姜黃素對(duì)慢性應(yīng)激大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

鄧 莉 耿春梅 廖德華 江 沛 韓文秀

1.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院健康管理部，山東濟(jì)寧 272002；2.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，山東濟(jì)寧 272002；3.湖南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，湖南長(zhǎng)沙 410006

抑郁癥是一種以顯著而持久的情緒低落、興趣喪失為主要臨床特征的心理障礙疾病。近年來(lái)，抑郁癥發(fā)病率逐年攀升，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。根據(jù)2012 年世界衛(wèi)生組織報(bào)告，預(yù)計(jì)到2020 年抑郁癥將成為人類(lèi)第二大致殘?jiān)颍瑑H次于心血管疾?。?］。研究表明，慢性應(yīng)激可調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌，改變神經(jīng)可塑性及神經(jīng)凋亡，影響機(jī)體的整體穩(wěn)態(tài)機(jī)制，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁的發(fā)生［2-3］。臨床廣泛應(yīng)用的抗抑郁藥主要包括三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥、單胺氧化酶抑制劑、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑等。然而其高昂的費(fèi)用、不可忽視的副作用及滯后的藥效，使新型抗抑郁藥的研發(fā)需求不斷升高。近年來(lái)，傳統(tǒng)中藥受到人們的重視。作為姜科姜黃屬植物根莖的天然有效成分，姜黃素具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)作用［4-6］。此外，姜黃素還能逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激引起的大鼠行為、記憶及認(rèn)知的改變［7-8］，提示其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的潛在調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)采用慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激（CUMS）模型，探討姜黃素對(duì)慢性應(yīng)激大鼠的中樞神經(jīng)保護(hù)作用，為預(yù)防和早期治療慢性應(yīng)激損傷及新型抗抑郁藥的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD 大鼠24 只，2 月齡，體重180～220 g，由湖南省腫瘤醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2018-0003，合格證號(hào)：44002700 004389。動(dòng)物飼養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均遵循國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》執(zhí)行，并獲得了濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑

姜黃素（美國(guó)Sigma 公司，生產(chǎn)批號(hào)：2142805）；大鼠皮質(zhì)酮酶聯(lián)免疫試劑盒（美國(guó)Cayman 公司，生產(chǎn)批號(hào)：01501320）；BDNF 抗體（美國(guó)Abcam 公司，生產(chǎn)批號(hào)：GR42954-2）；PSD-95 抗體（美國(guó)Proteintech公司，生產(chǎn)批號(hào)：00025154）；SYN 抗體（美國(guó)Proteintech 公司，生產(chǎn)批號(hào)：00049214）；β-actin 抗體（美國(guó)Proteintech 公司，生產(chǎn)批號(hào)：00045582）；細(xì)胞凋亡Tunel 原位檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：KGA702-A）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組、造模、給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將24 只SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組，每組8 只。CUMS 抑郁模型構(gòu)建參照文獻(xiàn)［9］，包括潮濕墊料（24 h）、45°傾斜籠具（24 h）、夾尾（1 min）、禁食（24 h）、禁水（24 h）、束縛在空水瓶中（4 h）、晝夜顛倒（12 h/12 h）。1 周內(nèi)每日給予一種不同的應(yīng)激，共持續(xù)4 周。治療組造模同時(shí)每日以100 mg/kg 姜黃素溶液（懸浮于0.5%吐溫80）灌胃，對(duì)照組和模型組每日以等量生理鹽水灌胃。采用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選CUMS 造模成功的大鼠，以糖水偏好性顯著下降、不動(dòng)時(shí)間顯著增加為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)［10］，大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，籠具兩側(cè)各放置1 瓶1%的糖水適應(yīng)48 h。隨后禁水14 h，于籠具兩側(cè)放置預(yù)先稱(chēng)重的清水和1%糖水各1 瓶供其自由選擇。1 h 后再次稱(chēng)重，記錄1%糖水和清水消耗量。蔗糖偏好（%）=糖水消耗量/（糖水消耗量+清水消耗量）×100%。

1.3.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)［11］，將大鼠放入高45 cm、直徑25 cm、水深35 cm、水溫24℃的塑料圓筒中。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)性游泳15 min，正式實(shí)驗(yàn)時(shí)適應(yīng)1 min，記錄5 min 內(nèi)大鼠的不動(dòng)時(shí)間。

1.3.4 血清皮質(zhì)酮水平檢測(cè) 24 只大鼠均于早上8:00～9:00 采集靜脈血，4℃，3500 g 離心15 min 分離血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）測(cè)定血清皮質(zhì)酮水平。

1.3.5 Western blot 分析蛋白表達(dá) 大鼠行為學(xué)測(cè)試后立即處死并置于冰上，分離海馬，研磨后提取總蛋白，采用Bradford 法進(jìn)行蛋白定量。取10 μg 蛋白樣品，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜后，封閉1 h，4℃孵育過(guò)夜?？贵w濃度：BDNF（1：2000）、PSD-95（1：2000）、SYN（1：1000）、β-actin（1：4000）。TBST 洗膜后二抗孵育1 h，進(jìn)行ECL 化學(xué)發(fā)光，使用Image J 軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 Tunel 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取大鼠腦組織在含4%多聚甲醛中固定后石蠟包埋，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)切片、脫蠟、細(xì)胞凋亡染色后置于熒光顯微鏡下觀(guān)察，棕褐色為T(mén)unel 染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞。隨機(jī)選取切片5 張，每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值計(jì)算凋亡率。凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/（正常細(xì)胞數(shù)+凋亡細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)大鼠行為學(xué)的影響

模型組大鼠糖水偏好度顯著低于對(duì)照組，治療組大鼠糖水偏好度顯著高于模型組（P＜0.01）；模型組大鼠不動(dòng)時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組，治療組大鼠不動(dòng)時(shí)間顯著短于模型組（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 姜黃素對(duì)大鼠行為學(xué)的影響

2.2 姜黃素對(duì)大鼠血清皮質(zhì)酮水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清皮質(zhì)酮水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，治療組大鼠血清皮質(zhì)酮水平顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 姜黃素對(duì)大鼠血清皮質(zhì)酮水平的影響

2.3 姜黃素對(duì)神經(jīng)突觸可塑性的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬BDNF、PSD-95、SYN 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，治療組大鼠海馬BDNF、PSD-95、SYN 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

2.4 姜黃素對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

圖3 姜黃素對(duì)神經(jīng)突觸可塑性的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠組織切片中凋亡陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯增加，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，治療組大鼠組織切片中凋亡陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

3 討論

應(yīng)激是抑郁癥重要誘發(fā)因素，長(zhǎng)期慢性應(yīng)激能夠激活HPA 軸，引起體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌功能的紊亂［12］。此外，應(yīng)激參與神經(jīng)可塑性下降的調(diào)節(jié)，加速神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致抑郁樣行為的產(chǎn)生。CUMS 抑郁模型以不同的輕度刺激因子長(zhǎng)期刺激動(dòng)物，模擬人類(lèi)處于慢性低水平應(yīng)激下導(dǎo)致的抑郁癥。該模型與抑郁癥患者的臨床表現(xiàn)有一定相似性，被廣泛應(yīng)用于抗抑郁藥物的活性篩選和發(fā)病機(jī)制的探討。

多項(xiàng)研究表明，姜黃素參與調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)和情緒調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性和細(xì)胞凋亡的作用，有很強(qiáng)的抗抑郁潛力［13-15］。此外，臨床試驗(yàn)證實(shí)，姜黃素能夠改善抑郁癥患者的抑郁癥狀［16-19］。在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建CUMS 經(jīng)典抑郁模型，進(jìn)一步驗(yàn)證姜黃素的抗抑郁作用及相關(guān)機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，姜黃素治療后大鼠的糖水偏好度升高，不動(dòng)時(shí)間縮短，CUMS 誘導(dǎo)的大鼠抑郁樣行為得到緩解，證明了姜黃素的抗抑郁作用。長(zhǎng)期應(yīng)激導(dǎo)致HPA 軸過(guò)度激活，作為應(yīng)激指標(biāo)，皮質(zhì)酮水平被廣泛應(yīng)用于應(yīng)激狀態(tài)的評(píng)估［20-21］。本研究結(jié)果提示，姜黃素能夠緩解CUMS 誘導(dǎo)的皮質(zhì)酮水平升高，這可能與其調(diào)節(jié)HPA 軸神經(jīng)活性有關(guān)。此外，姜黃素通過(guò)參與調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性和細(xì)胞存活的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，在不同動(dòng)物模型中表現(xiàn)出保護(hù)和逆轉(zhuǎn)認(rèn)知損傷的作用［22-23］。在創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型中，姜黃素能調(diào)節(jié)BDNF、cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白等相關(guān)蛋白在海馬中的表達(dá)，減輕大鼠的氧化損傷，使認(rèn)知功能恢復(fù)正常［24-26］。本研究結(jié)果顯示，姜黃素能夠顯著提高海馬BDNF、PSD-95、SYN 的蛋白表達(dá)水平，改善大鼠神經(jīng)突觸可塑性。同時(shí)還能降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率，改善細(xì)胞的存活，起到抗抑郁效果。總之，本研究提示姜黃素可能通過(guò)調(diào)節(jié)HPA 軸降低血清皮質(zhì)酮水平，改善神經(jīng)突觸可塑性及細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗抑郁效果。