柑橘采后主要病害植物源殺菌劑的篩選及抑菌效果分析

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(1.湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，湖南 常德415100; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長沙410128)

柑橘(Citrusreticulata)是我國南方地區(qū)重要的水果之一，具有豐富的營養(yǎng)價值，但柑橘鮮果不耐貯藏，容易發(fā)生霉變，極大地降低了其經(jīng)濟效益[1-2]。柑橘采后病害一般以真菌性病害為主，常見的真菌為指狀青霉(Peniciliumdigitatum)、意大利青霉(Peniciliumitalicum)、橙酸腐卵形孢菌(Oosporacitriaurantii)及鏈格孢屬(Alternaria)、疫霉屬(Phytophthora) 真菌[3-5]。相關(guān)研究表明，柑橘采后腐爛主要由綠霉病和青霉病引起，占總腐爛量的80%以上，病菌的侵害導(dǎo)致鮮果貯藏期、貨架期短，在造成巨大經(jīng)濟損失的同時還對消費者的健康造成一定的影響，因此，延長柑橘鮮果的貯藏期非常必要[6-7]。目前市場上對柑橘貯藏的主要方式是化學(xué)試劑涂抹、熏蒸等，雖然具有一定延長柑橘貯藏期的效果，但化學(xué)試劑具有一定毒性和殘留，因此，研制出一種無毒、無污染的綠色保鮮劑十分重要[8-10]。如今從植物中尋找天然抑菌活性物質(zhì)，是開發(fā)和研制新型果蔬保鮮劑和殺菌劑的熱點之一，許多藥用植物提取物能有效抑制果蔬采后病害的發(fā)生和病原微生物的生長繁殖，其主要殺菌成分有揮發(fā)油類、生物堿類、酚類、酯類、醌類、醚類、黃酮類、皂素類和有機酸類等[11-13]。為此，選擇高效低毒、低殘留、對環(huán)境影響小、不易產(chǎn)生抗藥性的植物源殺菌劑進行抑菌效果研究，以期通過開發(fā)植物源殺菌劑，有效地控制柑橘采后病害，減少化學(xué)殺菌劑的用量，提高柑橘果實貯藏期間的安全性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試植物共有72種，部分購置于湖南九芝堂醫(yī)藥有限公司和湖南養(yǎng)天和大藥房，部分常見植物自行采摘。藥材經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物資源工程專業(yè)的肖深根教授鑒定。植物名稱及藥用部位列于表1。供試菌種為意大利青霉、指狀青霉，由植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室自行分離鑒定。葡萄糖、瓊脂粉、丙酮等購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司，均為分析純。主要儀器設(shè)備有HVA-85全自動高壓蒸汽滅菌鍋(上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司)、DSZ2000X倒置生物顯微鏡(北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司)、TGCXZ-5B超聲循環(huán)提取機(北京弘祥隆公司)、FA2004電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)、Buchi R3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)、DHG-9146A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(無錫建儀實驗器材有限公司)、SR-A10N-50冷凍干燥機(上海舍巖儀器有限公司)、pH計(METTLER TOLEDO公司)、DH5000B 電熱恒溫培養(yǎng)箱(西安禾普生物科技有限公司)、FW100萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)、LX-600P冷卻水循環(huán)機(北京長流科學(xué)儀器公司)。

表1 供試植物名稱及部位Tab.1 Test plant names and parts

續(xù)表1 供試植物名稱及部位Tab.1 (Continued) Test plant names and parts

1.2 試驗方法

1.2.1 植物提取物的制備 自行采摘植物經(jīng)過50～60 ℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，連同所購藥材分別打粉過0.15 ～0.30 mm篩，裝袋、編號。分別取各植物粉末10.0 g于100 mL潔凈的三角瓶中，加入50 mL丙酮提取溶劑，用保鮮膜封口，放入超聲儀中800 W、70 ℃提取1.5 h，抽濾，將濾液濃縮后倒入10 mL容量瓶中定容,得到質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的抑菌活性物質(zhì)，編號，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。另對迷迭香、肉桂、丁香提取物減壓濃縮后冷凍干燥至粉末，編號備用。

1.2.2 提取物抑菌效果測定 采用牛津杯法進行抑菌測定[14]。將滅菌后的PDA培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右，加入病原菌孢子懸浮液，使孢子最終濃度為105～106個/mL，將混有孢子的PDA培養(yǎng)基快速倒板。取牛津杯插入培養(yǎng)基中0.2 cm，等距放置4個，每個牛津杯中加入100 μL植物提取物(已過膜除菌)，培養(yǎng)皿封口后置于25 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)。每種植物提取物設(shè)3個重復(fù)，另設(shè)丙酮作為空白試劑對照(CK1)，80 μg/mL納他霉素作為陽性對照(CK2)。培養(yǎng)3 d后用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。

1.2.3 提取物最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)測定 將各植物提取物分別與45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基混勻，使提取物最終質(zhì)量濃度為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL。將混有提取物的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝固后加入濃度為105～106個/mL的病原菌孢子懸浮液0.5 mL，用小毛刷涂勻后封口，放置25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以丙酮處理作為空白對照。每天觀察一次，觀察3 d，記錄生長情況。

1.2.4 提取物最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)測定 根據(jù)最低抑菌質(zhì)量濃度，依次提高各提取物濃度倍數(shù)與PDA混合，倒入培養(yǎng)皿中，凝固后加菌，涂勻后封口，放置25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以丙酮處理作為空白對照。每天觀察一次，觀察3 d，記錄生長情況，確定無菌生長的最低提取物質(zhì)量濃度。

1.2.5 提取物對病原菌生長抑制率的測定 將迷迭香、肉桂、丁香提取物粉末分別與PDA培養(yǎng)基混合，制成最終質(zhì)量濃度為3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0(對照)mg/mL的平板，待其凝固后將直徑0.9 cm的供試病菌菌餅放置在平板的中央，每皿放置1塊，重復(fù)3次，將培養(yǎng)皿封口后放置25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 d。菌絲生長抑制率=(對照菌落凈生長距離-處理菌落凈生長距離)/對照菌落凈生長距離×100%。

1.2.6 提取物對病原菌孢子形成的影響 在6孔板中加入800 μL土豆液體培養(yǎng)基和200 μL孢子懸浮液，使孢子最終濃度為105個/mL，培養(yǎng)10 h，待孢子全部萌發(fā)后，將迷迭香、肉桂、丁香提取物粉末分別加入6孔板中，使得提取物最終質(zhì)量濃度為3.0、2.0、1.0、0.5、0 mg/mL，將6孔板放入25 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3 d，用血球計數(shù)板進行計數(shù)。

1.2.7 提取物對柑橘果實發(fā)病率的影響 取無損傷的寬皮柑橘果實100個，均勻噴灑2種霉菌孢子混合溶液(105～106個/mL)，在常溫下貯藏3 d。再用2.0 mg/mL的3種提取液分別均勻噴灑果皮表面，放在陰涼通風(fēng)處晾干，然后將果實放置于18 ℃、RH 90%的冷庫中貯藏，對照噴灑無菌水。每種提取物重復(fù)3次試驗。每隔10 d測定一次果實的發(fā)病率。發(fā)病率=發(fā)病果實個數(shù)/果實總數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用WPS 2018軟件進行數(shù)據(jù)處理及圖形制作。采用SPSS 18.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物提取物的抑菌活性

2.1.1 植物提取物對菌體的抑制效果 不同植物提取物抑菌效果具有較大的差別，如表2所示，有20種植物具有較強的抑菌活性，其中丁香、肉桂、迷迭香、細(xì)辛、山蒼子、零陵香、鳳仙透骨草、廣藿香、博落回等抑菌效果突出，抑菌圈直徑達到了20～35 mm。從結(jié)果可以看出，一般含有較多揮發(fā)油的植物具有較強的抑制真菌能力，同時鳳仙透骨草、博落回等含有生物堿、醌類、黃酮類的植物也具有一定的抑菌作用。

表2 植物提取物對病原菌菌體的抑制效果Tab.2 Inhibition effect of plant extracts on pathogenic fungi mm

2.1.2 植物提取物對菌體的MIC、MBC值 如表3所示，丁香、肉桂、迷迭香對2種致病菌的抑制效果較好，其MIC值非常低，僅為3.125～6.25 mg/mL，另外抑菌效果較好的還有細(xì)辛、山蒼子、零陵香、鳳仙透骨草、廣藿香、博落回、孜然、青蒿等，MIC值在6.25～25 mg/mL。各植物提取物的MBC值明顯增大，其中抑菌效果相對較好的是丁香，MBC值為25 mg/mL，可能是粗提物有效抑菌物質(zhì)含量低或純度低，以致殺菌的濃度偏高，這與康帥等[15]研究結(jié)果相似。

表3 植物提取物對病原菌MIC、MBC的測定結(jié)果Tab.3 Determination results of MIC and MBC to pathogens by plant extracts mg/mL

2.2 不同濃度植物提取物對病原菌的抑制效果

2.2.1 不同濃度提取物對病原菌孢子形成的影響 不同提取物對病原菌孢子形成的影響具有一定的差異。如表4所示，采用0.5 mg/mL質(zhì)量濃度處理時，意大利青霉孢子數(shù)在(3.22～4.20)×107個，指狀青霉孢子數(shù)在(2.85～3.50)×107個，其中丁香處理組抑制效果略好于其余2組。隨著各處理組質(zhì)量濃度的增加，對孢子形成的影響也逐漸加大，當(dāng)采用3.0 mg/mL質(zhì)量濃度處理時，孢子數(shù)量明顯減少，指狀青霉孢子數(shù)在(0.02～0.22)×107個，較對照降低了95.64%～99.60%，意大利青霉孢子數(shù)在(0.20～0.65)×107個，較對照降低了86.84%～95.95%。其中，丁香處理組孢子數(shù)最少，指狀青霉孢子數(shù)僅為0.02×107個。

表4 不同濃度植物提取物對病原菌孢子形成的影響Tab.4 Effects of different concentrations of plant extracts on sporulation of pathogenic fungi ×107個

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note： Different lower-case letters in the same column indicated that there was significant difference (P<0.05), the same below.

2.2.2 不同濃度提取物對意大利青霉的抑制率 不同濃度提取物對意大利青霉的抑制效果具有一定的差異。如圖1所示，采用0.5 mg/mL質(zhì)量濃度處理時，抑制率在6.83%～11.01%，隨著提取物質(zhì)量濃度的增加，抑制效果逐漸提高，提取物質(zhì)量濃度達到2.0 mg/mL時抑菌效果增加較為明顯，抑制率達到了50%左右，當(dāng)采用質(zhì)量濃度2.5 mg/mL處理時，迷迭香、丁香、肉桂組抑制率分別達到了64.19%、84.64%、72.25%。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度增加到3.0 mg/mL時，3個處理組的抑制率均達到了85%以上，說明3種提取物均具有較好的抑菌效果。通過回歸分析，迷迭香、丁香、肉桂3種提取物的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(EC50)分別為2.43、2.04、2.14 mg/mL。

圖1 不同濃度植物提取物對意大利青霉的抑制率Fig.1 The inhibition rate of different concentrations of plant extracts on P.italicum

2.2.3 不同濃度提取物對指狀青霉的抑制率 如圖2所示，在提取物質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，3種植物提取物對指狀青霉的抑制率為12.95%～14.59%，隨著提取物質(zhì)量濃度增加，抑制效果逐漸增強，采用2.0 mg/mL質(zhì)量濃度處理時，抑菌效果有了明顯的提高，抑制率達到了60%以上，當(dāng)采用質(zhì)量濃度2.5 mg/mL處理時，迷迭香、丁香、肉桂組抑制率分別達到了75.06%、78.02%、79.77%。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度增加到3.0 mg/mL時，3個處理組的抑制率均達到了90%以上，說明此時指狀青霉幾乎完全得到了抑制。通過回歸分析，迷迭香、丁香、肉桂三者的提取物對指狀青霉的EC50值分別為1.79、1.68、1.74 mg/mL。

圖2 不同濃度植物提取物對指狀青霉的抑制率Fig.2 The inhibition rate of different concentrations of plant extracts on P.digitatum

2.3 不同植物提取物對柑橘果實發(fā)病率的影響

采用不同植物提取物處理柑橘果實，每10 d測定一次果實發(fā)病率，結(jié)果如表5所示。果實貯藏30 d 時對照組果實的發(fā)病率達到了23%，3個處理組的果實發(fā)病率明顯較低，僅為對照組的21.74%～39.13%。對照組果實在貯藏50 d時發(fā)病率高達66%，而處理組果實發(fā)病率保持在30%左右，說明提取物對柑橘果實具有較好的防腐保鮮作用。在柑橘果實貯藏60 d時，對照組幾乎已全部發(fā)病，發(fā)病率達到了89%，而丁香處理組果實發(fā)病率為46%，肉桂、迷迭香處理組分別為52%、57%，相比對照組果實發(fā)病率分別減少了48.31%、41.57%、35.96%。3個處理組間，丁香處理組效果略好于肉桂組，肉桂處理組略好于迷迭香處理組。

表5 不同植物提取物對柑橘果實發(fā)病率的影響Tab.5 Effects of different plant extracts on the disease incidence of inoculated citrus fruits %

3 結(jié)論與討論

丁香、肉桂、迷迭香、細(xì)辛、山蒼子、零陵香、鳳仙透骨草、廣藿香、博落回等植物提取物對柑橘采后主要病害病原菌具有較強的抑菌效果。當(dāng)提取物的質(zhì)量濃度增加到3.0 mg/mL時，丁香、肉桂、迷迭香對意大利青霉、指狀青霉的抑制率均達到了85%以上，青霉菌得到了有效抑制。柑橘果實分別經(jīng)丁香、肉桂、迷迭香這3種中藥提取物處理后60 d，相對于對照組，果實發(fā)病率減少了35.96%～48.31%，但是果實感染真菌后儲藏期最好控制在30 d以內(nèi)。植物提取物可經(jīng)過進一步完善配方后用于柑橘大規(guī)模綠色防腐處理，以延長柑橘的貨架期，提高其經(jīng)濟價值。

丁香等部分植物源殺菌劑對柑橘采后病害具有一定的抑菌效果，采用質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的生藥處理，抑菌圈直徑可達20～35 mm，這些具有較強抑菌作用的中藥材提取物中一般含有較多的揮發(fā)油物質(zhì)及生物堿、黃酮和醌類物質(zhì)，這些植物代謝物可在一定程度上殺滅柑橘采后病原真菌，這與戴素明等[16]、付雯等[17]的研究結(jié)果一致。同時，還有個別具有揮發(fā)油、黃酮類物質(zhì)的提取物抑菌效果不是非常好，這可能是因為提取方法不具有針對性，有效成分的提取率不高，或者提取物本身抑菌效果不佳[18]。在后期試驗中，可單獨對幾種或某種抑菌效果好的藥材提取物進行分離純化，從而判定出具體的主要抑菌物質(zhì)及其抑菌能力。對部分效果較強的中藥材進行最低抑菌質(zhì)量濃度和最低殺菌質(zhì)量濃度的測定，結(jié)果表明，丁香、肉桂、迷迭香的MIC值較低，僅在3.125～6.25 mg/mL，一方面說明提取物抑菌效果較好，另一方面說明這些抑菌較強的植物在柑橘防腐保鮮方面具有較高的利用價值。提取物的MBC值較大，通常遠(yuǎn)大于MIC值，抑菌效果較好的丁香其MBC值達25 mg/mL，有些具有一定抑菌效果的植物MBC值達到了400 mg/mL，這可能是提取物雜質(zhì)過多，有些糖類、蛋白質(zhì)類雜質(zhì)反而有利于病原菌生長，因此不利于提取物殺菌[19]。

當(dāng)丁香、肉桂、迷迭香提取物以3.0 mg/mL質(zhì)量濃度處理病原菌時，菌絲所產(chǎn)生孢子的數(shù)量明顯減少，指狀青霉、意大利青霉孢子數(shù)分別減少了95.64%～99.60%、86.84%～95.95%，說明提取物不利于菌絲孢子的形成，阻礙了菌絲的正常生理代謝。通過回歸分析發(fā)現(xiàn)，迷迭香、丁香、肉桂提取物對意大利青霉菌絲生長的EC50值分別為2.43、2.04、2.14 mg/mL，對指狀青霉的EC50值分別為1.79、1.68、1.74 mg/mL，平均EC50值為2.11、1.86、1.94 mg/mL。3種植物提取物的EC50值均較低，抑菌效果較好，這可能是因為這些植物代謝物可改變細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞代謝和分化，擾亂細(xì)胞的正常生理功能，從而抑制或殺滅真菌[20-23]。3種提取物對柑橘果實的處理中，在果實貯藏60 d后，對照組柑橘幾乎全部腐爛，處理組果實發(fā)病率降低了35.96%～48.31%。植物提取物處理組可明顯減少果實發(fā)病率，一方面是因為提取物殺滅了真菌，另一方面可能是提取物對果實本身具有一定的防腐保鮮作用[24-25]。