甘草NRAMP基因家族的鑒定和生物信息學分析

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(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 制藥工程學院，河南 鄭州 450046; 2.河南大學 植物逆境重點實驗室，河南 開封 475004)

甘草屬于豆科甘草屬植物，其根莖是重要的中藥材。試驗和臨床研究證明,甘草的藥理功能豐富，具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、治療糖尿病、平喘和抗腫瘤等功效，同時，它還有免疫調(diào)節(jié)、護胃、護肝、保護神經(jīng)、保護心肌的作用[1-2]。雖然甘草是重要的中藥材，有著豐富的藥用功能，但跟其他中藥材一樣，甘草也面臨著重金屬污染問題[3]。

重金屬對于高等植物的生長來說非常重要，一些二價重金屬離子如Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Co2+等,是植物生長代謝中必需的微量元素；但有些重金屬元素則是不需要的，比如Cd2+、Hg2+和Pb2+等，如果轉(zhuǎn)運入植物體內(nèi)則會產(chǎn)生毒性，當中藥材中含有這類重金屬元素時易造成重金屬污染。在植物吸收金屬元素的過程中，膜轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮著重要作用，自然抗性相關(guān)巨噬細胞蛋白(Natural sesistance-associated macrophage protein,NRAMP)是其中一類重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白[4]。NRAMP基因家族在進化過程中高度保守，其同源基因在生命體中分布廣泛，細菌、酵母、昆蟲、動物和高等植物中都有這類家族成員[5-6]。目前，對多種生物NRAMP家族的研究已有報道。動物中的NRAMP1是第1個被鑒定的NRAMP家族成員，其能編碼完整的膜蛋白，主要分布在巨噬細胞中[7]，當發(fā)生吞噬作用時，該蛋白質(zhì)快速聚集到巨噬細胞的細胞膜上，通過控制二價陽離子的吸收來調(diào)節(jié)對細菌的吞噬作用[8]。在高等植物中，對于NRAMP家族成員的研究也越來越多，這些成員的功能正被逐步揭示出來。XIONG等[9]證明，花生中AhNRAMP1對于鐵的吸收發(fā)揮重要作用。在缺鐵時，擬南芥中的AtNRAMP3可以啟動液泡內(nèi)的金屬轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中[10]。在缺錳條件下，擬南芥中的AtNRAMP3和AtNRAMP4在種子萌發(fā)期可以轉(zhuǎn)運鐵，還有平衡錳的作用[11]。而中藥材甘草中NRAMP家族的研究，尤其是基因組水平的家族鑒定和特性分析鮮見報道。NRAMP轉(zhuǎn)運的選擇性不強，在轉(zhuǎn)運必需金屬元素的同時，一些有害金屬元素也會被轉(zhuǎn)運到植物體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，通過突變擬南芥中的NRAMP4基因可以改變Cd2+和Zn2+的吸收，但不影響Fe2+的轉(zhuǎn)運，這一發(fā)現(xiàn)為NRAMP選擇性轉(zhuǎn)運金屬離子提供了可能性[12]。基于此，對甘草NRAMP家族成員進行鑒定和生物信息學分析，旨在為提高甘草轉(zhuǎn)運金屬元素的選擇性，阻斷其重金屬污染研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料基因序列的獲取

擬南芥的全基因組序列獲取自https://www.arabidopsis.org/，大豆全基因組序列獲取自http://www.phytozome.net/soybean，水稻基因組序列下載自http://rapdb.dna.affrc.go.jp，陸地棉序列獲取自https://www.cottongen.org/。

1.2 甘草NRAMP基因家族的鑒定

利用甘草全基因組的核苷酸序列和氨基酸序列構(gòu)建本地Blast數(shù)據(jù)庫[13]，利用擬南芥的AtNRAMP1—AtNRAMP6為查詢條件(Query)，借助軟件Blast 2.4.0對構(gòu)建的甘草基因組數(shù)據(jù)庫進行本地Blastn和Blastp搜索(E值采用默認值)，初步篩選到擬南芥NRAMP基因家族在甘草中的同源基因。從http://pfam.xfam.org/網(wǎng)站上下載NRAMP結(jié)構(gòu)域的HMM模型(PF01566)，利用Hmmer 3.0軟件進一步對篩選出的基因進行NRAMP結(jié)構(gòu)域的查詢，手動刪除冗余序列，確認甘草NRAMP家族成員。

1.3 甘草NRAMP家族成員的特性和進化分析

利用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析甘草NRAMP家族蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)[14]，包括氨基酸數(shù)量、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點，利用哈佛大學的在線分析工具(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)預測蛋白質(zhì)的亞細胞定位，利用工具TMHMM分析甘草NRAMP蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。采用GSDS在線系統(tǒng)(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析NRAMP基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)。用MEME在線工具分析NRAMP蛋白的保守基序(Motif)，設(shè)置20個模塊(http://meme-suite.org/tools/meme)。利用SMART序列分析軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析蛋白質(zhì)的Nramp結(jié)構(gòu)域。利用SOPMA工具分析甘草NRAMP家族蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODEL軟件構(gòu)建甘草NRAMP蛋白的3D模型并用PROCHECK工具(http://servicesn.mbi.ucla.edu/PROCHECK/)計算模型的穩(wěn)定性。利用甘草全基因組的CDS序列和基因組序列計算甘草NRAMP基因在染色體上的位置，用MapInspect軟件繪制基因的染色體定位圖。

為了解甘草和其他植物NRAMP家族成員的進化關(guān)系，利用ClustalW軟件進行多種植物蛋白質(zhì)全長的多序列分析[15]，利用MEGA 5.05軟件采用N-J 法構(gòu)建進化樹，采用1 000次自展檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草NRAMP基因家族的鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析

利用Blast本地比對篩選和對NRAMP結(jié)構(gòu)域的鑒定，確定了11個甘草NRAMP基因家族成員，按照與NRAMP結(jié)構(gòu)域的匹配程度命名為GurNRAMP1—GurNRAMP11。分析這些成員編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(表1)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)蛋白質(zhì)家族成員的氨基酸數(shù)量介于300～549個，有3個成員不在此范圍內(nèi)，其中GurNRAMP7蛋白和GurNRAMP8蛋白的氨基酸序列較長，氨基酸個數(shù)分別為1 315個和1 269個，而GurNRAMP11蛋白僅由193個氨基酸組成。等電點分析表明，甘草NRAMP蛋白家族的等電點為4.90～9.06，說明它們可能在不同的微環(huán)境中發(fā)揮功能。通過亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，除了分子質(zhì)量更大的GurNRAMP7和GurNRAMP8定位在葉綠體外，其他成員均定位在細胞膜上，推測GurNRAMP7和GurNRAMP8這2個成員可能在不同部位發(fā)揮跨膜轉(zhuǎn)運作用。

表1 甘草NRAMP蛋白理化性質(zhì)分析Tab.1 The physicochemical property analysis of NRAMP proteins in Glycyrrhiza uralensis

2.2 甘草NRAMP家族的基因結(jié)構(gòu)和進化分析

通過對比甘草和擬南芥NRAMP家族成員的基因結(jié)構(gòu)(圖1)發(fā)現(xiàn)，GurNRAMP1—GurNRAMP4都有4個外顯子，這4個成員與擬南芥AtNRAMP2—AtNRAMP5的同源性較高，基因結(jié)構(gòu)也相似，推測在功能上也有相似性；GurNRAMP5、GurNRAMP6、GurNRAMP9和GurNRAMP10擁有更多的外顯子，數(shù)量為7～11個，并且與擬南芥AtNRAMP1、AtNRAMP6的進化關(guān)系更近；編碼蛋白質(zhì)分子質(zhì)量最大的2個成員GurNRAMP7、GurNRAMP8在進化關(guān)系上單獨聚為一簇，它們分別含有7、6個外顯子，結(jié)合它們的理化性質(zhì)尤其是亞細胞定位的差異，可以推斷這些成員在功能上存在較大差異；編碼蛋白質(zhì)分子質(zhì)量最小的GurNRAMP11與其他成員之間的進化距離均比較遠，說明它們的親緣關(guān)系較遠，推斷GurNRAMP11會發(fā)揮一些特殊的功能。 從進化關(guān)系分析，這11個成員含有的外顯子差異較大，說明它們的保守性不高，在進化過程中發(fā)生了較大的改變。

圖1 NRAMP家族成員在甘草和擬南芥中的進化和基因結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Analysis of phylogenetic relationship and gene structure of NRAMP family members between Glycyrrhiza uralensis and Arabidopsis thaliana

為了解甘草和其他植物NRAMP基因家族的進化關(guān)系，對雙子葉的甘草、擬南芥、大豆、陸地棉和單子葉的水稻進行種間進化關(guān)系分析，5個物種被分為3個亞類(圖2)。結(jié)果顯示，同一物種在進化關(guān)系上更為親近，每個亞類中都包含了單子葉植物和雙子葉植物的家族成員，說明遠在單子葉植物和雙子葉植物分離前，NRAMP基因已經(jīng)產(chǎn)生。通過對系統(tǒng)進化樹各個分支進一步分析發(fā)現(xiàn)，甘草與大豆的進化距離較短，說明甘草和大豆的NRAMP家族成員的親緣關(guān)系相較于其他物種更近。

圖2 NRAMP在甘草和其他植物中的進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of NRAMPs in Glycyrrhiza uralensis and other species

2.3 甘草NRAMP基因的染色體定位分析

在進化過程中，基因復制是進行基因家族擴增的方式，包括片段復制、串聯(lián)復制和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座等，其中，片段復制和串聯(lián)復制是主要的方式[16]。為了研究基因復制在基因分化和甘草NRAMP基因家族擴增中的作用，將11個GurNRAMP基因定位到9條染色體上(圖3)。結(jié)果顯示，GurNRAMP9、GurNRAMP10和GurNRAMP11定位在同一條染色體上，結(jié)合這3個基因在染色體上的具體位置，判斷這3個基因是串聯(lián)復制。另外8個基因分別定位在8條不同的染色體上，屬于片段復制。說明在甘草NRAMP基因家族進化過程中，片段復制和串聯(lián)復制都參與了基因的擴增，以片段復制為主。

2.4 甘草NRAMP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和保守基序分析

利用SMART在線分析工具分析甘草NRAMP家族蛋白質(zhì)的Nramp結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖4所示，每個家族成員都含有Nramp結(jié)構(gòu)域，其中，GurNRAMP8和GurNRAMP9有2個Nramp結(jié)構(gòu)域。大部分成員除了含有Nramp結(jié)構(gòu)域外，還有其他跨膜結(jié)構(gòu)。通過GO功能注釋方法分析Nramp結(jié)構(gòu)域有以下特征：生物學過程為轉(zhuǎn)運(GO：0006810)；細胞組成部位為膜結(jié)構(gòu)(GO：0016020)；分子生物學功能為轉(zhuǎn)運活性(GO:0005215)。說明甘草NRAMP是存在于膜上的具有轉(zhuǎn)運功能的跨膜蛋白質(zhì)。

為更好地了解NRAMP家族蛋白質(zhì)成員的結(jié)構(gòu)，用MEME在線工具對甘草NRAMP家族蛋白質(zhì)進行保守基序分析，設(shè)置基序個數(shù)為20，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，親緣關(guān)系較近的成員之間具有相似的基序，暗示它們的功能也更為接近。這些基序中有些保守性強，比如基序3，存在于每個成員中。有些基序只在某些亞家族中比較保守，比如基序16只在亞家族 Ⅰ 中存在，基序20只在亞家族 Ⅱ 中存在，這些基序在這些亞家族中可能發(fā)揮不同的功能。有些基序只有個別成員沒有，比如基序4、5存在于除GurNRAMP11外的所有成員中。GurNRAMP11由于序列較短，并且與其他家族成員之間的親緣關(guān)系較遠，其基序組成差異較大，且數(shù)目少，僅有5個基序。

圖3 NRAMP基因在甘草染色體上的分布Fig.3 Distribution of the NRAMP genes on chromosomes in Glycyrrhiza uralensis

圖4 甘草NRAMP家族的Nramp結(jié)構(gòu)域Fig.4 Nramp structural domain of NRAMP family members in Glycyrrhiza uralensis

圖5 NRAMP家族蛋白在甘草中的保守基序分析Fig.5 Conserved motif analysis of NRAMP family proteins in Glycyrrhiza uralensis

2.5 甘草NRAMP家族蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系密切。為更深入地了解甘草NRAMP家族的特性，利用SOPMA對甘草NRAMP蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測(表2)，結(jié)果顯示，大部分NRAMP蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋，其次是無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角的比例最小。分子質(zhì)量最大的2個成員GurNRAMP7和GurNRAMP8的無規(guī)則卷曲比α-螺旋的比例更高，說明這2個成員中的冗余氨基酸并沒有形成實質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

表2 甘草NRAMP家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要構(gòu)成組件比例

三級結(jié)構(gòu)對于蛋白質(zhì)功能很重要，通過預測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)可以更好地理解其功能。利用SWISS-MODEL構(gòu)建甘草NRAMP家族蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，GurNRAMP1、GurNRAMP2、GurNRAMP3、GurNRAMP4、GurNRAMP7和GurNRAMP8的三維結(jié)構(gòu)最復雜，α-螺旋結(jié)構(gòu)的數(shù)量最多，其次是GurNRAMP5和GurNRAMP6，這2個成員的三維結(jié)構(gòu)較為復雜，擁有較多的α-螺旋結(jié)構(gòu)，GurNRAMP9、GurNRAMP10和GurNRAMP11的三維結(jié)構(gòu)最為簡單，含有的α-螺旋結(jié)構(gòu)的數(shù)量最少。這些成員的結(jié)構(gòu)特征和它們的跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)(表1)有很好的對應(yīng)關(guān)系，α-螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)量多的成員跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)相對也多。

利用PROCHECK程序在線預測蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，結(jié)果如表3所示，GurNRAMP10的氨基酸殘基位于最佳區(qū)的比例略微小于90%，但是分布在最佳區(qū)和次允許區(qū)的比例遠超過90%，其他家族成員分布在最佳區(qū)的比例也都超過90%，表明甘草NRAMP蛋白的空間構(gòu)象是合理且穩(wěn)定的。甘草NRAMP蛋白所有成員的G-factors值均大于-0.5，說明它們的結(jié)構(gòu)預測在正常范圍。

圖6 甘草NRAMP家族蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)Fig.6 Tertiary structures of NRAMP family proteins in Glycyrrhiza uralensis

蛋白質(zhì)名稱Protein name最佳區(qū)比例/%Core regions次允許區(qū)比例/%Allowed regions一般允許區(qū)比例/%Generously allowed regions不允許區(qū)比例/%Disallowed regionsG-factorsGurNRAMP194.74.80.30.30.01GurNRAMP294.24.61.00.3-0.02GurNRAMP394.94.60.30.30.02GurNRAMP493.75.60.80-0.03GurNRAMP593.66.10.30-0.04GurNRAMP692.95.80.90.3-0.11GurNRAMP793.26.30.30.3-0.08GurNRAMP891.68.20.30-0.17GurNRAMP990.37.70.51.4-0.02GurNRAMP1089.79.00.90.4-0.23GurNRAMP1196.92.40.80-0.06

注：G-factors<-0.5為罕見結(jié)構(gòu); G-factors<-1.0為十分罕見。

Note：G-factors<-0.5 unusual; G-factors<-1.0 highly unusual.

3 結(jié)論與討論

我國中藥材資源豐富，品種齊全，但中藥材的安全問題給中醫(yī)藥的發(fā)展帶來了困擾，其中重金屬污染問題尤為嚴重。甘草作為一種重要的中藥材，不但應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，還在食品、煙草、化妝品、環(huán)境保護等方面發(fā)揮重要作用。為了提高甘草質(zhì)量，降低重金屬污染，了解重金屬的轉(zhuǎn)運機制非常必要。NRAMP是一類整合轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)家族，在重金屬的轉(zhuǎn)運和重新利用中發(fā)揮決定性作用[17]。通過對NRAMP基因家族進行分析，可以了解各個成員的特性，明確其功能，為阻斷有害重金屬的轉(zhuǎn)運提供思路。

本研究從甘草全基因組序列中鑒定出11個NRAMP基因家族成員，通過對11個成員的進化分析和在染色體上的定位分析發(fā)現(xiàn)，片段復制是這些成員經(jīng)歷的主要復制事件，也存在串聯(lián)復制的現(xiàn)象。通過將GurNRAMP家族成員與模式植物擬南芥中的AtNRAMP家族成員進行進化分析發(fā)現(xiàn)，GurNRAMP7、GurNRAMP8、GurNRAMP11這3個成員比較特殊，它們與AtNRAMP的親緣關(guān)系較遠，單獨形成一個分支，并且它們的亞細胞定位和蛋白質(zhì)大小也與其他成員差別較大，推測也許會發(fā)揮一些特殊的功能。為了解甘草和其他植物中NRAMP基因家族的起源，對甘草與幾種雙子葉植物和單子葉植物構(gòu)建種間進化樹發(fā)現(xiàn)，NRAMP基因產(chǎn)生于單子葉植物和雙子葉植物分離之前，且甘草與大豆間的親緣關(guān)系比其他物種更為接近。為更好地了解GurNRAMP蛋白成員間的關(guān)系和功能，分析各個成員的保守結(jié)構(gòu)域與保守基序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有成員都具有Nramp結(jié)構(gòu)域，故均應(yīng)具備跨膜轉(zhuǎn)運的功能。通過對保守基序進行分析發(fā)現(xiàn)，各個亞家族內(nèi)部成員的組成相似，而亞家族之間的差異較大，預示不同亞家族在功能上可能存在差異。為更好地了解每個蛋白質(zhì)成員的結(jié)構(gòu)，對甘草NRAMP家族蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)進行分析。α-螺旋是甘草NRAMP家族成員中最主要的結(jié)構(gòu)，也是蛋白質(zhì)跨膜的重要結(jié)構(gòu)，在甘草NRAMP家族蛋白質(zhì)中，α-螺旋數(shù)量和跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)量有一定的相關(guān)性。GurNRAMP1、GurNRAMP2、GurNRAMP3和GurNRAMP4蛋白的分子質(zhì)量大小相似，三維結(jié)構(gòu)和α-螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)量都很相似；GurNRAMP7和GurNRAMP8的氨基酸數(shù)量比其他成員多很多，雖然α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例最低，但α-螺旋的數(shù)量和上面4個成員相似，多出的氨基酸在二級結(jié)構(gòu)上主要表現(xiàn)為無規(guī)則卷曲；GurNRAMP5、GurNRAMP6這2個成員的氨基酸數(shù)量分別為472、414個，比前4個成員的氨基酸數(shù)量少，因此三維結(jié)構(gòu)相對簡單些，α-螺旋結(jié)構(gòu)也稍有減少；GurNRAMP9、GurNRAMP10和GurNRAMP11的氨基酸數(shù)量最少，所含的跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)量也最少，其轉(zhuǎn)運功能或許會有所不同。