蒿屬植物降糖活性成分及提取方法研究進(jìn)展

肖建琪，李達(dá)，張杰,2，黃雪峰*，馮鋒,2,3**

（1. 中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室, 江蘇 南京210009；2. 中國(guó)藥科大學(xué)生物材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 南京 210009；3. 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 江蘇 淮安 223003）

隨著我國(guó)國(guó)力的不斷提升，人民生活水平和生活質(zhì)量逐年提高，糖尿病患病人數(shù)也越來(lái)越多。糖尿病會(huì)引發(fā)多種并發(fā)癥，如心腦血管類(lèi)疾病等。目前對(duì)于糖尿病的治療，尚停留于“治標(biāo)不治本”，仍無(wú)藥物可以徹底治愈糖尿病，只是用藥物來(lái)維持癥狀不致加劇[1]。糖尿病是一種由于胰島細(xì)胞分泌異常引起的一種以高血糖為特征的慢性病[2]。中醫(yī)學(xué)將糖尿病歸于“消渴”的范疇，是一種虛實(shí)結(jié)合的復(fù)雜疾病[3]。由于相對(duì)西藥而言，中藥來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、毒副作用可能較小，中醫(yī)藥治療糖尿病在我國(guó)已經(jīng)得到越來(lái)越多的認(rèn)可。

蒿屬植物在我國(guó)廣泛分布，是包含數(shù)量最多的菊科植物之一[4]，由于此屬植物具有獨(dú)特的香氣，因此?？梢杂米魇称吩蟍5-7]。該屬植物中的艾葉、茵陳蒿、奇蒿、濱蒿等為常用中藥，并為中國(guó)藥典收載品種，因此研究該屬植物具有深遠(yuǎn)的意義。

隨著現(xiàn)代分離分析技術(shù)以及藥理活性評(píng)價(jià)手段的不斷提高，蒿屬植物在降血糖方面的研究取得了一定進(jìn)展，本文對(duì)蒿屬植物降糖主要活性成分、降糖作用機(jī)制、提取方法和質(zhì)量分析等多方面進(jìn)行歸納總結(jié)，旨在為蒿屬植物降糖活性的深入研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 多糖

隨著現(xiàn)代科技的不斷進(jìn)步，植物多糖的作用廣為人知，菊科植物中的多糖類(lèi)成分降血糖活性也逐漸受到重視[8-9]。但對(duì)于其中蒿屬植物中的多糖類(lèi)化合物，截至目前僅報(bào)道了艾葉多糖的降血糖活性。

1.1 艾葉多糖的降血糖作用機(jī)制研究

尹美珍等[10]為篩選蒿屬植物艾葉的降血糖活性部分，采用80%乙醇回流提取、去離子水提取方法和乙醇沉淀法，從艾葉的水提液中獲得艾葉多糖粗品，用去離子水配制3種不同濃度的艾葉多糖溶液，并用鏈脲佐菌素造2型糖尿病模型，測(cè)定血糖胰島素含量和肝糖原水平。結(jié)果顯示：艾葉多糖不僅能明顯降低糖尿病小鼠的血糖，還能改善糖耐量，且其高劑量組的降血糖效果更好，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知艾葉多糖是艾葉降糖的活性成分。其作用機(jī)制是增加糖尿病小鼠的肝糖原，從而調(diào)節(jié)其血糖濃度，起到降低血糖作用。

1.2 多糖的提取與純化

1.2.1 多糖的提取胡崗等[11]利用水浴回流的方法提取艾葉中的多糖類(lèi)化合物，首先用無(wú)水乙醇在80℃的條件下回流提取1.5 h，濃縮得到浸膏后，用去離子水在同等條件下回流提取3次，提取后仍然過(guò)濾濃縮，并反復(fù)應(yīng)用水洗醇析，最后用Saveg法去除蛋白等雜質(zhì)，得到艾葉多糖粗提物。

甘昌盛等[12]采用水提的方法提取艾葉多糖，用正交實(shí)驗(yàn)法，探索料液比、浸泡時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)艾葉多糖提取率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)其影響最大的是料液比，其次是浸泡時(shí)間，影響最小的是提取時(shí)間，最佳提取工藝是：料液比為1 : 20、浸泡和提取時(shí)間分別為5和4.5 h。

羅旋等[13]采用超聲波法提取艾葉多糖，提取溫度為95 ℃，提取時(shí)間為2 h，提取之前超聲作用30 min，其中料液比為1 : 20，其余步驟與胡崗等[11]的步驟類(lèi)似。

李華生等[14]采用加壓同步萃取法，通過(guò)單因素影響實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)各種因素進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)加壓對(duì)艾葉多糖的提取率影響顯著，且發(fā)現(xiàn)艾葉多糖的最佳提取工藝條件為：溶劑體積分?jǐn)?shù)為50%、固液比l : 30（g : mL）、萃取壓力0.9 MPa、萃取時(shí)間40 min、萃取溫度120℃。在此條件下，多糖的提取率為6.82%。

1.2.2 艾葉多糖的純化沈霞[15]用多種方法進(jìn)行脫色對(duì)比，發(fā)現(xiàn)最佳脫色方法是ADS-7靜態(tài)吸附法，基于單因素試驗(yàn)的響應(yīng)面法對(duì)艾葉多糖的ADS-7靜態(tài)吸附法工藝進(jìn)行了優(yōu)化，獲得其最佳工藝條件為：溫度40 ℃，吸附3 h，在此條件下，多糖得率為0.25%。

1.3 艾葉多糖的結(jié)構(gòu)表征

艾葉多糖的結(jié)構(gòu)一般含有支鏈且結(jié)構(gòu)相對(duì)比較復(fù)雜，相對(duì)分子質(zhì)量也大，故對(duì)其分析較困難。在進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征時(shí)，需先使用酸水解法等將多糖分解成相對(duì)分子質(zhì)量較小的多糖或寡糖，才可進(jìn)行色譜光譜聯(lián)用分析以確定其單糖組成、糖苷鍵的類(lèi)型和位置。純度測(cè)定也是多糖分析的基本項(xiàng)目之一[15]，經(jīng)純度確定的艾葉純化多糖，可進(jìn)行藥理或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

1.4 艾葉多糖的含量測(cè)定

艾葉多糖的含量測(cè)定方法有硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法[15]，其中硫酸-苯酚法測(cè)定方法中所用的苯酚需要重蒸，實(shí)驗(yàn)操作不安全，故常用硫酸-蒽酮法來(lái)測(cè)定艾葉多糖的含量。艾葉多糖的分析流程見(jiàn)表1。

表 1 艾葉多糖的分析流程Table 1 Analytical procedures of polysaccharides from Artemisia argyi Levl. et Vant.

2 黃酮類(lèi)化合物

黃酮類(lèi)化合物在多種植物中廣泛存在，是一類(lèi)重要的天然有機(jī)化合物，也是中藥中一類(lèi)含量較高的有效成分，據(jù)統(tǒng)計(jì)，艾葉的藥理活性主要有：治療和預(yù)防心血管疾病的發(fā)生、抗肝臟毒性、抗炎、抗菌、抗病毒及解痙等[16]。

目前已經(jīng)報(bào)道的蒿屬中有降糖活性的黃酮類(lèi)化合物包括香茅醇（1）、異鼠李素（2）、槲皮素（3）、金絲桃苷（4）、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（5）、異鼠李素-3-O-生物堿（6）、蒙花苷（7）、木犀草素（8）、芹菜素（9）、異澤蘭黃素（10）、素柚皮素（11）和合金歡（12）[17-19]。

2.1 黃酮類(lèi)化合物的降血糖作用機(jī)制

2.1.1 延緩葡萄糖吸收糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性疾病，2型糖尿病的常見(jiàn)治療手段是降低餐后血糖值?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，艾葉中的黃酮類(lèi)化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶等糖苷酶具有一定的抑制活性[20]。α-葡萄糖苷酶抑制劑是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，其是通過(guò)抑制小腸上皮刷狀緣上的葡萄糖苷酶的活性，抑制多糖、雙糖等向葡萄糖轉(zhuǎn)化，減少小腸對(duì)葡萄糖的吸收從而降低血糖[21]。

Anaya-Eugenio等[19]為了研究蒿屬植物茵陳蒿中的降血糖活性成分，對(duì)有機(jī)提取物、浸漬物和精油3個(gè)提取部位進(jìn)行了葡萄糖耐量和淀粉糖耐量的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示其中浸漬物提取部位是3個(gè)部分中活性最好的，進(jìn)一步對(duì)其中的有效成分進(jìn)行了分離，得到了異澤蘭黃素和棕矢車(chē)菊素等5個(gè)化合物，通過(guò)體外α-葡萄糖苷酶的活性抑制實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了這些化合物的降血糖活性。

2.1.2 改善胰島素抵抗胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指胰島素從分泌到發(fā)揮效應(yīng)的過(guò)程中，在受體前、受體和受體后任何一處缺陷均造成的一種現(xiàn)象，IR是許多代謝類(lèi)疾病如糖尿病、冠心病等[20]的誘因。Santana等[22]發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)化合物有降血糖活性，其作用機(jī)制是：在胰島素敏感性組織中通過(guò)各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑來(lái)調(diào)節(jié)碳水化合物的消化、胰島素分泌和葡萄糖攝取，從而呈現(xiàn)良好的降糖和改善IR的作用。

2.2 黃酮的提取與純化

陳瑤等[23]利用酶法輔助的方法提取得到泥蒿中的總黃酮部分，并利用單因素分析的方法對(duì)其中的4個(gè)變量進(jìn)行了分析，包括纖維素酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)（B）、料液比（C）和提取溫度（D），由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，其最佳提取工藝為：A=3%、B=40%、C=1 : 10、D=50 ℃，在此工藝下可得到4.12%的總黃酮。

衛(wèi)星星等[24]用艾葉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用索氏提取法對(duì)艾葉進(jìn)行提取，以艾葉中總黃酮的含量為指標(biāo)，用單因素分析的方法對(duì)提取溶劑、提取時(shí)間、提取溫度和料液比進(jìn)行了摸索，結(jié)果顯示其最佳提取條件為：提取溶劑為70%乙醇，提取時(shí)間為3 h，溫度為80 ℃，料液比為1 : 35（g : mL），在此條件下總黃酮提取率達(dá)3.85%。以上結(jié)果證明：用索氏提取法對(duì)艾葉進(jìn)行總黃酮的提取是一種操作簡(jiǎn)便、低成本的方法，值得開(kāi)發(fā)和利用。

另?yè)?jù)報(bào)道，總黃酮還可以用大孔樹(shù)脂吸附方法[25]、超聲波輔助提取法[26]等獲得。

2.3 總黃酮的含量測(cè)定

總黃酮的含量測(cè)定方法常見(jiàn)的有紫外-可見(jiàn)分光光度法[27]，目前藥典中所用的也是此種方法。

2.4 黃酮的分離純化方法

蒿屬植物中黃酮類(lèi)化合物的分離純化方法有：柱色譜法、薄層色譜法[28]、高效液相法（HPLC）、大孔樹(shù)脂吸附法[29]。

3 綠原酸類(lèi)化合物

綠原酸（chlorogenic acids）又名咖啡鞣酸，屬于酚類(lèi)化合物，主要存在于菊科蒿屬植物中[30]，是植物細(xì)胞在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)磷酸戊糖途徑（hexose monophosphate，HMS）的中間產(chǎn)物合成的一種苯丙素類(lèi)物質(zhì)。綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抑菌、抗氧化等多種藥理活性[31-32]。目前已報(bào)道的蒿屬植物中有降糖活性的綠原酸類(lèi)化合物有1，5-二咖啡酰奎寧酸（13）、3，4-二咖啡酰奎寧酸（14）、3，5-二咖啡?？鼘幩幔?5）、3，5-二咖啡?？鼘幩峒柞ィ?6）、4，5-二咖啡?？鼘幩幔?7）和3-咖啡?？鼘幩幔?8）[17]。

3.1 綠原酸的降血糖作用機(jī)制

Islam等[17]為了探明12種蒿屬植物的降血糖成分，對(duì)其進(jìn)行了甲醇提取，并對(duì)甲醇提取物進(jìn)行了α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)和蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）抑制實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)茵陳顯示出最強(qiáng)的抑制活性。隨后，他們對(duì)茵陳全草進(jìn)行了甲醇提取，用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，得到4個(gè)萃取部位，并進(jìn)行了α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)和PTP1B抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示除了水部位外，其他萃取部位均有抑制活性，于是對(duì)這些部位進(jìn)行了分離提取，共得到25個(gè)化合物，分別是10個(gè)香豆素類(lèi)化合物、8個(gè)黃酮類(lèi)化合物、6個(gè)咖啡?？鼘幩犷?lèi)化合物和1個(gè)色原酮。對(duì)這些單體化合物進(jìn)行了上述抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：1，5-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡酰奎寧酸和3，5-二咖啡?？崴峒柞サ?種綠原酸類(lèi)化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性[IC50分別為（146.06±0.07）、（128.07±5.45）、（80.95±4.10）μmoL · L-1]均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥阿卡波糖 [IC50=（187.34±3.31）μmoL · L-1]，結(jié)果表明綠原酸類(lèi)化合物通過(guò)抑制小腸中α-葡萄糖苷酶的活性，從而延緩了葡萄糖的轉(zhuǎn)化，使葡萄糖含量降低。

3.2 綠原酸類(lèi)化合物的提取與純化

綠原酸類(lèi)化合物的提取有多種方法，傳統(tǒng)的提取方法有：水提法、醇提法、乙酸乙酯提取法、超聲波輔助提取法、水提醇沉法、殼聚糖絮凝劑吸附法、大孔樹(shù)脂吸附法等；新型的提取方法有：超聲微波雙輔助、分子印跡法、高速逆流法、膜分離技術(shù)、酶解法等[32-33]。其中，水提醇沉法應(yīng)用最廣泛，在提取茵陳時(shí)，使用70%的乙醇所得綠原酸的含量最高；在工業(yè)中多用殼聚糖絮凝劑吸附法，原因是殼聚糖易降解、安全環(huán)保；與傳統(tǒng)的分離純化方法相比，新型的方法具有操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性高、分離快速、價(jià)格低廉等顯著優(yōu)點(diǎn)。

4 其他成分

除了上述化學(xué)成分外，蒿屬植物中還存在一些其他具有降血糖活性的化學(xué)成分，如香豆素類(lèi)化合物：東莨菪內(nèi)酯（19）[17]、傘形花內(nèi)酯（20）[17]、7-甲氧基香豆素（21）[17]、瑞香素（22）[17]、6-甲氧基青蒿素C（23）[17]和濱蒿內(nèi)酯（24）[34]；酚類(lèi)化合物：原兒茶酸（25）[35]、原兒茶素（26）[35]、青蒿素（27）[19]、salvinine（28）[19]和鼠尾草酚（29）[36]；其他類(lèi)成分：茵陳青霉素（30）[37]、茵陳蒿素（31）[37]。這些化合物的降血糖機(jī)制都是通過(guò)抑制小腸中α-葡萄糖苷酶的活性，從而延緩了葡萄糖的轉(zhuǎn)化，使葡萄糖含量降低，起到了降血糖的作用。

5 結(jié)語(yǔ)

目前，糖尿病已成為最受全球關(guān)注的病癥之一，鑒于高血糖是糖尿病的主要特征且是引起心血管疾病的重要因素，因此有必要開(kāi)發(fā)價(jià)廉、高效、低毒的降血糖新藥。蒿屬植物在我國(guó)分布廣泛，資源易得，故蒿屬植物來(lái)源的新型天然降血糖藥物具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。本文主要綜述了蒿屬植物中具有降血糖活性的多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、綠原酸類(lèi)等化學(xué)成分，以及它們的相關(guān)降血糖活性機(jī)制。其中降血糖機(jī)制主要包括：1）通過(guò)增加肝糖原和改善糖耐量；2）抑制α-葡萄糖苷酶的活性，進(jìn)而減少對(duì)葡萄糖的吸收；3）調(diào)節(jié)AMPK信號(hào)通路，改善IR。然而，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蒿屬植物的降血糖機(jī)制研究尚不夠徹底、系統(tǒng)，故有必要對(duì)蒿屬植物中活性成分的降血糖機(jī)制進(jìn)行深入研究，以進(jìn)一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為尋找新的天然降血糖成分提供科學(xué)依據(jù)，且這一研究也將具有廣闊的應(yīng)用前景。