鹽膚木根的化學成分及抗氧化活性研究

吳獻，徐章文，謝麗歡，葉淼,3*，徐偉,3*

(1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福州海王金象中藥制藥有限公司，福建 福州 350014；3.福建省中藥資源研究與開發(fā)利用重點實驗室，福建 福州 350122)

近15年來，冠心病(coronary heart disease,CHD)一直都是全球威脅人類健康的頭號殺手。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)最新報告，至2015年，冠心病和中風導致了全球范圍內(nèi)1 500萬例死亡，占總死亡人數(shù)的26.6%[1]。在我國，心腦血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的患病率和死亡率均居首位。其中，冠心病患者人數(shù)1 100萬，死亡率約為110/10萬[2]。鹽膚木(RhuschinensisMill.)系漆樹科(Anacardiaceae)鹽膚木屬(Rhus)落葉小喬木。在我國，除東北、內(nèi)蒙古和新疆外，其余地區(qū)均有分布[3]。據(jù)《開寶本草》記載，鹽膚木樹白皮主破血止血，其根莖能活血化瘀。福建省人民醫(yī)院制藥廠研制了以鹽膚木為原料的單味制劑——舒冠通糖漿(國藥準字Z35020635)，經(jīng)全國十多個單位交叉驗證，共治療冠心病346例，治療冠心病療效確鑿[4]，然其藥效物質(zhì)基礎尚不明確。迄今為止，鹽膚木根的化學成分研究鮮有報道，僅發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物[5]，而鹽膚木其他部位(莖、葉、果實、五倍子)的化學成分研究表明，該植物主要含有黃酮[5-7]、酚酸[6-10]、鞣質(zhì)[7]、脂肪酸[8]、三萜[6-7，9]這5種類型化合物。其中黃酮、酚酸及鞣質(zhì)顯示了一定的抗氧化、抑制胰脂肪酶[7,10]及抗炎活性[7,11]。本試驗為了進一步研究鹽膚木抗冠心病的有效成分，探討其抗冠心病藥效物質(zhì)基礎，對其進行了化學成分研究。按照生產(chǎn)工藝，對鹽膚木根進行水提醇沉，得到鹽膚木浸膏，采用色譜技術對其進行分離純化，從中分離鑒定了20個化合物，分別鑒定為1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖(pentagalloylglucose，1)、1,2,3,6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(teragalloylglucose，2)、沒食子酸(gallic acid，3)、沒食子酸甲酯(methyl gallate，4)、沒食子酸乙酯(ethyl gallate，5)、鞣花酸(ellagic acid，6)、原兒茶醛(protocatechuic aldehyde，7)、原兒茶酸(protocatechuic acid，8)、苔黑酚葡萄糖苷(orcinol glucoside，9)、對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid，10)、鹽膚木內(nèi)酯A(rhuscholide A，11)、蘆丁(rutin，12)、漆黃素(fisetin，13)、山柰酚(kaempferol，14)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(kaemferol-3-O-β-D-rutinoside，15)、紫鉚亭(butin，16)、二氫漆黃素(fustin，17)、(+)-兒茶素[(+)-catechin，18]、根皮素(phloretin，19)、根皮苷(phloridzin，20)。其中有6個化合物(2、7、10、15、16、18)系首次從鹽膚木中分離。另外，采用改進的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法對鹽膚木中分離所得單體進行抗氧化活性測試，研究表明除苔黑酚葡萄糖苷(9)、對羥基苯甲酸(10)、鹽膚木內(nèi)酯A(11)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(15)以及根皮苷(20)以外，其他化合物與DPPH反應均具有良好的的線性關系，并且呈現(xiàn)出較好的抗氧化活性，尤其是化合物1～7、12～14的抗氧化活性優(yōu)于陽性對照維生素C，提示抗氧化損傷可能是舒冠通糖漿抗冠心病的機理之一。

1 儀器與試藥

柱色譜硅膠(100～200、200～300目，青島海洋化工廠)；SP825L大孔樹脂(日本三菱公司)；ODS(50 μm，美國Welch公司)；Waters AutoPurification自動純化系統(tǒng)；XBridge Prep C18色譜柱(19 mm×150 mm，5 μm)；Bruker Avance 400/500/600型超導核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；micrOTOF高分辨率飛行時間質(zhì)譜儀(德國Bruker公司)；DPPH(美國Sigma公司)；維生素C對照品(中國食品藥品檢定研究院)；乙腈、甲醇為色譜純(德國Merck公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)，其余試劑均為分析純。

鹽膚木采自福建福州，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥用植物實驗室范世明高級實驗師鑒定為漆樹科鹽膚木(R.chinensisMill.)的干燥根，其標本(編號：YFM20151003)存放于福建中醫(yī)藥大學生物醫(yī)藥研發(fā)中心標本室。

2 提取與分離

取鹽膚木粗粉10.05 kg，加入10倍量水，回流提取兩次，每次1.5 h，合并兩次濾液，濃縮至2.02 g生藥/mL，加入3倍量乙醇醇沉，放入4 ℃冰箱冷藏24 h后取出抽濾，得上清液，濃縮得浸膏438.51 g。取浸膏100.08 g，用500 mL熱水分散，采用石油醚萃取，得到石油醚層浸膏9.84 g，剩余水層采用SP825L大孔樹脂(60 cm×5.5 cm)粗分，上樣后，分別用水(含1%甲酸)和95%乙醇梯度洗脫，各洗脫5 L，收集95%乙醇洗脫部位濃縮得浸膏65.21 g。石油醚部位(9.84 g)經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-丙酮(20∶1→1∶1)梯度洗脫，每500 mL收集1份。其中第9～13號收集液合并，經(jīng)過ODS柱(甲醇/水，9∶1)分離得到化合物11(35.05 mg)；95%乙醇洗脫部位(65.21 g)經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇梯度(40∶1→1∶1)洗脫，薄層色譜(TLC)檢識，合并得到5個餾分(Fr.1～5)。Fr.1經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫(40∶1→20∶1)，再經(jīng)ODS柱(甲醇/水梯度洗脫)得化合物14(9.08 mg)和13(18.07 mg)。Fr.2經(jīng)反復ODS色譜和純化系統(tǒng)制備(乙腈-0.1%甲酸梯度洗脫)得化合物19(29.09 mg)、16(18.11 mg)、17(17.03 mg)、1(124.04 mg)和6(48.06 mg)。Fr.3經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(25∶1→1∶1)梯度洗脫，再經(jīng)反復ODS柱色譜(甲醇/水梯度洗脫)得到化合物2(16.06 mg)、20(88.11 mg)、15(11.01 mg)、12(14.03 mg)、5(46.08 mg)和4(252.14 mg)；Fr.4經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(20∶1→1∶2)梯度洗脫，再經(jīng)反復ODS柱色譜(甲醇-水梯度洗脫)得化合物18(28.07 mg)、7(16.02 mg)和9(95.07 mg)；Fr.5經(jīng)反復ODS柱色譜得化合物10(13.01 mg)、8(17.04 mg)和3(185.13 mg)。

3 結構鑒定

3.1 化合物1 白色粉末，HR-ESI-MSm/z:939.109 4[M-H]-,(calcd.for C41H32O26940.118 2)。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.12,7.06,6.99,6.96,6.91 (each 2H,s,galloyl H-2,6);glc:6.24 (1H,d,J=8.32 Hz,H-1),5.90 (1H,dd,J=9.60,9.52 Hz,H-3),5.62 (1H,t,J=9.72 Hz,H-4),5.59 (1H,dd,J=9.80,8.35 Hz,H-2),4.52-4.40 (2H,m,H-6),3.78 (1H,m,H-5);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ:galloyl:167.69,167.46,167.12,166.93,166.42 (C-7),146.75,146.64,146.51,146.42 (C-3,5),121.19,120.51,120.42,120.10 (C-1),110.79,110.69,110.43,110.07 (C-2,6);glc:93.81 (C-1′),72.24 (C-2′),73.90 (C-3′),69.23 (C-4′),74.12 (C-5′),63.41 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道的1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖基本一致，故化合物1鑒定為1,2,3,4,6-五-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(pentagalloylglucose)。

3.2 化合物2 白色粉末，HR-ESI-MSm/z:789.115 0[M+H]+,(calcd.for C34H28O22788.107 2)。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.10,6.99,6.97,6.92 (each 2H,s,galloyl H-2,6),glc:6.22 (1H,d,J=8.32 Hz,H-1),5.69 (1H,J=9.65 Hz,H-3),5.37 (1H,dd,J=9.80,8.35 Hz,H-2),4.41 (2H,dd,J=12.32,4.20 Hz,H-6),4.22 (1H,m,H-5),4.02 (1H,s,H-4);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ:galloyl:169.22,168.01,167.35,166.99 (C-7),147.05,146.55,146.04,145.89 (C-3,5),141.31,140.27,140.00,139.57 (C-4),121.26,120.89,120.28,120.02 (C-1),111.13,110.03,109.34,109.29 (C-2,6);glc:93.38 (C-1′),71.66 (C-2′),74.12 (C-3′),69.34 (C-4′),75.92 (C-5′),63.57 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道的1,2,3,6-四-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖基本一致，故化合物2鑒定為1,2,3,6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(teragalloylglucose)。

3.3 化合物3 白色針狀結晶(甲醇)，HR-ESI-MSm/z:169.014 4[M-H]-,(calcd.for C7H6O5170.021 5)。1H-NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.08 (2H,s,H-2,6);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ:120.55 (C-1),108.93 (C-2,6),144.99 (C-3,5),138.21 (C-4),169.03 (-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道的沒食子酸基本一致，故化合物3鑒定為沒食子酸(gallic acid)。

3.4 化合物4 白色針狀結晶(甲醇)，HR-ESI-MSm/z:183.029 9[M-H]-,(calcd.for C8H8O5184.037 2)。1H-NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.03 (2H,s,H-2,6),3.80 (3H,s,-OCH3);13C-NMR (CD3OD,125 MHz)δ:121.38 (C-1),109.98 (C-2,6),146.48 (C-3,5),139.74 (C-4),169.01 (C-7),52.28 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道的沒食子酸甲酯基本一致，故化合物4鑒定為沒食子酸甲酯(methyl gallate)。

3.5 化合物5 白色針狀結晶(甲醇)，HR-ESI-MSm/z:197.045 5[M-H]-,(calcd.for C9H10O5198.052 8)。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz)δ:6.96 (2H,s,H-2,6),4.20 (2H,q,J=7.08 Hz,H-8),1.26 (3H,t,J=7.08 Hz,H-9);13C-NMR (DMSO-d6，100 MHz)δ:120.06 (C-1),108.93 (C-2,6),145.94 (C-3,5),138.78 (C-4),166.38 (C-7),60.57 (C-8),14.68 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道的沒食子酸乙酯基本一致，故化合物5鑒定為沒食子酸乙酯(ethyl gallate)。

3.6 化合物6 淡黃色粉末，HR-ESI-MSm/z:300.996 9[M-H]-,(calcd.for C14H6O8302.006 3)。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz)δ:7.46 (2H,s,H-5,5′);13C-NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ:112.88 (C-1,1′),136.76 (C-2,2′),140.99 (C-3,3′),148.76 (C-4,4′),109.87 (C-5,5′),106.93 (C-6,6′),159.75 (C-7,7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道的鞣花酸基本一致，故化合物6鑒定為鞣花酸(ellagic acid)。

3.7 化合物7 灰白色粉末，HR-ESI-MSm/z:137.023 7[M-H]-,(calcd.for C7H6O3138.031 7)。1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:9.70 (1H,s,-CHO),7.27 (1H,dd,J=8.04,2.00 Hz,H-6),7.24 (1H,d,J=1.96,H-2),6.91 (1H,d,J=8.00 Hz,H-5);13C-NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ:129.31 (C-1),114.80 (C-2),146.35 (C-3),152.59 (C-4),115.98 (C-5),124.98 (C-6),191.55 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道的原兒茶醛基本一致，故化合物7鑒定為原兒茶醛(protocatechuic aldehyde)。

3.8 化合物8 白色粉末，HR-ESI-MSm/z:153.018 0[M-H]-(calcd.for C7H6O4154.026 6)。1H-NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.41 (1H,brs,H-2),7.38 (1H,dd,J=8.84,2.08 Hz,H-6),6.77 (1H,d,J=7.64 Hz,H-5);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ:123.09 (C-1),117.70 (C-2),146.05 (C-3),151.52 (C-4),115.74 (C-5),123.88 (C-6),170.24 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的原兒茶酸基本一致，故化合物8鑒定為原兒茶酸(protocatechuic acid)。

3.9 化合物9 無色針晶(甲醇)，HR-ESI-MSm/z:285.105 3[M-H]-,(calcd.for C13H18O7286.105 3)。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz)δ:6.29 (1H,brs,H-2),6.24 (1H,d,J=2.55 Hz,H-4),6.23 (1H,brs,H-6),4.74 (1H,d,J=7.60 Hz,H-1′),3.69 (1H,dd,J=11.44,2.36 Hz,H-6a),3.48 (1H,dd,J= 11.68,5.80 Hz,H-6b),3.30～3.15 (4H,overlapped,H-2～H-5),2.17 (3H,s,H-7);13C-NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ:159.01 (C-1),101.31 (C-2),158.54 (C-3),108.28(C-4),139.70 (C-5),110.15 (C-6),21.78 (C-7),101.31 (C-1′),73.69 (C-2′),77.44 (C-3′),70.06 (C-4′),77.05 (C-5′),61.08 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道的苔黑酚葡萄糖苷基本一致，故化合物9鑒定為苔黑酚葡萄糖苷(orcinol glucoside)。

3.10 化合物10 白色粉末，HR-ESI-MSm/z:137.023 5[M-H]-,(calcd.for C7H6O3138.031 7)。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.87 (2H,d,J=8.84 Hz,H-2,6),6.81 (2H,d,J= 8.84 Hz,H-3,5);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ:122.65 (C-1),133.00 (C-2,6),116.02 (C-3,5),163.35 (C-4),170.04 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的對羥基苯甲酸基本一致，故化合物10鑒定為對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)。

3.11 化合物11 淡黃色粉末，HR-ESI-MSm/z:463.320 7[M+H]+,(calcd.for C31H42O3462.313 4)。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ:6.89 (1H,d,J=2.40 Hz,H-3),6.59 (1H,d,J=2.40 Hz,H-5),5.30 (1H,t,J=1.20 Hz,H-8),5.10 (3H,overlapped,H-12,15,20),3.35 (2H,d,J=7.20 Hz,H-7),2.57 (3H,s,H-5′),2.35 (3H,s,H-4′),2.17～1.92 (12H,m,H2-10,11,14,15,18,19),1.71 (3H,s,CH3-9),1.67 (3H,s,H-22),1.59 (3H,s,CH3-13),1.59 (3H,s,CH3-17),1.59 (3H,s,CH3-21);13C-NMR (CDCl3,150 MHz)δ:144.53 (C-1),124.57 (C-2),108.07 (C-3),151.62 (C-4),115.23 (C-5),125.24 (C-6),27.34 (C-7),120.61 (C-8),137.56 (C-9),39.66 (C-10),26.72 (C-11),124.36 (C-12),135.15 (C-13),39.70 (C-14),26.57 (C-15),124.18 (C-16),135.01 (C-17),39.70 (C-18),26.46 (C-19),123.98 (C-20),131.31 (C-21),25.69 (C-22),16.21 (CH3-9),16.04 (CH3-13),15.99 (CH3-17),17.67 (CH3-21),167.71 (C-1′),119.29 (C-2′),159.24 (C-3′),24.89 (C-4′),23.52 (C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]報道的鹽膚木內(nèi)酯A基本一致，故化合物11鑒定為鹽膚木內(nèi)酯A(rhuscholide A)。

3.12 化合物12 黃色粉末，HR-ESI-MSm/z:609.146 1[M-H]-,(calcd.for C27H30O16610.153 4)。1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:7.56 (1H,s,H-2′),7.55 (1H,d,J=7.52 Hz,H-6′),6.84 (1H,d,J=8.64 Hz,H-5′),6.39 (1H,d,J=2.00 Hz,H-8),6.20 (1H,d,J=2.04 Hz,H-6),5.35 (1H,d,J=7.36 Hz,H-1″),5.31 (1H,brs,H-1?),0.99 (3H,d,J=6.16 Hz,H3-6?);13C-NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ:156.87 (C-2),133.73 (C-3),177.81 (C-4),161.66 (C-5),99.14 (C-6),164.54 (C-7),94.05 (C-8),157.06 (C-9),104.40 (C-10),121.62 (C-1′),115.67 (C-2′),145.19 (C-3′),148.86 (C-4′),116.71 (C-5′),122.04 (C-6′),101.20 (C-1″),74.52 (C-2″),76.88 (C-3″),70.44 (C-4″),76.36 (C-5″),67.45 (C-6″),101.62 (C-1?),70.82 (C-2?),71.00 (C-3?),72.28 (C-4?),68.70 (C-5?),18.20 (C-6?)。以上數(shù)據(jù)與文獻[23]報道的蘆丁基本一致，故化合物12鑒定為蘆丁(rutin)。

3.13 化合物13 黃色粉末，HR-ESI-MSm/z:285.039 3[M-H]-(calcd.for C15H10O6286.047 7)。1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:7.91 (1H,d,J=9.32 Hz,H-5),7.67 (1H,d,J=2.00 Hz,H-2′),7.53 (1H,dd,J=8.44,2.00 Hz,H-6′),6.91 (1H,m,H-6),6.90 (1H,m,H-8),6.86 (1H,m,H-5′);13C-NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ:145.10 (C-2),137.32 (C-3),172.02 (C-4),126.50 (C-5),115.63 (C-6),162.61 (C-7),101.90 (C-8),156.42 (C-9),114.18 (C-10),122.50 (C-1′),114.86 (C-2′),145.00 (C-3′),147.32 (C-4′),114.97 (C-5′),119.70 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[24]報道的漆黃素基本一致，故化合物13鑒定為漆黃素(fisetin)。

3.14 化合物14 黃色粉末，HR-ESI-MSm/z:285.039 5[M-H]-(calcd.for C15H10O6286.047 7)。1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:12.49 (1H,s,OH-5),8.06 (2H,d,J=8.84 Hz,H-2′,6′),6.94 (2H,d,J=8.84 Hz,H-3′,5′),6.45 (1H,d,J=1.96 Hz,H-8),6.21 (1H,d,J=1.96 Hz,H-6);13C-NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ:147.28 (C-2),136.12 (C-3),176.37 (C-4),159.65 (C-5),98.67 (C-6),164.35 (C-7),93.95 (C-8),161.18 (C-8a),103.52 (C-4a),122.14 (C-1′),129.97 (C-2′,6′),115.91 (C-3′,5′),156.64 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[25]報道的山柰酚基本一致，故化合物14鑒定為山柰酚(kaempferol)。

3.15 化合物15 黃色粉末，HR-ESI-MSm/z:593.150 3[M-H]-,(calcd.for C27H30O15594.158 5)。1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:7.99 (2H,d,J= 8.52 Hz,H-2′,6′),6.88 (2H,d,J= 8.48 Hz,H-3′,5′),6.39 (1H,brs,H-8),6.19 (1H,brs,H-6),5.31 (1H,d,J= 7.32 Hz,H-1″),4.38 (1H,s,H-1?),0.99 (3H,d,J= 5.96 Hz,H3-6?);13C-NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ:157.18(C-2),133.62 (C-3),177.70 (C-4),161.66 (C-5),99.41 (C-6),165.43 (C-7),94.29 (C-8),157.02 (C-9),104.16 (C-10),121.31 (C-1),131.31 (C-2′,6′),115.56 (C-3′,5′),160.40 (C-4′),101.88 (C-1″),74.63 (C-2″),76.17 (C-3″),70.34 (C-4″),76.81 (C-5″),67.34 (C-6″),101.25 (C-1?),71.03 (C-2?),70.80 (C-3?),72.27 (C-4?),68.72 (C-5?),18.21 (C-6?)。以上數(shù)據(jù)與文獻[26]報道的山柰酚-3-O-蕓香糖苷一致，故化合物15鑒定為山柰酚-3-O-蕓香糖苷(kaemferol-3-O-β-D-rutinoside)。

3.16 化合物16 黃色粉末，HR-ESI-MSm/z:271.060 6[M-H]-,(calcd.for C15H12O5272.068 5)。1H-NMR(CD3OD,600 MHz)δ:7.68 (1H,d,J=8.40 Hz,H-5),6.90 (1H,s,H-2),6.76 (2H,m,H-5′,6′),6.46 (1H,dd,J=8.40,1.80 Hz,H-6),6.32 (1H,d,J= 1.80 Hz,H-8),5.26 (1H,d,J=11.60 Hz,H-2),2.97 (1H,dd,J=16.80,11.40 Hz,H-3α),2.66 (1H,d,J=16.80 Hz,H-3β);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:80.82 (C-2),44.76 (C-3),193.38 (C-4),129.62 (C-5),111.65 (C-6),166.76 (C-7),103.67 (C-8),165.39 (C-9),114.75 (C-10),131.85 (C-1′),114.54 (C-2′),146.68 (C-3′),146.37 (C-4′),116.16 (C-5′),119.08 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[27]報道的紫鉚亭基本一致，故化合物16鑒定為紫鉚亭(butin)。

3.17 化合物17 黃色粉末，HR-ESI-MSm/z:287.056 1[M-H]-,(calcd.for C15H12O6288.063 4)。1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:7.62 (1H,d,J=8.40 Hz,H-5),6.87 (1H,d,J=1.80 Hz,H-2′),6.73 (2H,m,H-5′,6′),6.51 (1H,dd,J=8.80,2.40 Hz,H-6),6.29 (1H,d,J=2.40 Hz,H-8),4.95 (1H,d,J=11.60 Hz,H-2),4.40 (1H,d,J=11.20 Hz,H-3);13C-NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ:83.57 (C-2),72.64 (C-3),192.47 (C-4),128.41 (C-5),110.93 (C-6),164.92 (C-7),102.45 (C-8),128.76 (C-1′),112.14 (C-2′),144.94 (C-3′),145.72 (C-4′),115.12 (C-5′),119.47 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[28]報道的二氫漆黃素基本一致，故化合物17鑒定為二氫漆黃素(fustin)。

3.18 化合物18 白色粉末，HR-ESI-MSm/z:289.071 2[M-H]-,(calcd.for C15H14O6290.079 0)。1H-NMR(CD3OD,600 MHz)δ:6.83 (1H,d,J= 1.62 Hz,H-2′),6.76 (1H,d,J= 8.04 Hz,H-5′),6.71 (1H,dd,J=8.10,1.68 Hz,H-6′),5.92 (1H,d,J=2.10 Hz,H-8),5.85 (1H,d,J=2.04 Hz,H-6),4.56 (1H,d,J=7.50 Hz,H-2),3.97 (1H,m,H-3),2.84 (1H,dd,J=16.08,5.34 Hz,H-4a),2.50 (1H,dd,J=16.08,8.16 Hz,H-4b);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:81.46 (C-2),67.43 (C-3),27.11 (C-4),156.44 (C-5),94.93 (C-6),156.18 (C-7),94.14 (C-8),155.53 (C-9),99.45 (C-10),130.85 (C-1′),113.88 (C-2′),144.83 (C-3′),145.66 (C-4′),114.70 (C-5′),118.65 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[29]報道的兒茶素基本一致，故化合物18鑒定為(+)-兒茶素((+)-catechin)。

3.19 化合物19 無色粉末，HR-ESI-MSm/z:273.076 8[M-H]-,(calcd.for C15H14O5274.084 1)。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz)δ:12.24 (2H,s,2′,6′-OH),10.35 (1H,s,4′-OH),9.14 (1H,s,4-OH),7.02 (2H,d,J=8.44 Hz,H-2,6),6.67 (2H,d,J=8.44 Hz,H-3,5),5.82 (2H,s,H-3′,5′),3.21 (2H,t,J=7.64 Hz,H-α),2.76 (2H,t,J=7.40 Hz,H-β);13C-NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ:132.09 (C-1),129.61 (C-2,6),115.52 (C-3,5),155.84 (C-4),104.18 (C-1′),164.66 (C-2′,6′),95.12 (C-3′,5′),165.04 (C-4′),45.94 (C-α),29.90 (C-β),204.67 (C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻[30]報道的根皮素基本一致，故化合物19鑒定為根皮素(phloretin)。

3.20 化合物20 黃色粉末，HR-ESI-MSm/z:435.127 9[M-H]-,(calcd.for C21H24O10436.136 9)。1H-NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.06 (2H,d,J=8.40 Hz,H-2,6),6.67 (2H,d,J=8.40 Hz,H-3,5),6.17 (1H,d,J=2.40 Hz,H-3′),5.94 (1H,d,J=2.40 Hz,H-5′),5.03 (1H,d,J=7.60 Hz,H-1″),3.90 (1H,dd,J=12.00,2.00 Hz,H-6a″),3.71 (1H,dd,J=12.00,5.20 Hz,H-6b″),3.50～3.39 (overlapped,H-α, H-2″～H-5″),2.87 (2H,t,H-β);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ:133.27 (C-1),130.16 (C-2,6),115.83 (C-3,5),156.21 (C-4),106.20 (C-1′),167.57 (C-2′),98.00 (C-3′),162.14 (C-4′),95.22 (C-5′),165.42 (C-6′),46.26 (C-α),29.80 (C-β),206.37 (C=O),101.92 (C-1″),74.36 (C-2″),77.92 (C-3″),71.03 (C-4″),78.18 (C-5″),62.44 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[31]報道的根皮苷基本一致，故化合物20鑒定為根皮苷(phloridzin)。

4 抗氧化活性研究

參照文獻報道的實驗方法[32]進行適當改進，精密稱取適量DPPH，用甲醇配成50 μg·mL-1，避光備用。將單體樣品用甲醇制成系列濃度，各取10 μL加入790 μL DPPH溶液于EP管中混勻，避光反應30 min。反應結束后，立即精密吸取200 μL反應液置于96孔板(n=3)中，于517 nm波長處檢測吸光度(As)值。同時測定空白對照體系：10 μL甲醇溶劑與790 μL DPPH溶液混合后的Ac值，以及背景信號純甲醇200 μL的Ab值，每個濃度重復測3次，根據(jù)公式計算清除率，以清除率為縱坐標(Y)，

清除率=1-(As-Ab)/(Ac-Ab)

單體濃度為橫坐標(X)進行線性回歸計算，以清除率為50%時待測樣品濃度(IC50)為評價指標，以維生素C為陽性對照。鹽膚木中20種單體化合物的抗氧化活性結果見表1。

表1 鹽膚木中20種化合物體外清除自由基活性檢測結果

5 討論

課題組從舒冠通糖漿原料鹽膚木中共分離鑒定20個化學成分，通過對所分離得到化合物進行DPPH活性測試，結果表明1,2,3,4,6-五-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(1)、1,2,3,6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(2)、沒食子酸(3)、沒食子酸甲酯(4)、沒食子酸乙酯(5)、鞣花酸(6)、原兒茶醛(7)、蘆丁(12)、漆黃素(13)、山柰酚(14)的抗氧化活性優(yōu)于陽性對照藥維生素C。

舒冠通糖漿原料鹽膚木中20種化合物，抗氧化活性不同。對DPPH抗氧化活性進行分析。

5.1 對于酚酸類成分 首先，具有沒食子酰基結構的化合物具有顯著的抗氧化活性(均優(yōu)于陽性藥維生素C)，并且其活性與含沒食子?；Y構的數(shù)量呈正相關，1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖(1)其具有5個沒食子?；Y構，其抗氧化活性為所有測試化合物中最強，IC50為2.61 μmol·L-1，其次為1,2,3,6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(2)，其具有4個沒食子?；Y構，IC50為5.54 μmol·L-1，而具有單個沒食子?；Y構的沒食子酸(3)、沒食子酸甲酯(4)和沒食子酸乙酯(5)活性相當；其次，具有鄰位酚羥基結構的酚酸類成分表現(xiàn)良好的抗氧化活性，其中鞣花酸(6)具有兩個鄰位酚羥基結構，其抗氧化IC50為10.86 μmol·L-1，原兒茶醛(7)和原兒茶酸(8)具有鄰位酚羥基結構，但是因原兒茶醛還具有還原性結構醛基(IC50值為14.60 μmol·L-1)，所以其抗氧化活性顯著優(yōu)于原兒茶酸(IC50值為32.34 μmol·L-1)；第三，僅有酚羥基結構的苔黑酚葡萄糖苷(9)、對羥基苯甲酸(10)和鹽膚木內(nèi)酯A(11)沒有表現(xiàn)出明顯活性。

5.2 對于黃酮類成分 首先，黃酮醇或者黃酮苷，具有B環(huán)鄰二酚羥基結構的蘆丁(12)和漆黃素(13)，其抗氧化IC50值分別為16.68、18.88 μmol·L-1，顯著優(yōu)于僅有單一酚羥基的山柰酚(14)和山柰酚-3-O-蕓香糖苷(15)，其中山柰酚結構C環(huán)的3位羥基苷取代后，抗氧化活性下降；其次，對于二氫黃酮類，二氫漆黃素(17)相比于漆黃素(13)，由于2,3位的雙鍵氫化，其活性下降為IC50值34.91 μmol·L-1，具有相似結構的紫鉚亭(16)IC50值為31.45 μmol·L-1，而黃烷醇類黃酮(+)-兒茶素(18)由于其缺少了4位羰基結構，其抗氧化活性也相對較小，IC50值為36.81 μmol·L-1；第三，對于查爾酮類黃酮根皮素(19)和根皮苷(20)，由于其B環(huán)結構上沒有鄰二酚羥基結構，僅有A環(huán)的間二酚羥基結構，其抗氧化活性顯著低于本次分離的其他黃酮成分。

本試驗對舒冠通糖漿原料鹽膚木的化學成分進行研究，共鑒定出20個化合物，其中6個成分是首次從鹽膚木中分離得到，可為其進一步的開發(fā)與利用提供依據(jù)。此外，本次分離所得到的化合物主要成分為黃酮類和酚酸類，并對其開展了DPPH抗氧化活性測試，結果表明多數(shù)成分均具有良好的抗氧化能力，可為加強和完善鹽膚木化學成分的研究，明確其抗氧化的藥效物質(zhì)基礎，同時也為舒冠通糖漿抗冠心病機制的研究奠定基礎。