)等結(jié)合,參與了植物對內(nèi)環(huán)境(發(fā)育)和外環(huán)境的感知和傳導(dǎo),涉及植物對病原菌、光、高低溫、機械損傷、干旱、鹽和滲透脅迫等的響應(yīng)[2]。施用外源Ca2+能提高植物的耐熱性。10 mmol/L Ca2+處理能夠有效緩解高溫強光對西葫蘆光合機構(gòu)的傷害[3]。10 mmol/L CaCl2處理能提高濱梅幼苗對高溫的耐受性,Ca2+信號系統(tǒng)參與了脅迫過程中滲透物質(zhì)和Ca2+-ATPase活性等的調(diào)節(jié)[4]。

    利用Ca2+、Ca2+載體A23187,鈣離子螯合劑EGTA,鈣離子通道阻抑劑LaCl3、異搏定(Verapamil),鈣調(diào)蛋白抑制劑氯丙嗪(Chlorpromazine, CPZ)、三氟拉嗪(Trifluoperazine, TFP)、N-(6-氨基己烷基)-5-氯-1-萘-黃胺(W7)等增強或阻礙Ca2+-CaM信號傳導(dǎo)是目前研究植物Ca2+-CaM信號功能的重要手段[5]。以東方百合雜種系(Liliumoriental hybrids)品種西伯利亞(Siberia)為試驗材料,研究CaCl2、EGTA和TFP對高溫脅迫下百合表型、相關(guān)生理指標(biāo)及基因表達(dá)的影響,探討Ca2+在百合耐熱性調(diào)節(jié)方面的功能及作用機制,以期為生產(chǎn)上應(yīng)用Ca2+提高百合耐熱性奠定理論與技術(shù)基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    試驗材料為東方百合雜種系西伯利亞,每盆1株。栽培基質(zhì)配比為V(草炭)∶V(細(xì)河砂)=2∶1。人工氣候室培養(yǎng)溫度為22 ℃/16 ℃(晝/夜),光照時間為14 h/d。CaCl2和EGTA購于中國國藥集團(tuán),TFP購于Sigma公司,熒光定量試劑盒SYBR?Premix ExTaq購自TaKaRa公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 熱害指數(shù)的測定 待百合地上部分長至約30 cm時,選取健壯、生長一致的植株,分別用5、10、15 mmol/L CaCl2,5、10、15 mmol/L EGTA和100、200、300 μmol/L TFP進(jìn)行灌根處理,以去離子水處理為對照,每5 d處理1次,共處理3次。每個處理6株苗,重復(fù)3次。第3次藥劑處理后立即將植株置于光照培養(yǎng)箱內(nèi),40 ℃脅迫處理72 h,光照時間為14 h/d。熱激處理后,取植株中部葉片(株間相近葉位),利用Photoshop CS5軟件參照于守超等[6]的方法測定葉面積,統(tǒng)計傷害面積率,計算熱害指數(shù)。熱害分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

    傷害面積率=葉片明顯失綠部分面積/葉片總面積×100%

    熱害指數(shù)= ∑(各級熱害葉數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級別數(shù)值)×100。

    表1 熱害分級標(biāo)準(zhǔn)

    1.2.2 相關(guān)生理指標(biāo)的測定 人工氣候室培養(yǎng)條件下,分別用15 mmol/L CaCl2、10 mmol/L EGTA和200 μmol/L TFP溶液灌根,以去離子水處理為對照,每5 d處理1次,共處理3次。每個處理15株苗,重復(fù)3次。第3次藥劑處理后立即將植株置于光照培養(yǎng)箱內(nèi),40 ℃脅迫處理72 h,光照時間為14 h/d,分別在熱激處理0、12、24、48、72 h取植株中部葉片(株間相近葉位),測定相關(guān)生理指標(biāo)。膜透性測定采用電導(dǎo)儀法,葉綠素含量測定采用浸提法,可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法,脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法,丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法,超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑顯色法。以上指標(biāo)的測定均參照李合生[7]的方法。

    1.2.3 相關(guān)熱響應(yīng)基因的表達(dá)分析 人工氣候室培養(yǎng)條件下,分別用15 mmol/L CaCl2、10 mmol/L EGTA和200 μmol/L TFP溶液灌根,以去離子水處理為對照,每5 d處理1次,共處理3次。第3次藥劑處理后立即將植株置于光照培養(yǎng)箱內(nèi),40 ℃熱激1 h和3 h,取植株中部葉片(株間相近葉位),用液氮速凍后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。采用實時熒光定量PCR(Real-time quantitative RT-PCR,qPCR)方法測定樣本中鈣調(diào)蛋白基因LoCaM3和熱激轉(zhuǎn)錄因子基因LoHsfA3a的表達(dá)量,以百合18SrRNA作內(nèi)參。試驗參照SYBR?Premix ExTaq試劑盒說明書進(jìn)行,儀器為ABI StepOnePlusTM。LoCaM3的擴增引物為qF1(5′-CATGTCATGACTAACCTAGGCGAG-3′)和qR1(5′-CCATTAGAAATCAGCCAGCACC-3′),LoHsfA3a的擴增引物為qF2(5′-CTTGGTTTAAGTACGCCAGTGGAAG-3′)和qR2(5′-GTAAAATATTGTAAAAGAACATGAAGCCTATGG-3′),18SrRNA的擴增引物為18SqF(5′-AGTTGGTGGAGCGATTTGTCT-3′)和18SqR(5′-CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3′)。反應(yīng)程序為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT方法[8]分析基因的相對表達(dá)量,3次生物學(xué)重復(fù)。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    用Excel 2007和SPSS 18處理分析數(shù)據(jù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Ca2+處理對高溫脅迫下百合葉片熱害指數(shù)的影響

    熱激處理對葉片造成了不同程度的傷害,CaCl2、EGTA和TFP處理對百合葉片熱害指數(shù)的影響見圖1。結(jié)果表明,與對照相比,CaCl2處理顯著降低了葉片的熱害指數(shù)(P<0.05),隨著CaCl2濃度的增加,葉片的熱害指數(shù)逐漸降低,15 mmol/L CaCl2處理的葉片熱害指數(shù)比對照降低了58.53%。EGTA和TFP處理則顯著提高了葉片的熱害指數(shù)(P<0.05),熱害指數(shù)隨著處理濃度的增加而升高。與對照相比,10 mmol/L EGTA處理的熱害指數(shù)增加了56.11%,但與15 mmol/L EGTA處理差異不顯著。200 μmol/L TFP 處理的熱害指數(shù)比對照增加了69.94%,但與300 μmol/L TFP處理差異不顯著。根據(jù)表型結(jié)果,選擇15 mmol/L CaCl2、10 mmol/L EGTA 和200 μmol/L TFP處理用于后續(xù)的生理試驗。

    不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著,下同

    2.2 Ca2+處理對高溫脅迫下百合葉片抗性相關(guān)生理指標(biāo)的影響

    2.2.1 細(xì)胞膜透性 高溫破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞膜的透性增加,電解質(zhì)外滲。因此,細(xì)胞膜電解質(zhì)滲透率能反映出高溫對植物傷害的程度。由圖2A可以看出,隨著熱激時間的延長,百合葉片的相對電導(dǎo)率逐漸增大。Ca2+處理的相對電導(dǎo)率始終低于對照,表明Ca2+處理能夠緩解高溫下細(xì)胞膜透性的增大。EGTA和TFP處理的相對電導(dǎo)率始終高于對照,表明EGTA和TFP處理加劇了高溫下細(xì)胞膜透性的增大。

    2.2.2 葉綠素含量 高溫脅迫過程中,百合葉片的葉綠素含量逐漸降低(圖2B),表明高溫抑制了葉綠素的合成,促進(jìn)了葉綠素的降解。與對照相比,Ca2+處理的葉綠素含量下降趨勢較緩,熱激72 h后,降幅為對照的69.88%,葉綠素含量是對照的1.56倍;而EGTA和TFP處理則加劇了葉綠素含量的下降,熱激72 h后,降幅分別為對照的1.22倍和1.31倍,葉綠素含量分別是對照的58.15%和42.55%。

    2.2.3 脯氨酸和可溶性蛋白含量 植物細(xì)胞可以通過滲透調(diào)節(jié)的方式抵御高溫脅迫,脯氨酸是最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一,可以防止植物水分散失和提高原生質(zhì)膠體的穩(wěn)定性。圖2C表明,熱脅迫前期(0~24 h),EGTA和TFP處理的脯氨酸含量升高,但絕對含量和增幅均顯著低于對照(P<0.05)。隨后,EGTA處理的脯氨酸含量變化不大,而TFP處理的脯氨酸含量降低后又迅速升高,72 h的含量接近對照水平。高溫脅迫過程中Ca2+處理和對照的脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在48 h達(dá)到峰值,Ca2+處理的脯氨酸含量分別比對照、EGTA和TFP處理增加了27.24%、117.37%和165.80%。

    可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì),其增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力,也對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用。高溫脅迫過程中,各處理的可溶性蛋白含量先升高后降低(圖2D),前期升高可能是由于高溫誘導(dǎo)合成了熱激蛋白(HSP),后期降低可能是持續(xù)高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻和降解加劇。熱脅迫期間,Ca2+處理的可溶性蛋白含量始終高于對照,EGTA和TFP處理的可溶性蛋白含量始終低于對照。各處理的可溶性蛋白含量差異在48 h達(dá)到最大,Ca2+處理是對照的1.37倍,EGTA和TFP處理分別為對照的73.81%和52.86%。

    2.2.4 MDA含量和SOD活性 高溫脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞積累過多活性氧,引起或加劇膜脂過氧化作用,MDA是產(chǎn)物之一,其含量的高低可以反映膜的損傷程度。高溫脅迫期間,百合葉片MDA含量的變化趨勢如圖2E所示,各處理的MDA含量持續(xù)增加。熱激12 h,各處理的MDA含量無顯著差異(P>0.05)。熱激24、48、72 h,EGTA處理的MDA含量分別是對照的1.64、1.34、1.21倍,TFP處理的MDA含量分別是對照的1.88、1.61、1.34倍,Ca2+處理的MDA含量分別是對照的67.85%、62.21%和77.83%。

    雖然高溫下產(chǎn)生的自由基會傷害細(xì)胞,然而植物體也有防御系統(tǒng),SOD 是植物抗氧化防御系統(tǒng)中的保護(hù)酶之一,能清除高溫脅迫下細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過多活性氧,以減輕活性氧對細(xì)胞的傷害。Ca2+、EGTA和TFP處理對高溫脅迫下百合葉片SOD活性的影響見圖2F。高溫脅迫期間,各處理的SOD活性呈先升高后降低的趨勢。與對照相比,Ca2+處理顯著提高了SOD活性(P<0.05),差異隨脅迫時間的延長逐漸變大,至72 h,SOD活性為對照的2.15倍。EGTA和TFP處理的SOD活性在熱脅迫初期(0~12 h)小幅增強后持續(xù)降低,至72 h,SOD活性分別為對照的36.14%和26.25%,表明EGTA和TFP處理顯著抑制了SOD活性(P<0.05)。

    圖2 高溫脅迫下不同藥劑處理對百合葉片抗性相關(guān)生理指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of different chemicals on correlative physiological indexes of lily leaves under heat stress

    2.3 Ca2+處理對高溫脅迫下百合LoCaM3和LoHsfA3a表達(dá)的影響

    CaM3與HsfA3a參與了百合的熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[9-10]。40 ℃熱脅迫條件下,檢測了CaCl2、EGTA、TFP處理1 h后葉片LoCaM3的表達(dá)量和處理3 h后葉片LoHsfA3a的表達(dá)量(圖3)。結(jié)果表明,與對照相比,CaCl2處理顯著促進(jìn)了LoCaM3和LoHsfA3a的表達(dá)(P<0.05),而EGTA或TFP處理則顯著抑制了LoCaM3和LoHsfA3a的表達(dá)(P<0.05),表明外源Ca2+可以通過Ca2+/CaM-HSF信號途徑參與百合的熱激反應(yīng)。

    圖3 高溫脅迫下不同藥劑處理的百合葉片LoCaM3和LoHsfA3a的表達(dá)量Fig.3 Expression of LoCaM3 and LoHsfA3a of leaves treatment with different chemicals under heat stress

    3 結(jié)論與討論

    目前,有關(guān)百合的耐熱研究主要集中在以下2個方面:第一,百合對高溫脅迫的形態(tài)和生理響應(yīng)。東方百合Sorbonne、岷江百合等在高溫環(huán)境下葉片逐漸萎蔫、變黃,隨著溫度的升高和處理時間的延長,植株的耐熱指數(shù)不斷下降[11-12]。本研究中,西伯利亞百合在高溫脅迫下的表型變化與上述研究基本一致,40 ℃熱激72 h后,葉片基本都萎蔫下垂,因此,根據(jù)葉片的失綠程度進(jìn)行熱害分級,能夠客觀反映植株的受害程度。與對照相比,5~15 mmol/L CaCl2處理顯著降低了熱害指數(shù),5~15 mmol/L EGTA和100~300 μmol/L TFP處理則顯著提高了熱害指數(shù)。高溫處理的百合葉片脯氨酸、MDA含量和相對電導(dǎo)率顯著升高,這3個指標(biāo)可作為耐熱性鑒定的生理指標(biāo)[13]。高溫脅迫下,百合的過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、SOD等抗氧化酶的活性和谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(AsA)等抗氧化劑的含量處于較高水平,可以有效清除高溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧,提高百合的耐熱性[14]。本試驗中,熱脅迫導(dǎo)致相對電導(dǎo)率和MDA含量升高,脯氨酸、可溶性蛋白含量和SOD活性先升高后降低,葉綠素含量下降,這與楊煒茹等[12]對岷江百合的研究結(jié)果基本一致。第二,提高百合耐熱性的途徑和方法。利用物理或化學(xué)的方法可以提高百合的耐熱性。熱激鍛煉百合種球可以提高植株SOD活性、可溶性糖含量和根系活力[15],可以引起植株體內(nèi)SOD與光合色素的協(xié)同作用并提高系統(tǒng)的熱耗散[16],能抑制由高溫脅迫引起的相對電導(dǎo)率的升高[17],從而提高百合的耐熱性。外源水楊酸可以通過提高抗氧化系統(tǒng)酶的活性來增強百合的耐熱性[18]。外施Ca2+可以提高小麥[19]、半夏[20]、藤本月季[21]、高山杜鵑[22]等植物的耐熱性,之前的研究表明,外源Ca2+處理可以顯著提高麝香百合品種白天堂組培苗的耐熱性[9],但未深入研究其生理機制。本研究結(jié)果表明,與單純高溫處理相比,15 mmol/L CaCl2處理能夠降低電解質(zhì)滲透率和MDA含量,提高葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量和SOD活性,即通過降低細(xì)胞膜透性和膜脂過氧化作用,提高光合色素、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性,增強植株的耐熱性;10 mmol/L EGTA和200 μmol/L TFP處理則加劇了電解質(zhì)的外滲和MDA的積累,降低了葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量以及SOD活性,從而降低植株的耐熱性。在對茄子[23]、濱梅[4]、棉花[24]等的研究中也得到了類似的結(jié)果,表明作為植物生長發(fā)育所必需的大量元素,Ca2+也可能通過Ca2+-CaM信號途徑介導(dǎo)百合對高溫脅迫的響應(yīng)。篩選耐熱種質(zhì)是培育耐熱品種的基礎(chǔ)[25-26],雜交育種是提高百合耐熱性的主要途徑[27-28]。近年來,百合耐熱轉(zhuǎn)基因育種也取得了初步進(jìn)展。尚愛芹等[29]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將擬南芥干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白AtDREB2A基因轉(zhuǎn)化百合,高溫脅迫下,轉(zhuǎn)基因植株的POD、SOD活性等及脯氨酸含量高于野生型植株,耐熱性明顯強于野生型植株。從百合中鑒定了一些耐熱功能基因,如LlHsfA1[30]、LlHsfA2a[31]、LlHsfA2b[32]、LlHsfA3a[10]、LlHsfA3b[10]、LlHSP70[33]、LimHSP16.45[34]等。前期對麝香百合的研究中發(fā)現(xiàn),LlCaM3為響應(yīng)Ca2+和熱脅迫的重要信號分子,Ca2+/LlCaM3可能在A類HSF的上游發(fā)揮作用[9];LlHsfA3a的表達(dá)受熱脅迫誘導(dǎo),轉(zhuǎn)基因擬南芥中一些HSP基因的表達(dá)量顯著增加[10]。在本研究中,檢測了CaCl2、EGTA、TFP處理對高溫脅迫下東方百合LoCaM3和LoHsfA3a表達(dá)的影響,結(jié)果表明,CaCl2處理顯著促進(jìn)了LoCaM3和LoHsfA3a的表達(dá),而EGTA或TFP處理則顯著抑制了LoCaM3和LoHsfA3a的表達(dá),說明外源Ca2+可能通過Ca2+/CaM-HSF信號途徑誘導(dǎo)HSP的合成,利用HSP的分子伴侶作用[35],提高百合的耐熱性。

    15 mmol/L CaCl2處理能夠緩解由高溫脅迫造成的膜透性的加大和MDA的積累,提高葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量和SOD活性,促進(jìn)熱響應(yīng)基因LoCaM3和LoHsfA3a的表達(dá),表明Ca2+作為植物生長所必需的大量元素和偶聯(lián)胞外信號與胞內(nèi)生理反應(yīng)的第二信使,能通過提高細(xì)胞的光合能力、滲透調(diào)節(jié)能力、抗氧化能力和蛋白質(zhì)活性來維持細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,從而增強百合對高溫脅迫的抗性。利用Ca2+提高栽培作物的抗逆性具有成本低、對環(huán)境影響小的突出優(yōu)勢,本研究初步探討了Ca2+對百合耐熱性的影響及其生理機制,為生產(chǎn)上應(yīng)用Ca2+提高百合耐熱性奠定了理論與技術(shù)基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    耐熱性脯氨酸百合
    國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)脯氨酸恒格列凈片上市
    中老年保健(2022年3期)2022-11-21 09:40:36
    風(fēng)吹百合香
    植物體內(nèi)脯氨酸的代謝與調(diào)控
    清心消暑話百合
    反式-4-羥基-L-脯氨酸的研究進(jìn)展
    百合依依
    耐熱性能優(yōu)異的鋁合金
    鋁加工(2017年1期)2017-03-07 00:53:33
    干旱脅迫對馬尾松苗木脯氨酸及游離氨基酸含量的影響
    退火對聚乳酸結(jié)晶及耐熱性能的影響
    中國塑料(2015年6期)2015-11-13 03:02:52
    誤區(qū):耐熱性好,維生素E不會損失
    中国美女看黄片| 99国产精品免费福利视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 在线观看免费日韩欧美大片| 老司机福利观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 麻豆久久精品国产亚洲av | 亚洲一区二区三区欧美精品| 男人的好看免费观看在线视频 | 精品福利观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产免费男女视频| 欧美成人午夜精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 神马国产精品三级电影在线观看 | 亚洲五月天丁香| 制服诱惑二区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲黑人精品在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 免费在线观看日本一区| 精品久久久精品久久久| 欧美人与性动交α欧美软件| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 妹子高潮喷水视频| www日本在线高清视频| 成人影院久久| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美黑人欧美精品刺激| 午夜免费成人在线视频| 12—13女人毛片做爰片一| 精品高清国产在线一区| 黄色a级毛片大全视频| 美女 人体艺术 gogo| 国产欧美日韩一区二区三| 日韩中文字幕欧美一区二区| 超碰成人久久| 午夜日韩欧美国产| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 18禁国产床啪视频网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 精品福利观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 欧美黑人欧美精品刺激| 免费日韩欧美在线观看| 人妻久久中文字幕网| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 波多野结衣高清无吗| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 麻豆av在线久日| 精品久久久久久,| 午夜视频精品福利| 咕卡用的链子| 国产人伦9x9x在线观看| 满18在线观看网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 日本一区二区免费在线视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲国产精品999在线| 老汉色∧v一级毛片| 美女福利国产在线| 日韩大码丰满熟妇| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 亚洲av片天天在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 成年版毛片免费区| 99久久综合精品五月天人人| 中文字幕人妻熟女乱码| 十八禁网站免费在线| 亚洲av片天天在线观看| 国产精品成人在线| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美人与性动交α欧美软件| 性少妇av在线| 国产精品日韩av在线免费观看 | 国产亚洲欧美98| 欧美黑人精品巨大| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 黑人猛操日本美女一级片| 中文字幕人妻丝袜制服| av天堂在线播放| 91精品国产国语对白视频| 在线观看日韩欧美| 免费av毛片视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲免费av在线视频| 视频区欧美日本亚洲| 老汉色∧v一级毛片| 高潮久久久久久久久久久不卡| a级毛片在线看网站| 天天影视国产精品| 热re99久久国产66热| 女警被强在线播放| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 午夜福利影视在线免费观看| 黄色片一级片一级黄色片| av在线播放免费不卡| 一级毛片精品| 电影成人av| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| www日本在线高清视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久精品影院6| av国产精品久久久久影院| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲第一青青草原| 亚洲三区欧美一区| 制服人妻中文乱码| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一区二区三区国产精品乱码| 一级毛片女人18水好多| 久久热在线av| 看免费av毛片| 看片在线看免费视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品免费一区二区三区在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久伊人香网站| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲,欧美精品.| 999久久久精品免费观看国产| 日本三级黄在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产成人av激情在线播放| 真人一进一出gif抽搐免费| 99国产综合亚洲精品| 日韩欧美一区视频在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 三级毛片av免费| 校园春色视频在线观看| 久久中文字幕一级| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲av成人一区二区三| 中文字幕高清在线视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 日韩欧美国产一区二区入口| 成人av一区二区三区在线看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产亚洲精品一区二区www| 一级片'在线观看视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 级片在线观看| 黄片播放在线免费| 午夜免费鲁丝| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲一区二区三区不卡视频| 精品久久久久久成人av| 老鸭窝网址在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲伊人色综图| 看片在线看免费视频| 亚洲avbb在线观看| 极品教师在线免费播放| 国产一区在线观看成人免费| 国产精品99久久99久久久不卡| 俄罗斯特黄特色一大片| 色在线成人网| 亚洲国产欧美网| 大码成人一级视频| 视频区图区小说| 高清黄色对白视频在线免费看| 韩国精品一区二区三区| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费不卡黄色视频| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲精品国产区一区二| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲av片天天在线观看| 免费不卡黄色视频| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲av电影在线进入| 18禁国产床啪视频网站| av在线播放免费不卡| 亚洲第一青青草原| 嫩草影院精品99| 国产一区二区在线av高清观看| 电影成人av| 99久久国产精品久久久| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 香蕉久久夜色| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 一区二区三区国产精品乱码| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲欧美一区二区三区久久| 中文字幕精品免费在线观看视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 视频区欧美日本亚洲| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产99久久九九免费精品| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品综合久久久久久久免费 | 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲三区欧美一区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产成人影院久久av| 91麻豆av在线| 欧美不卡视频在线免费观看 | 999久久久精品免费观看国产| 久久久国产一区二区| 性色av乱码一区二区三区2| 黄色视频不卡| 成人特级黄色片久久久久久久| 日韩国内少妇激情av| 亚洲成人久久性| 国产av一区二区精品久久| 男女之事视频高清在线观看| av福利片在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美国产精品va在线观看不卡| 身体一侧抽搐| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美成狂野欧美在线观看| 免费观看人在逋| 视频区欧美日本亚洲| ponron亚洲| 嫩草影视91久久| 少妇 在线观看| 精品久久久精品久久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产成人啪精品午夜网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美不卡视频在线免费观看 | 九色亚洲精品在线播放| 韩国av一区二区三区四区| av国产精品久久久久影院| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品国产一区二区久久| 国产精品 国内视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 99国产精品免费福利视频| 日本五十路高清| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 午夜a级毛片| 国产精品二区激情视频| а√天堂www在线а√下载| 免费搜索国产男女视频| 成年人黄色毛片网站| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 日韩有码中文字幕| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 老汉色∧v一级毛片| 90打野战视频偷拍视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲全国av大片| 欧美黑人精品巨大| 交换朋友夫妻互换小说| www.精华液| 少妇 在线观看| 91精品三级在线观看| 日本wwww免费看| 国产成人免费无遮挡视频| 成年版毛片免费区| 免费高清视频大片| 午夜免费激情av| 亚洲情色 制服丝袜| 免费观看精品视频网站| 欧美成人午夜精品| 国产一区二区激情短视频| 性少妇av在线| 女性被躁到高潮视频| 国产av在哪里看| 国产伦人伦偷精品视频| 久久影院123| 热re99久久国产66热| 午夜免费成人在线视频| 亚洲第一av免费看| 电影成人av| 欧美大码av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日韩欧美三级三区| 电影成人av| 国产精品 欧美亚洲| 99国产精品一区二区三区| 久久天堂一区二区三区四区| 久久久国产成人免费| 国产av又大| 女人精品久久久久毛片| 人人澡人人妻人| 99国产精品一区二区三区| 岛国在线观看网站| 高清欧美精品videossex| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 69精品国产乱码久久久| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品电影一区二区三区| www日本在线高清视频| 色老头精品视频在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲av片天天在线观看| 日韩欧美三级三区| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜福利免费观看在线| 精品欧美一区二区三区在线| 国产精品国产高清国产av| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产单亲对白刺激| 国产乱人伦免费视频| 欧美黑人精品巨大| 香蕉国产在线看| 久久人妻av系列| 999精品在线视频| 另类亚洲欧美激情| 99精品久久久久人妻精品| 欧美国产精品va在线观看不卡| 成年人免费黄色播放视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 长腿黑丝高跟| 91大片在线观看| 国产高清激情床上av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品久久久av美女十八| 欧美黄色淫秽网站| 色在线成人网| 国产成人欧美在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲欧美日韩无卡精品| 少妇的丰满在线观看| 色在线成人网| 少妇的丰满在线观看| 精品久久久久久,| 99久久精品国产亚洲精品| 丝袜在线中文字幕| 日本一区二区免费在线视频| 好男人电影高清在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 不卡一级毛片| 一区在线观看完整版| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲精华国产精华精| 日韩精品中文字幕看吧| 啪啪无遮挡十八禁网站| a级毛片黄视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 天天添夜夜摸| 成人永久免费在线观看视频| 久久中文字幕一级| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产午夜精品久久久久久| 精品久久久久久成人av| 精品久久久久久,| 国产av又大| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产一区二区在线av高清观看| 欧美中文日本在线观看视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲av电影在线进入| 日本三级黄在线观看| 97碰自拍视频| 亚洲人成电影观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产av精品麻豆| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 母亲3免费完整高清在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 成人三级黄色视频| 午夜免费激情av| 精品国产国语对白av| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲免费av在线视频| 热re99久久精品国产66热6| 欧美成人性av电影在线观看| 精品久久久久久成人av| 亚洲伊人色综图| 久久久国产精品麻豆| 欧美日韩精品网址| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产成人精品久久二区二区91| 丁香六月欧美| 在线观看免费视频网站a站| 操美女的视频在线观看| 欧美日韩黄片免| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一级毛片女人18水好多| 日本欧美视频一区| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久影院123| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 中出人妻视频一区二区| 亚洲 国产 在线| 又大又爽又粗| 不卡av一区二区三区| 啦啦啦 在线观看视频| 十分钟在线观看高清视频www| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 视频在线观看一区二区三区| 看片在线看免费视频| 国产精品免费一区二区三区在线| aaaaa片日本免费| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 91av网站免费观看| 黄色怎么调成土黄色| 精品一品国产午夜福利视频| 很黄的视频免费| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 另类亚洲欧美激情| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲精品在线美女| 夜夜爽天天搞| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 桃红色精品国产亚洲av| 无限看片的www在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| a级毛片黄视频| 成人免费观看视频高清| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久热这里只有精品99| 国产区一区二久久| 国产一区二区三区视频了| 1024视频免费在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 他把我摸到了高潮在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 老司机午夜十八禁免费视频| 色哟哟哟哟哟哟| 老鸭窝网址在线观看| 日韩国内少妇激情av| 亚洲性夜色夜夜综合| 精品高清国产在线一区| 免费高清视频大片| 成人亚洲精品av一区二区 | 久久久精品欧美日韩精品| 看片在线看免费视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 精品人妻1区二区| 一区在线观看完整版| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 香蕉丝袜av| 国产1区2区3区精品| 日韩欧美一区视频在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产黄色免费在线视频| 日韩国内少妇激情av| 国产一区二区三区综合在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 成人国产一区最新在线观看| 一区在线观看完整版| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 成在线人永久免费视频| 免费观看精品视频网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 国产av在哪里看| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲精品中文字幕在线视频| 一进一出抽搐动态| 欧美av亚洲av综合av国产av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 在线永久观看黄色视频| 怎么达到女性高潮| 大陆偷拍与自拍| 老熟妇乱子伦视频在线观看| tocl精华| 色在线成人网| 天堂影院成人在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 免费观看精品视频网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 水蜜桃什么品种好| tocl精华| 成人国产一区最新在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 久久亚洲精品不卡| 精品国内亚洲2022精品成人| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久国产精品影院| 一级作爱视频免费观看| 免费在线观看影片大全网站| 免费在线观看黄色视频的| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品一区二区免费欧美| 极品教师在线免费播放| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日本一区二区免费在线视频| 免费少妇av软件| 亚洲精品国产一区二区精华液| 深夜精品福利| 国产成+人综合+亚洲专区| 男人的好看免费观看在线视频 | aaaaa片日本免费| 精品人妻在线不人妻| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 在线观看免费视频日本深夜| 人人妻人人澡人人看| 国产精品久久久av美女十八| 两个人看的免费小视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲精品中文字幕在线视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 乱人伦中国视频| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲精品一二三| 我的亚洲天堂| 香蕉丝袜av| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美午夜高清在线| 香蕉久久夜色| tocl精华| 一区福利在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 国产成人精品久久二区二区91| 老司机靠b影院| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 1024视频免费在线观看| 国产精品影院久久| 国产片内射在线| 天天添夜夜摸| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 午夜福利,免费看| 欧美性长视频在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 中文字幕高清在线视频| 人成视频在线观看免费观看| 97碰自拍视频| xxx96com| 男女之事视频高清在线观看| 久久久久久人人人人人| 国产成人啪精品午夜网站| 免费高清在线观看日韩| 一区二区三区激情视频| 亚洲成国产人片在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲激情在线av| 国产免费男女视频| av福利片在线| 免费av毛片视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 一区在线观看完整版| 国产主播在线观看一区二区| 9191精品国产免费久久| 欧美成狂野欧美在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲成人精品中文字幕电影 | 欧美黑人精品巨大| 午夜91福利影院| 真人一进一出gif抽搐免费| 在线观看免费视频网站a站| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲精品在线观看二区| 黄片播放在线免费| 精品福利永久在线观看| av中文乱码字幕在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲国产精品999在线| 91精品国产国语对白视频| 十八禁人妻一区二区| 99re在线观看精品视频| 91在线观看av| 69精品国产乱码久久久| 一进一出好大好爽视频| 欧美精品啪啪一区二区三区|