多菌靈降解菌株djl-10的分離及降解特性

袁巧云 孫悅 張跡

摘要：從多菌靈生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中，通過(guò)富集和選擇性培養(yǎng)，分離得到1株能高效降解多菌靈的細(xì)菌，并將其命名為djl-10。根據(jù)菌株的菌落形態(tài)，生理生化特性及基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析等，初步將菌株鑒定為分枝桿菌屬。該菌株能利用多菌靈作為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長(zhǎng)并基本徹底礦化多菌靈。2-氨基苯并咪唑和2-羥基苯并咪唑?yàn)榫杲到舛嗑`的中間代謝產(chǎn)物。菌株能夠在較寬溫度和pH值范圍內(nèi)有效降解多菌靈，其降解多菌靈的最適溫度和pH值分別為37 ℃、7.0。裝液量試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解明顯依賴氧氣。Ca2+、Mg2+、Fe3+等離子能夠明顯促進(jìn)菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解。此外，本研究克隆和表達(dá)菌株djl-10的多菌靈水解酶基因mhe。酶促反應(yīng)結(jié)果表明，純化的重組酶Mhe對(duì)多菌靈具有明顯的催化活性。

關(guān)鍵詞：分枝桿菌;多菌靈;生物降解;廢水處理系統(tǒng)

中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）23-0284-05

多菌靈是一種廣譜、內(nèi)吸性殺菌劑，廣泛應(yīng)用于防控各種農(nóng)作物的真菌病害[1]。許多苯并咪唑類和托布津類殺菌劑均可在作物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為多菌靈而起作用[2]。多菌靈同時(shí)還是一種持久性環(huán)境污染物，其半衰期在表層土壤中約為3～15周[3-4]。值得注意的是多菌靈在土壤和水體中長(zhǎng)期殘留會(huì)進(jìn)一步污染食品，危害人們身體健康[5-6]。研究表明，多菌靈對(duì)動(dòng)物的肝臟和內(nèi)分泌系統(tǒng)有害，是一種“三致”物質(zhì)，既使在較低濃度下也會(huì)對(duì)生物體造成傷害[7-8]。我國(guó)每年多菌靈的生產(chǎn)量已超過(guò)10 000 t[9]。經(jīng)生產(chǎn)和使用途徑多菌靈進(jìn)入環(huán)境中，并在土壤、河流中殘留，對(duì)各種生物的生長(zhǎng)繁殖以及人們的食品安全和身體健康造成潛在的危害。目前，已經(jīng)報(bào)道多種多菌靈降解菌株[7-12]。本研究分離得到1株能高效降解多菌靈的分枝桿菌菌株，并對(duì)其降解特性進(jìn)行初步研究，以期進(jìn)一步豐富高效多菌靈降解菌株的資源庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑與培養(yǎng)基

多菌靈（純度>98.0%），由江蘇新沂農(nóng)藥廠贈(zèng)送;用于高效液相色譜分析的色譜純甲醇，購(gòu)自江蘇漢邦科技股份有限公司。其他化學(xué)試劑均為普通國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

基礎(chǔ)鹽（MSM）培養(yǎng)基配方：1.0 g/L NaCl，1.0 g/L NH4NO3，1.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，1 000 mL 去離子水;富集分離培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加0.01%的多菌靈原藥作為唯一碳氮源;LB培養(yǎng)基配方：10.0 g/L 胰蛋白胨，5.0 g/L酵母粉，5.0 g/L NaCl，1 000 mL 去離子水。

1.2 菌株的富集與分離

取多菌靈生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中的5 mL活性污泥加入到100 mL富集培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。每隔4 d取5 mL富集培養(yǎng)物接種至100 mL新鮮富集培養(yǎng)基中。經(jīng)連續(xù)3代富集后，取富集液梯度稀釋涂布到含過(guò)飽和多菌靈的基礎(chǔ)鹽瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d。周圍有透明圈的菌落即為疑似多菌靈降解菌，將這些菌株用固體LB培養(yǎng)基平板劃線分離，純化后進(jìn)一步驗(yàn)證其多菌靈降解能力。

1.3 菌株鑒定

采用高鹽法提取菌株基因組DNA作為模板，以細(xì)菌16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增菌株16S rDNA序列。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物TA克隆后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序序列提交到NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）上進(jìn)行在線分析，利用Blast軟件在GenBank中與其他菌株16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)。采用軟件Mega 6.0，通過(guò)鄰結(jié)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。菌株djl-10 16S rDNA序列的GenBank登錄號(hào)為KX509812。

1.4 多菌靈降解及檢測(cè)

1.4.1 菌懸液制備 接種菌株dj1-10至液體LB培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d，離心收集菌體，用MSM培養(yǎng)基洗滌并重懸菌體至D600 nm≈1.0。

1.4.2 降解體系構(gòu)建 以1%的接種量，接種菌懸液至MSM液體培養(yǎng)基中，并添加終濃度為100 mg/L的多菌靈作為唯一碳源和能源。當(dāng)以多菌靈為唯一氮源時(shí)，向降解體系中添加100 mg/L葡萄糖。所有處理均設(shè)置3次重復(fù)，在30 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，按特定時(shí)間間隔取樣待測(cè)。

1.4.3 樣品處理 向待測(cè)樣品中加入等體積二氯甲烷，劇烈振蕩2 min，靜置分層后吸出水相，有機(jī)相在通風(fēng)櫥中充分揮發(fā)后加甲醇重新溶解定容，用0.22 μm一次性有機(jī)相過(guò)濾器過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱HPLC）分析。

1.4.4 樣品檢測(cè) 樣品中多菌靈殘留濃度采用HPLC法檢測(cè)，色譜條件為Agilent 1260高效液相色譜儀，Kromasil 100-5 C18反向柱（4.6 mm×25.0 cm），流動(dòng)相為甲醇與0.02 mol/L醋酸銨體積比為65 ∶ 35，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 286 nm，室溫檢測(cè)。

1.5 環(huán)境條件對(duì)菌株降解多菌靈的影響

1.5.1 溫度的影響 將降解體系分別置于20、25、30、37、40、45 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定不同溫度下菌株 djl-10對(duì)多菌靈的降解率。

1.5.2 初始pH值的影響 根據(jù)“1.5.1節(jié)”中試驗(yàn)選擇溫度為 37 ℃。分別用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液將MSM培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)為5、6、7、8、9后構(gòu)建“1.4.2節(jié)”中的降解體系。在37 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定不同pH值條件下菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解率。

1.5.3 裝液量的影響 在100 mL三角瓶中構(gòu)建降解體系，并設(shè)置10、20、30、40、50 mL等5個(gè)裝液量處理組。在37 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定不同裝液量條件下菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解率。

1.5.4 不同金屬離子的影響 分別向多菌靈降解體系中添加MgCl2、CuSO4、CaCl2、MnSO4、ZnSO4、FeCl3、CoCl2等溶液，設(shè)置0.1、1.0、 10.0 mmol/L等3個(gè)處理濃度。在37 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定不同金屬離子處理?xiàng)l件下菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解率。以不加金屬離子的多菌靈降解體系為對(duì)照。

1.6 多菌靈水解酶基因mhe的克隆與表達(dá)

1.6.1 mhe基因的PCR擴(kuò)增與序列分析 參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)合成多菌靈水解酶基因的PCR引物MheI-F和MheI-R。以菌株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增菌株mhe基因片段。PCR產(chǎn)物TA克隆后，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序序列提交GenBank進(jìn)行Blast同源性比對(duì)分析。

1.6.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建 通過(guò)引物設(shè)計(jì)，在mhe基因片段PCR產(chǎn)物的上下游分別引入限制性酶切位點(diǎn)Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ，并通過(guò)載體構(gòu)建的方式將mhe基因片段連接到表達(dá)載體pET29a的相應(yīng)位點(diǎn)上，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pET29a-mhe，隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株。

1.6.3 蛋白Mhe誘導(dǎo)表達(dá)及純化 在含50 mg/L卡那抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，將重組表達(dá)菌株于37 ℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到D600 nm≈0.5時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，簡(jiǎn)稱IPTG），在18 ℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，以誘導(dǎo)蛋白Mhe表達(dá)。采用Ni柱親和層析策略，參照產(chǎn)品說(shuō)明步驟純化目標(biāo)蛋白Mhe。純化的目標(biāo)蛋白透析脫鹽后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.6.4 Mhe酶活力檢測(cè) 構(gòu)建酶促反應(yīng)體系：500 μL 20 mmol/L Tris-HCl （pH值為8.0），25 μL Mhe酶液，5 μL多菌靈母液（終濃度為10 mg/L），37 ℃恒溫水浴。平行操作15個(gè)反應(yīng)體系，分為5組，每組3次重復(fù)，分別在0、2、4、6、8 h 取樣，加入等體積的二氯甲烷終止酶促反應(yīng)并萃取體系中殘留的多菌靈，用HPLC檢測(cè)分析各組樣品中多菌靈的殘留濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌靈降解菌株的富集與分離

從處理多菌靈生產(chǎn)廢水的活性污泥中分離得到1株高效多菌靈降解菌株，命名為djl-10。菌株革蘭氏染色為陽(yáng)性，在LB固體平板上經(jīng)30 ℃，2～3 d培養(yǎng)后形成黃色菌落。菌株能在以過(guò)飽和多菌靈為唯一碳氮源的渾濁基礎(chǔ)鹽瓊脂平板上生長(zhǎng)，并在菌落周圍和下方形成清晰的透明水解圈（圖1）。

2.2 菌株djl-10的鑒定

菌株djl-10的16S rDNA序列同源性比對(duì)分析顯示其與分枝桿菌屬（Mycobacterium sp.）菌株有較高的同源性，達(dá)99%。分枝桿菌屬與諾卡氏菌屬、紅球菌屬等在親緣關(guān)系上相近，同時(shí)為考察菌株djl-10與其他已報(bào)道的多菌靈降解菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，從GenBank中調(diào)取它們的16S rDNA序列進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，其與Mycobacterium sp.親緣關(guān)系最近（圖2）。據(jù)此，將菌株djl-10初步鑒定為分枝桿菌屬菌株。

2.3 菌株對(duì)多菌靈的降解及代謝產(chǎn)物鑒定

菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解及生長(zhǎng)情況如圖3所示，菌株能夠以多菌靈為唯一碳氮源生長(zhǎng)，并降解多菌靈。當(dāng)以多菌靈為唯一氮源時(shí)菌株的生長(zhǎng)和降解均相對(duì)較好，菌株能在24 h內(nèi)將100 mg/L的多菌靈幾乎徹底降解。而以多菌靈為唯一碳源或唯一碳氮源時(shí)，菌株需要近36 h才能將多菌靈基本徹底降解。以多菌靈為唯一氮源時(shí)，體系中添加了葡萄糖，能夠促進(jìn)菌體的快速增加和對(duì)多菌靈的降解。因此，葡萄糖的存在應(yīng)是以多菌靈為唯一氮源時(shí)菌株生長(zhǎng)和降解更快的原因。

根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，2-氨基苯并咪唑（2-AB）和 2-羥基苯并咪唑（2-HB）是多種微生物菌株降解多菌靈的中間代謝產(chǎn)物。在菌株djl-10降解多菌的過(guò)程中，通過(guò)HPLC分析也檢測(cè)到了2個(gè)中間代謝產(chǎn)物。由圖4可知，這2個(gè)代謝產(chǎn)物分別與2-AB、2-HB標(biāo)準(zhǔn)品有相同的保留時(shí)間，基于此并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，將這2個(gè)代謝產(chǎn)物初步鑒定為 2-AB 和2-HB，這也說(shuō)明菌株djl-10降解多菌靈的代謝途徑與文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道的多菌靈降解菌株基本相同。

2.4 環(huán)境條件對(duì)菌株djl-10降解多菌靈的影響

2.4.1 溫度和初始pH值對(duì)降解率的影響 由圖5可知，在溫度低于37 ℃時(shí)，多菌靈降解率隨著溫度升高而升高，但當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí)，降解率隨著溫度升高略有下降。因此，菌株 djl-10降解多菌靈的最適溫度為37 ℃。由圖6可知，菌株djl-10降解多菌靈的最適pH值為7.0，培養(yǎng)基初始pH值偏酸和偏堿均會(huì)抑制多菌靈的降解。

2.4.2 裝液量對(duì)降解率的影響 由圖7可知，在100 mL三角瓶中裝液量為10、20 mL時(shí)多菌靈的降解率明顯高于裝液量為30、40、50 mL時(shí)，且隨著裝液量的增加，降解率逐漸下降，表明菌株djl-10降解多菌靈對(duì)氧氣有明顯的需求。

2.4.3 金屬離子對(duì)降解率的影響 由圖8可知，Mg2+和Ca2+能夠明顯促進(jìn)菌株djl-10對(duì)多菌靈的降解;Mn2+、Zn2+、Co2+在試驗(yàn)濃度為0.1、1.0 mmol/L時(shí)對(duì)降解有明顯促進(jìn)作用，但濃度為10.0 mmol/L時(shí)對(duì)降解作用強(qiáng)烈抑制;Cu2+對(duì)降解有明顯的抑制作用;值得注意的是，F(xiàn)e3+在低濃度（01、1.0 mmol/L）時(shí)對(duì)菌株降解多菌靈的影響不大，但在試驗(yàn)濃度為10.0 mmol/L時(shí)對(duì)多菌靈的降解有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用。

2.5 菌株多菌靈水解酶mhe基因的克隆和表達(dá)

從菌株dj1-10的基因組DNA中，PCR擴(kuò)增得到1個(gè)特異條帶，測(cè)序分析表明其為長(zhǎng)度為729 bp，起始密碼子為ATG終止密碼子為TGA，編碼242個(gè)氨基酸殘基的開(kāi)放式閱讀框（ORF）。序列同源性比對(duì)分析表明其與已報(bào)道的菌株R. erythropolis dj1-11[13]和Nocardioides sp. SG-4G[8]中的多菌靈水解酶基因mhe/mheI的序列相似性分別達(dá)到100%、99%。據(jù)此，推測(cè)該ORF就是菌株djl-10中負(fù)責(zé)編碼多菌靈水解酶Mhe的基因。

利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化菌株djl-10的多菌靈水解酶Mhe，SDS-PAGE分析結(jié)果（圖9）顯示，純化的Mhe為單一條帶，分子量約為26 ku，與基于氨基酸序列推測(cè)的理論值（26 251.93 u）相符。酶促反應(yīng)試驗(yàn)顯示純化的

Mhe對(duì)多菌靈具有催化活性，如圖10所示，在Mhe的催化下，反應(yīng)體系中多菌靈的殘留濃度隨時(shí)間推移逐步降低。這進(jìn)一步說(shuō)明該ORF是菌株djl-10中負(fù)責(zé)編碼多菌靈水解酶的mhe基因。

3 結(jié)論

從多菌靈廢水處理系統(tǒng)活性污泥中分離得到1株高效多菌靈降解菌株djl-10，初步鑒定為分枝桿菌屬菌株。該菌株能以多菌靈為唯一碳源、氮源和唯一碳氮源生長(zhǎng)并基本徹底降解多菌靈。進(jìn)一步豐富了多菌靈降解菌株的資源庫(kù)。

菌株djl-10降解多菌靈的最適溫度和初始pH值分別為37 ℃、7.0。裝液量試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株降解多菌靈時(shí)須要好氧環(huán)境。Mg2+和Ca2+等多種金屬離子對(duì)菌株降解多菌靈有明顯促進(jìn)作用;Cu2+對(duì)降解有明顯的抑制作用;高濃度（10.0 mmol/L）的Fe3+對(duì)降解有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用。

2-AB和2-HB是菌株djl-10降解多菌靈的中間代謝產(chǎn)物。菌株中負(fù)責(zé)催化多菌靈降解的第一步反應(yīng)的編碼基因是多菌靈水解酯酶基因mhe，該基因表達(dá)的產(chǎn)物對(duì)多菌靈有明顯的催化活性。

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收稿日期：2018-09-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31300099）。

作者簡(jiǎn)介：袁巧云（1981—），女，江蘇鹽城人，碩士，主要從事微生物學(xué)研究。E-mail：qiaoyunyuan@163.com。

通信作者：張 跡，博士，講師，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail：zhangjihnu@163.com。