MicroRNA-452和microRNA-5100在NSCLC組織中的表達及其臨床意義

程鵬

（南陽醫(yī)學高等?？茖W校第一附屬醫(yī)院 腫瘤內科，河南 南陽 473000）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌最常見的病理亞型[1]。NSCLC患者預后差，尋找能夠預測患者預后的生物靶標，對提高NSCLC早期診斷率、改善患者預后有積極意義[2]。目前發(fā)現多個microRNA（miRNA）分子可作為NSCLC病情進展和預后評估的可靠預測分子[3-4]。近年來，microRNA-452（miR-452）和 microRNA-5100（miR-5100）成為miRNA研究領域的熱點，而關于miR-452和miR-5100在NSCLC中的表達及對患者病情判斷、預后的預測作用，國內尚無報道[5-6]。本研究旨在檢測NSCLC癌組織中miR-452和miR-5100的表達水平，分析其在患者病情判斷、預后預測中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月—2012年12月南陽醫(yī)學高等?？茖W校第一附屬醫(yī)院收治的94例NSCLC患者的癌組織和距離癌組織＞5 cm的癌旁正常組織，手術過程中取出組織樣本后，立即置于液氮中保存。納入標準：術前未接受抗腫瘤治療；術后經病理證實為NSCLC；具備完整的病歷資料。排除標準：術前接受抗腫瘤治療；合并其他惡性腫瘤；合并肺炎、肺結核等其他肺部疾病。以手術時間為起點，采用門診或電話隨訪的方式，對患者進行1～60個月的隨訪，直至隨訪時間結束或患者死亡。本研究經本院倫理委員會審核批準。

1.2 實時聚合酶鏈反應

取出液氮保存的組織樣本，切取適量組織，采用 Trizol試劑提取總RNA，TaqMan miRNA 試 劑盒進行逆轉錄，產物置于-80℃冰箱保存。采用miScript Reverse Transcription 試劑盒和 miScript SYBR Green PCR試劑盒進行實時聚合酶鏈反應（realtime polymerase chain reaction, real-time PCR）。反應條件：95℃預變性 10 min，95℃變性 15 s，60℃退火 1 min，共 45個循 環(huán)。miR-452正向引物：5’-GCGCAACTGTTTGCAGAG-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-5100正 向 引 物：5’-TGGCTCTGCCTTTATTCCCTAGT-3’，反向引物：5’-AAATAAGGTGCTTTGGGAATCTGT-3’；U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。以U6為內參，用2-ΔΔCt法計算miR-452和miR-5100的相對表達量。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC癌組織中miR-452和miR-5100的表達情況

NSCLC癌組織中miR-452和miR-5100相對表達量分別為（0.26±0.11）和（3.25±0.79），癌旁正常組織中miR-452和miR-5100相對表達量分別為（1.15±0.21）和（1.09±0.18），兩者miR-452相對表達量比較，差異有統計學意義（t=36.399，P=0.000），NSCLC癌組織低于癌旁正常組織；兩者miR-5100相對表達量比較，差異有統計學意義（t=-25.846，P=0.000），NSCLC癌組織高于癌旁正常組織。

2.2 miR-452、miR-5100表達水平與NSCLC患者臨床病理特征的關系

NSCLC患者miR-452高表達49例。miR-452高表達與患者年齡、性別、是否吸煙、是否遠處轉移及TNM分期無相關性（P＞0.05），而與腫瘤病理類型、分化程度、腫瘤大小及淋巴結轉移有相關性（P＜0.05）。見附表。

NSCLC患者miR-5100高表達47例。miR-5100高表達與患者年齡、性別、是否吸煙、腫瘤病理類型、腫瘤大小、淋巴結轉移和遠處轉移無相關性（P＞0.05），而與腫瘤分化程度、TNM分期有相關性（P＜0.05）。見附表。

附表 不同影響因素下miR-452和miR-5100的高表達率比較

2.3 NSCLC癌組織中miR-452和miR-5100表達水平對患者預后的影響

NSCLC患者中miR-452高表達49例，低表達45例。miR-452高表達組患者的術后5年總生存率為51.02%（25/49），低表達組為22.22%（10/45），經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=8.324，P=0.004）。miR-452高表達組患者的術后中位生存時間為43.00個月，低表達組為36.00個月，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=7.318，P=0.007）。見圖 1。

miR-5100高表達患者47例，低表達47例。miR-5100高表達組患者的術后5年總生存率為23.40%（11/47），低表達組為51.06%（24/47），經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=7.693，P=0.006）。miR-5100高表達組患者的術后中位生存時間為36.00個月，低表達組為43.00個月，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=8.174，P=0.004）。見圖2。

圖1 NSCLC患者miR-452表達的Kaplan-Meier生存曲線

圖2 NSCLC患者miR-5100表達的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

肺癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因共同作用的過程。目前，大量研究致力于探究miRNA在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的功能作用，let-7家族成員均與肺癌患者預后相關[7-8]。

miRNA通過特異性結合至信使RNA（mRNA）的3’-非翻譯區(qū)，誘導mRNA降解或抑制翻譯，進而調控基因表達，miRNA通過調節(jié)促癌基因或抑癌基因的表達，進而發(fā)揮功能[9-10]。研究證實，miR-452在惡性腫瘤中既可發(fā)揮促癌基因功能又具有抑癌基因功能，如在乳腺癌中，miR-452表達升高，而在食管癌中，miR-452表達降低[11-12]。本研究發(fā)現，與癌旁正常組織相比，miR-452在NSCLC癌組織中表達降低，與HE等[13]研究結果一致。由此推測，miR-452低表達在NSCLC腫瘤形成過程中發(fā)揮促進作用，miR-452在NSCLC中發(fā)揮抑癌基因功能。有研究發(fā)現，miR-452低表達與腦膠質瘤的臨床分期和患者預后緊密相關[14]。本研究結果發(fā)現，miR-452高表達與腫瘤病理類型、分化程度、腫瘤大小及淋巴結轉移有關，即腫瘤分化程度越高，miR-452表達水平越高，腫瘤直徑越大、存在淋巴結轉移，miR-452表達水平越低，提示miR-452低表達可能抑制腫瘤細胞分化，促進腫瘤細胞增殖及上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）過程。KRISTENSEN等[15]在前列腺癌細胞中的研究發(fā)現，miR-452可通過調節(jié)與細胞周期、細胞黏附或細胞能動性相關的信號通路活性，抑制細胞增殖、侵襲遷移，有研究證實，miR-452能抑制NSCLC細胞增殖和侵襲[16]。后續(xù)研究中，筆者將對miR-452影響NSCLC細胞分化、增殖及侵襲遷移的內在機制進行深入探究。

CHIJIIWA等[17]發(fā)現，在胰腺癌細胞中，外源性增加miR-5100表達可抑制細胞增殖和侵襲遷移；HUANG等[18]研究結果揭示，miR-5100在肺癌組織和肺癌細胞株中表達增加，且miR-5100具有促進細胞增殖的功能，由此推測，miR-5100可同時兼具促癌基因和抑癌基因的功能。本研究中real-time PCR結果顯示，miR-5100在NSCLC癌組織中表達增加，提示其可能參與并促進NSCLC腫瘤形成，具有促癌基因功能。此外，本研究發(fā)現，在腫瘤分化程度低的NSCLC癌組織中，miR-5100表達水平較高，而miR-5100高表達與TNM分期有關，由此推測，miR-5100可抑制腫瘤細胞分化、誘導腫瘤惡性進展。LI等[19]研究發(fā)現，在肺上皮細胞中，miR-5100可激活Smad2/3，促進細胞發(fā)生EMT，目前關于miR-5100在NSCLC中的作用機制研究甚少。后續(xù)研究中，筆者將在體外細胞水平，通過改變miR-5100表達量，探究其在NSCLC中的具體作用機制。

Kaplan-Meier生存分析發(fā)現，在NSCLC癌組織中，miR-452低表達、miR-5100高表達，均預示患者較低的術后5年總生存率和較短的中位生存時間，miR-452和miR-5100可作為預測NSCLC患者預后的生物靶分子。

綜上所述，本研究發(fā)現在NSCLC癌組織中，miR-452呈低表達、miR-5100呈高表達，且均與患者較差的臨床病理特征和不良預后相關。miR-452和miR-5100可作為NSCLC患者病情進展評估、預后和治療靶標的候選分子。