pH值>瓊脂濃度,最終得到的二元回歸方程顯示,紅顏草莓增殖條件的優(yōu)化結(jié)果如下:瓊脂濃度為 7.1 g/L,pH值為5.37,光照度"/>
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    響應(yīng)面法優(yōu)化草莓品種紅顏離體繁殖的增殖條件

    2019-03-03 02:43:42姚思揚(yáng)趙春莉劉子平劉翰升劉玥
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年23期
    關(guān)鍵詞:響應(yīng)面法

    姚思揚(yáng) 趙春莉 劉子平 劉翰升 劉玥

    摘要:為了研究?jī)?yōu)化紅顏草莓繼代增殖培養(yǎng)的條件,以草莓品種紅顏繼代組培苗為試驗(yàn)材料,利用響應(yīng)面法對(duì)其增殖條件進(jìn)行優(yōu)化。在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以瓊脂濃度、光照度、pH值為試驗(yàn)因子,以增殖系數(shù)為響應(yīng)值,進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果表明:3因素對(duì)植株增殖系數(shù)的影響力大小為光照度>pH值>瓊脂濃度,最終得到的二元回歸方程顯示,紅顏草莓增殖條件的優(yōu)化結(jié)果如下:瓊脂濃度為 7.1 g/L,pH值為5.37,光照度為2 177 lx。在此條件下,最佳增殖系數(shù)預(yù)測(cè)值為10.930 5,實(shí)際操作結(jié)果為10.73。

    關(guān)鍵詞:草莓品種;離體繁殖;增殖條件;響應(yīng)面法

    中圖分類號(hào): S668.404+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2019)23-0088-04

    草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是薔薇科草莓屬多年生草本植物,紅顏(Benihoppe)為著名的日本品種,是以幸香和章姬為親本雜交選育而來(lái)的,其果實(shí)鮮紅飽滿,味道香甜可口,產(chǎn)量高,耐儲(chǔ)存耐運(yùn)輸[1],深受廣大種植者和消費(fèi)者的喜愛(ài),具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,擁有廣闊的市場(chǎng)。草莓的傳統(tǒng)繁殖方法是匍匐莖繁殖和分枝繁殖,效率低,易感染病毒,長(zhǎng)久的病毒累積使品種退化,產(chǎn)量降低[2]。經(jīng)過(guò)莖尖脫毒培養(yǎng)后進(jìn)行離體快繁,不受季節(jié)限制,產(chǎn)量高,培養(yǎng)周期短,是獲得大量無(wú)病毒原種苗的有效手段。

    目前,關(guān)于草莓組培的相關(guān)研究,大部分集中于探討培養(yǎng)基內(nèi)激素的種類及濃度,旨在篩選出每個(gè)階段的最佳培養(yǎng)基[3-7],但關(guān)于其他培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)旨在探討增殖階段,pH值、光照度、瓊脂濃度對(duì)其增殖率的影響。并在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上,參考Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,用響應(yīng)面法將各因子的相互關(guān)系進(jìn)行擬合分析,研究各因子與響應(yīng)值的關(guān)系,從而優(yōu)化紅顏草莓的組培條件,以期為今后相關(guān)研究提供理論實(shí)踐基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)材料為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室的當(dāng)年生草莓匍匐莖尖,于2017年5月采摘,在園藝學(xué)院園林生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)經(jīng)初代培養(yǎng)后,選取長(zhǎng)勢(shì)一致的、高2 cm左右的紅顏草莓繼代組培苗為試驗(yàn)材料。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,所用的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L,蔗糖濃度30 g/L。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 單因素試驗(yàn)

    1.2.1.1 pH值對(duì)增殖系數(shù)的影響 將不定芽接種到培養(yǎng)基內(nèi),光照度為2 000 lx,光照時(shí)間為14 h/d,培養(yǎng)室溫度為 (25±2) ℃,pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,瓊脂粉濃度為 7 g/L。每個(gè)水平處理10個(gè)組培苗,培養(yǎng)周期為30 d。

    1.2.1.2 光照度對(duì)增殖系數(shù)的影響 將不定芽接種到培養(yǎng)基內(nèi),pH值為6.0,光照時(shí)間為14 h/d,培養(yǎng)室溫度為(25±2) ℃,光照度為1 200、1 500、1 800、2 100、2 400 lx。瓊脂粉濃度為7 g/L,每個(gè)水平處理10個(gè)組培苗,培養(yǎng)周期為30 d。

    1.2.1.3 瓊脂濃度對(duì)增殖系數(shù)的影響 將不定芽接種到培養(yǎng)基內(nèi),pH值為6.0,光照時(shí)間為14 h/d,光照度為2 000 lx,培養(yǎng)室溫度為(25±2) ℃,瓊脂濃度為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 g/L,每個(gè)水平處理10個(gè)組培苗,培養(yǎng)周期為30 d。

    1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,用響應(yīng)面分析法,根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以pH值、光照度、瓊脂濃度為試驗(yàn)因子,增殖系數(shù)為響應(yīng)值,進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì),見(jiàn)表1。每個(gè)水平處理10個(gè)組培苗,培養(yǎng)周期為30 d。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    用SPSS和Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。增殖系數(shù)=培養(yǎng)30 d后不定芽總數(shù)/接種的不定芽數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 pH值對(duì)增殖系數(shù)的影響 由表2可知,pH值為5.5時(shí),試管苗呈翠綠色,植株健壯,與其他大部分處理間差異顯著。當(dāng)pH值為6.0時(shí),增殖系數(shù)隨著pH值的繼續(xù)升高而降低。當(dāng)pH值為7.0時(shí),培養(yǎng)基內(nèi)環(huán)境為堿性,增殖系數(shù)只有3.30,植株矮小,長(zhǎng)勢(shì)不佳。由此可見(jiàn),草莓增殖階段更適于酸性的培養(yǎng)環(huán)境,堿性環(huán)境會(huì)抑制其增殖與生長(zhǎng),增殖培養(yǎng)的最適pH值為5.5,增殖系數(shù)可達(dá)5.90。

    2.1.2 光照度對(duì)增殖系數(shù)的影響 由表2可知,增殖系數(shù)隨光照度的增大呈先上升后下降的趨勢(shì),在光照度 1 200 lx 下,試管苗生長(zhǎng)緩慢,長(zhǎng)勢(shì)不佳,增殖率只有3.1。隨著光照度的增加,植株長(zhǎng)勢(shì)隨之變好,增殖系數(shù)隨之增加,但光照度為2 400 lx時(shí),增殖系數(shù)下降,且試管苗失綠變透明狀,有玻璃化現(xiàn)象。由此可見(jiàn),光照度過(guò)低會(huì)抑制植株生長(zhǎng),過(guò)高會(huì)產(chǎn)生玻璃化苗,不利于植株生長(zhǎng),增殖培養(yǎng)的最佳光照度為 2 100 lx,增殖系數(shù)為6.90。

    2.1.3 瓊脂濃度對(duì)增殖系數(shù)的影響 由表2可知,瓊脂濃度低于7.0 g/L時(shí),增殖系數(shù)都低于5,植株矮小且有玻璃化苗產(chǎn)生。當(dāng)瓊脂濃度≥7.0 g/L時(shí),植株生長(zhǎng)健壯,無(wú)玻璃化苗。C4、C5這2處理差異不顯著,都有很好的增殖效果,且植株長(zhǎng)勢(shì)極佳,但從經(jīng)濟(jì)成本上考慮,篩選出最適宜增殖培養(yǎng)的瓊脂濃度為7.5 g/L,增殖系數(shù)為6.50。

    2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 二元模型的建立與分析 以增殖系數(shù)(Y)為響應(yīng)值,瓊脂濃度(X1)、pH(X2)、光照度(X3)為因素,經(jīng)過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件分析,得出的回歸方程模型為Y=10.66+0.36X1-0.89X2+1.00X3+0.33X1X2+0.050X1X3+020X2X3-0.89X21-1.54X22-1.87X23。該回歸模型P為 0.000 3<0.01,有極顯著差異,失擬項(xiàng)為0.174 6>0.05,差異不顯著,模型穩(wěn)定性較好。該方程響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。R2=0.962 6,說(shuō)明方程擬合性良好,試驗(yàn)誤差小。由表4可知,X1對(duì)響應(yīng)值影響不顯著,X2、X3影響極顯著,3因素對(duì)增殖系數(shù)的影響力大小為X3>X2>X1,X1、X2、X3的二次項(xiàng)都對(duì)響應(yīng)值有極顯著影響,交互作用影響均不顯著。

    2.2.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)擬合方程,繪制3因素之間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖,各圖表示在1種因素取值為0時(shí),其他2種因素對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面曲面的陡峭程度可表明因素對(duì)響應(yīng)值的影響力大小,曲面越陡,影響力越大,反之則越小。由等高線的形狀可知交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形表明效應(yīng)顯著,圓形則相反[8]。由圖1、圖2、圖3可知,有關(guān)瓊脂濃度的曲面較平緩,可見(jiàn)瓊脂的影響力小。關(guān)于光照度的曲面都很陡峭,可見(jiàn)光照度是影響力最大的因素。通過(guò)等高線圖及響應(yīng)面圖可見(jiàn)瓊脂濃度與pH值的交互作用影響力最大,其次是光照度與pH值,影響力最小的是光照度與瓊脂濃度的交互作用。

    2.2.3 模擬方程的驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)二次回歸方程的分析可得出紅顏草莓增殖的最優(yōu)條件如下:瓊脂濃度為7.08 g/L,pH值為5.37,光照度為2 176.99 lx,最佳增殖系數(shù)預(yù)測(cè)值為10.930 5。對(duì)該模型進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn), 試驗(yàn)條件如下:瓊脂濃度為7.1 g/L,pH值為5.37,光照度為2 177 lx。每次處理10個(gè)不定芽,得出的3次結(jié)果為10.7、11.2、10.3,平均值為10.73。與預(yù)測(cè)值十分接近,說(shuō)明方程與真實(shí)試驗(yàn)擬合度較好,該優(yōu)化方案有實(shí)際意義和可行度。

    3 討論與結(jié)論

    光照度是影響植物光合作用的主要因素,在一定范圍內(nèi),隨著光照度的增強(qiáng), 植株長(zhǎng)勢(shì)隨之變好。但光照度超過(guò)一定

    范圍,則會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生不利影響[9]。不同種類的組培苗所需光照差異性較大,如紅樹(shù)莓增殖階段的最適光照度為 1 500 lx[10],紫花含笑在8 000 lx的強(qiáng)光下更適于芽的生長(zhǎng)[11],金葉復(fù)葉槭在4 200 lx的光照度下生長(zhǎng)效果最佳[12],香蕉組培苗增殖階段只需1 000 lx光照度[13]。在組培的不同階段,所需光照度不同,通常在生根階段組培苗所需的光照更多,隨著組培苗生長(zhǎng)狀態(tài)的變化,要合理調(diào)控光因素,才可使植株更好生長(zhǎng),可見(jiàn)光照是影響組培苗生長(zhǎng)的重要因素。不同植物所需的培養(yǎng)基酸堿環(huán)境不同,本試驗(yàn)證明,紅顏草莓更適于酸性培養(yǎng)基。瓊脂有凝固培養(yǎng)基的作用,可影響培養(yǎng)基內(nèi)的水分,其濃度對(duì)植物生長(zhǎng)也存在一定影響。瓊脂濃度低,培養(yǎng)基內(nèi)水分多,不利于植物生長(zhǎng)分化,會(huì)有玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生;瓊脂濃度高,培養(yǎng)基偏硬,會(huì)使植物失水,造成植株萎蔫[14]。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致,在單因素試驗(yàn)中,瓊脂濃度低于 7 g/L 時(shí),有玻璃化現(xiàn)象,植株長(zhǎng)勢(shì)不佳。

    在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),光照度過(guò)高、瓊脂濃度過(guò)低時(shí)會(huì)產(chǎn)生玻璃化苗。玻璃化是一種植物在離體快繁中發(fā)生的生理、形態(tài)異常的現(xiàn)象,可危害試管苗正常生長(zhǎng)。玻璃化苗植株矮小,莖干透明狀,葉片透明狀,脆弱失綠,長(zhǎng)勢(shì)不佳[15]。產(chǎn)生玻璃化的原因有很多,高溫密封的培養(yǎng)環(huán)境、高濃度的植物激素加速了植物生長(zhǎng),瓶?jī)?nèi)氣體濃度發(fā)生變化,供植物正常生長(zhǎng)的氣體交換環(huán)節(jié)受到影響,易產(chǎn)生玻璃化[16]。溫度過(guò)高、濕度過(guò)大、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度高、繼代次數(shù)太多,都易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象,影響植株長(zhǎng)勢(shì)[17]。對(duì)于輕度的玻璃化苗,增加蔗糖濃度,添加活性炭可使其緩解或恢復(fù)[18]。在組培試驗(yàn)中,要嚴(yán)格控制通風(fēng)、溫度、光照等培養(yǎng)環(huán)境,控制激素濃度,避免或減少玻璃化苗的產(chǎn)生。

    在單因素試驗(yàn)中,光照度、瓊脂濃度、pH值的最佳增殖系數(shù)分別為6.9、6.5、5.9。而優(yōu)化試驗(yàn)中最佳增殖系數(shù)為 10.73,明顯高于單因素的試驗(yàn)結(jié)果。響應(yīng)面分析法是一種試驗(yàn)次數(shù)少、回歸方程精度高、能研究多因子間交互作用的研究方法,其高效便捷,可節(jié)省人力、成本和時(shí)間[19-20]。優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果顯示,最適合紅顏草莓增殖的培養(yǎng)環(huán)境如下:瓊脂濃度 7.1 g/L,pH值為5.37,光照度為2 177 lx,增殖系數(shù)為 10.73。陳英等研究得到的最佳增殖系數(shù)為6.62[21]。翟婷婷研究得出的最佳增殖系數(shù)為5.0[22],與現(xiàn)有研究相比本試驗(yàn)的增殖系數(shù)高于已報(bào)道的部分研究結(jié)果,說(shuō)明篩選增殖條件有實(shí)際意義。

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    收稿日期:2018-09-05

    基金項(xiàng)目:吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào):20140204026NY)。

    作者簡(jiǎn)介:姚思揚(yáng)(1994—),女,山東壽光人,碩士研究生,主要從事觀賞植物資源引種馴化及繁殖技術(shù)研究。E-mail:1575603119@qq.com。

    通信作者:趙春莉,博士,副教授,主要從事觀賞植物資源引種馴化及繁殖技術(shù)研究。E-mail:zcl8368@163.com。

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