膜聯(lián)蛋白A5在疾病診斷與新藥開發(fā)中的應(yīng)用前景

高夢月 ，黃張建，華子春 ,

（1. 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210023；2. 江蘇省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，常州南京大學(xué)高新技術(shù)研究院，江蘇 常州213164；3. 中國藥科大學(xué)新藥研究中心 天然藥物活性與組分藥效國家重點實驗室 江蘇省代謝性疾病藥物重點實驗室，江蘇 南京210008；4. 南京大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳518057）

膜聯(lián)蛋白是一類廣泛分布的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，該蛋白家族能結(jié)合鈣離子，并能在鈣離子條件下與磷脂結(jié)合[1]?；诜肿酉到y(tǒng)發(fā)生學(xué)和比較基因組學(xué)分析，該蛋白家族被統(tǒng)一命名為annexin（縮寫為Anx），其后加上大寫英文字母代表不同種屬：A、B、C、D、E分別代表脊椎動物、無脊椎動物、真菌和粘菌蟲類、植物、原生生物[2]。截至目前，Anx A家族共有12個成員：A1 ～ A11和 A13（A12未 指 定）[3]。 人 AnxA5是Anx眾多成員中首個被結(jié)晶并進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析的蛋白，之后其他一些成員也相繼被結(jié)晶與解析，而這些蛋白都具有基本一致的典型圓盤狀三維結(jié)構(gòu)[4]。

AnxA5廣泛分布于機(jī)體的各種組織細(xì)胞中，具有重要的生理功能。體外研究發(fā)現(xiàn)，AnxA5具有抗磷脂酶、抗凝血、抗激酶、Ca2+通道活性及磷脂結(jié)合等多種功能，但其具體的體內(nèi)功能卻不是很清楚[5]。研究關(guān)注的焦點主要集中于其結(jié)合磷脂的特性，并且這一特性也被認(rèn)為在細(xì)胞中起到了目前尚未被認(rèn)知的關(guān)鍵作用[6]。AnxA5與磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）高度特異性結(jié)合的特性已被應(yīng)用于分子探針和藥物載體等的開發(fā)。結(jié)合流式細(xì)胞分析技術(shù)，AnxA5已成為目前體外檢測細(xì)胞凋亡的理想分子探針，獲得了廣泛的應(yīng)用；而核素標(biāo)記的重組AnxA5也已經(jīng)在動物模型中用于體內(nèi)檢測，并且取得了具有良好前景的研究結(jié)果[7-11]。

1 膜聯(lián)蛋白A5的結(jié)構(gòu)特點

人AnxA5具有典型的圓盤狀三維結(jié)構(gòu)[4]，此圓盤狀結(jié)構(gòu)包含凸面和凹面，凸面含有鈣離子和磷脂結(jié)合位點，凹面則含有蛋白N端頭部和C端末尾。

AnxA5蛋白的重復(fù)結(jié)構(gòu)域Ⅰ/Ⅳ與Ⅱ/Ⅲ分別構(gòu)成核心區(qū)的2個模塊，每個重復(fù)結(jié)構(gòu)域中含有5個α螺旋：螺旋 A、B、D和E以近似圓柱的形狀排列（見圖1），螺旋C（位于凹面）則覆蓋在圓柱之上（見圖1，結(jié)構(gòu)域Ⅲ）。AnxA5的C端核心高度保守，其N端的氨基酸長度在21個氨基酸以下[12]。與C端相比，N端雖然較為短小，但卻對AnxA5的結(jié)構(gòu)排布、整體穩(wěn)定性、特定的功能及分布差異性有重要作用[13]。晶體結(jié)構(gòu)研究表明：AnxA5的N端聯(lián)結(jié)重復(fù)結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅳ，使整個蛋白結(jié)構(gòu)閉合，因此對蛋白凹面的結(jié)構(gòu)排布有影響[13]。

圖 1 人AnxA5蛋白的結(jié)構(gòu)（PDB數(shù)據(jù)庫）Figure 1 The structure of human AnxA5 (PDB database)

2 膜聯(lián)蛋白A5的作用及其機(jī)制

AnxA5主要的功能特征是以鈣依賴的方式與酸性磷脂作用，其諸多體內(nèi)和體外的功能和應(yīng)用都與磷脂（尤其是PS）結(jié)合功能密切相關(guān)。某些疾病或病理過程中會出現(xiàn)明顯的凋亡信號，因而通過檢測凋亡的發(fā)生就可以達(dá)到檢測這些疾病的目的，例如檢測動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）晚期損傷和心臟移植排斥反應(yīng)[14]。AnxA5應(yīng)用于心血管類疾病模型治療后，血栓形成受到抑制，血管功能有所改善，這與AnxA5競爭結(jié)合血小板表面的PS形成屏蔽層進(jìn)而抑制其觸發(fā)后續(xù)血栓形成的功能有關(guān)[15]。腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面通常會暴露有PS，因而利用AnxA5靶向PS的功能可以定向輸送治療藥物或前體藥物分解酶到達(dá)腫瘤位置，提高藥效，降低毒副作用[16]。此外，AnxA5能夠介導(dǎo)內(nèi)吞作用而增強(qiáng)關(guān)聯(lián)脂質(zhì)體包裹的藥物跨生物學(xué)屏障輸送[17]。

2.1 凋亡檢測探針

截至目前，Anx蛋白最廣泛的應(yīng)用是檢測細(xì)胞凋亡，其中以人AnxA5為主，并且已有多種相關(guān)商品化產(chǎn)品提供。細(xì)胞凋亡時，原本位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的PS會翻轉(zhuǎn)至膜表面，這可以作為凋亡細(xì)胞的標(biāo)志物。AnxA5能以鈣依賴的方式與凋亡細(xì)胞表面的PS高親和力結(jié)合，從而標(biāo)記凋亡細(xì)胞；如果用熒光標(biāo)記的AnxA5和碘化丙啶（propidium iodide，PI）標(biāo)記細(xì)胞，就可以應(yīng)用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)檢測區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（見圖2）。其中，熒光標(biāo)記AnxA5的方法包括融合熒光蛋白（如EGFP）和化學(xué)偶聯(lián)熒光素。

2.2 抗腫瘤

腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞通過表面暴露的PS招募骨髓來源的抑制性細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞以及產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子，促進(jìn)了免疫抑制微環(huán)境的產(chǎn)生，使腫瘤逃過了免疫系統(tǒng)的殺傷作用。靶向PS抗體的應(yīng)用則可以通過多種機(jī)制抑制腫瘤生長，如摧毀腫瘤血管，封閉PS介導(dǎo)的免疫抑制，重新激活M1巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞成熟和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[18]。因此，設(shè)計靶向腫瘤細(xì)胞PS的藥物或制劑可發(fā)揮直接或間接的腫瘤殺傷效應(yīng)。從目前的研究來看，殺傷腫瘤主要是藥物直接殺傷腫瘤，或造成不利于腫瘤生長的環(huán)境如切斷腫瘤血液供應(yīng)，或激活某些情況下免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用。借助于AnxA5高親和力結(jié)合PS的特點，其已成功應(yīng)用于靶向腫瘤細(xì)胞，如通過融合AnxA5和TRAIL蛋白（形成A5-TRAIL）后，借助AnxA5靶向PS定位到腫瘤部位，TRAIL蛋白則發(fā)揮殺傷作用，表現(xiàn)為TRAIL的殺傷效果增強(qiáng)[19]；類似的研究還有將阿霉素與AnxA5進(jìn)行偶聯(lián)發(fā)揮阿霉素定向殺傷作用[16]；或者通過融合AnxA5與藥物前體分解酶，使前體藥物定點在腫瘤部位分解成活性藥物，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[20]。此外，研究表明：AnxA5本身還可以發(fā)揮抑制腫瘤的效應(yīng)，潛在機(jī)制可能是AnxA5靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的PS，抑制血管新生，切斷腫瘤血液供應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤壞死。AnxA5封閉了腫瘤細(xì)胞表面的PS后，還可以增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫，從而促進(jìn)腫瘤殺傷效應(yīng)[21]。

圖 2 AnxA5蛋白檢測細(xì)胞凋亡的原理Figure 2 The principle of apoptosis detection using AnxA5 probes

2.3 抗凝血

活化的血小板是凝血級聯(lián)反應(yīng)過程中的重要因素，其膜表面會暴露Anx蛋白偏愛結(jié)合的PS，而AnxA5能夠與PS結(jié)合（見圖3），并在膜上形成二維屏蔽層，有效地將PS這一促凝因素與其他相關(guān)促凝因子隔離開來[22]；AnxA5還可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的凝血酶形成，從而起到抗凝血作用[23]。另外，AnxA5還能與硫苷脂（血小板表面的一種鞘糖脂）結(jié)合，抑制硫苷脂激活凝血因子Ⅻ，發(fā)揮抗凝作用[24]。體外實驗表明AnxA5能夠屏蔽PS，對凝血級聯(lián)反應(yīng)過程中的多種因素具有抑制作用。

圖 3 膜聯(lián)蛋白A5結(jié)合血小板表面的磷脂酰絲氨酸Figure 3 The binding of AnxA5 with PS exposed on the surface of activated platelet

AnxA5的血栓抑制效應(yīng)來源于其鈣依賴地結(jié)合磷脂，而后磷脂將不能發(fā)揮激活凝血因子Ⅹ和凝血酶原的作用，因而纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白的過程受到抑制[25]；另外，AnxA5結(jié)合磷脂后，可以避免磷脂酶A2與磷脂結(jié)合，抑制后續(xù)炎癥性脂質(zhì)介質(zhì)的產(chǎn)生，從而抑制炎性過程發(fā)生，這一作用與血栓清除時間的縮短可能也有關(guān)系[26]。

2.4 抗炎癥

AnxA5具有抗炎效果，其能夠減少小鼠炎癥部位中性粒細(xì)胞的聚集，抑制炎癥位點磷脂酶A2的活性，減少類花生酸的產(chǎn)生。AnxA5應(yīng)用于小鼠動脈粥樣硬化模型時，小鼠的局部血管炎癥、系統(tǒng)性炎癥和血管重塑都有所減輕，血管功能有所改善[27]；AnxA5還能夠降低病變部位的斑塊炎癥，涉及的機(jī)制包括干擾單核細(xì)胞在炎癥病變部位的招募和激活，可能還與AnxA5的抗凝血功能有關(guān)，原因是AnxA5能夠抑制凝血酶形成，而凝血酶有促炎和促AS效應(yīng)[27]。其磷脂（尤其是PS）結(jié)合功能在抗炎活性中都有重要作用，主要歸結(jié)于Anx蛋白結(jié)合PS后，減少了PS與炎癥相關(guān)細(xì)胞或其他成分的接觸，從而降低炎癥反應(yīng)[28]。此外，近年來有研究表明，AnxA5能夠抑制脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，可能的潛在機(jī)制是AnxA5直接結(jié)合LPS或競爭結(jié)合LPS的受體TLR4/MD2[29]。

3 膜聯(lián)蛋白A5的臨床應(yīng)用及新藥研發(fā)

3.1 膜聯(lián)蛋白A5作為活體凋亡檢測探針

研究細(xì)胞凋亡的方式有多種，主要分為體外和體內(nèi)2種檢測方法。體外檢測方法包括末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）技術(shù)、流式細(xì)胞分析、酶聯(lián)免疫吸附法、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白檢測等，雖然這些技術(shù)較為成熟，但在取材時存在一定的有創(chuàng)性（組織活檢），且只能離體觀察，因此在臨床應(yīng)用時受到一定的限制。體內(nèi)凋亡顯像技術(shù)具有安全、早期、靈敏、特異、無創(chuàng)傷的特點，因而臨床應(yīng)用前景良好。

人AnxA5最有可能的臨床應(yīng)用是作為活體凋亡的檢測探針，細(xì)胞凋亡的活體成像可以提供一個強(qiáng)有力的工具來研究新型細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)療法的療效。例如，在實體腫瘤中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的新型抗腫瘤化合物的療效可以通過腫瘤攝取的放射性標(biāo)記的AnxA5的成像來評估。另外，細(xì)胞凋亡成像也有助于評估細(xì)胞死亡抑制化合物在細(xì)胞過度凋亡相關(guān)疾病中的作用，如：缺血性卒中、心肌梗死和阿爾茨海默病。臨床常用的是放射性核素標(biāo)記AnxA5蛋白，并且已有的研究工作對各種放射性標(biāo)記的AnxA5探針進(jìn)行了系統(tǒng)的綜述，包括物理半衰期以及探針的優(yōu)勢和劣勢，諸如探針標(biāo)記過程的簡易程度、成本、背景信號、造影效果、體內(nèi)生物分布等[30]。

在分子成像中，PS已被用作AnxA5分子探針在凋亡成像技術(shù)中的分子靶點，99m锝（99mTc）-AnxA5、18F-N-[2-(氟-苯甲酰氨基）乙基]馬來酰亞胺（N-[2-(4- fl uoro-benzamido)ethyl]maleimide，F(xiàn)BEM）-半 胱 氨酸（Cys）-AnxA5（見圖4[8]）等均可用于體內(nèi)細(xì)胞凋亡的檢測。重組人99mTc-AnxA5已在歐美19家大學(xué)及臨床研究單位開展臨床試驗，用于無創(chuàng)評估體內(nèi)細(xì)胞異常凋亡。AnxA5探針已被廣泛用于單光子發(fā)射計算機(jī)斷層成像術(shù)（single-photon emission computed tomography，SPECT）或正電子發(fā)射斷層成像術(shù)（positron emission computed tomography，PET）成像[31]，聯(lián)用磁性納米粒子和釓（Gd）-脂質(zhì)體進(jìn)行磁共振（magnetic resonance，MR）成像[32]，以及用熒光標(biāo)記進(jìn)行光學(xué)成像。人體試驗顯示：在腫瘤治療中，治療導(dǎo)致的AnxA5攝取變化可以預(yù)測治療應(yīng)答情況。對急性腦卒中患者進(jìn)行重組（rh）- AnxA5的MR成像檢查，結(jié)果顯示：血管病變的模式與rh-AnxA5攝取增加一致，而且臨床癥狀與rh- AnxA5的攝取程度相關(guān)性更好[25]?？肆_恩?。–rohn’s disease, CD）患者的初步數(shù)據(jù)也證明放射性標(biāo)記的AnxA5可用于監(jiān)測抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）抗體治療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[33]：在5例接受治療的患者中，早在治療后24 h即可在結(jié)腸炎區(qū)域檢測到AnxA5攝取增加。定量99mTc-AnxA5成像使用放射性標(biāo)記的人AnxA5用于凋亡的可視化檢測。該成像可用于癌癥治療前后細(xì)胞凋亡的客觀評估，正在被廣泛研究，因此AnxA5可以用作治療應(yīng)答的臨床成像標(biāo)志物[34]。g

圖 4 18F-FBEM-Cys-AnxA5在存在凋亡的大鼠模型中的成像Figure 4 Apoptosis imaging in rat model using 18F-FBEMCys-AnxA5

檢測腫瘤細(xì)胞凋亡可能有助于確定腫瘤的惡性程度和患者預(yù)后的情況[35]，使用帶有標(biāo)記的AnxA5的腫瘤分子影像技術(shù)可以提供關(guān)于腫瘤的生物學(xué)信息并指導(dǎo)臨床決策。頭頸癌患者經(jīng)過化療后，注射99mTc-AnxA5并進(jìn)行體內(nèi)成像檢測，結(jié)果表明腫瘤部位有特異的凋亡反應(yīng)[36]。心臟移植后，對移植物強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)過程中，心肌細(xì)胞會有凋亡的發(fā)生，給不同程度排斥的病人注射99mTc-AnxA5蛋白進(jìn)行體內(nèi)檢測，結(jié)果顯示99mTc-AnxA5蛋白耐受性良好，可辨別急性心臟排斥的病人[37]。AnxA5結(jié)合的納米粒子（nanobubbles，NBs），即AnxA5-NBs 可用于體內(nèi)細(xì)胞凋亡的成像，因而可能成為早期監(jiān)測癌癥治療效果的有效手段[38]。這種凋亡檢測方法以非侵入性的方式評價化療或放療效果等，有助于減少病人痛苦。

AS的病因很多，如肥胖、高血脂癥和糖尿病等，截至目前，其診斷和治療仍然需要改進(jìn)對易損性AS斑塊的評估方法，特別是在制定新的靶點和策略時[17]。AS中斑塊破裂是心肌梗死和缺血性腦血管意外的共同誘因，因而檢測易損斑塊在臨床上對早期治療的評價具有重要意義。斑塊易損的重要成因是細(xì)胞凋亡和炎癥，其凋亡和炎癥信號比較強(qiáng)，因此可通過檢測炎癥和凋亡來檢測易損斑塊。99mTc-AnxA5蛋白體內(nèi)造影顯示其在AS損傷處聚集，并且聚集處的攝取水平與油紅O染色打分相關(guān)；另外，AnxA5在晚期損傷和早期損傷的攝取比值高于氟代脫氧葡萄糖（18F-FDG）（用于指示炎癥細(xì)胞代謝程度增加），這些表明99mTc-AnxA5蛋白可指示晚期損傷或易損斑塊的轉(zhuǎn)換[39]。99mTc-AnxA5蛋白被應(yīng)用于多種臨床模型的凋亡示蹤檢測，成功證明該非侵入性探針應(yīng)用于凋亡可視化、鑒定和定量的可行性。在99mTc-金 納 米 粒 子（GNPs）-AnxA5 SPECT/CT成 像與相關(guān)成像模式的比較中，表現(xiàn)出體內(nèi)示蹤劑攝取的高效率和特異性[40]。納米粒子99mTc-GNPs-AnxA5具有增強(qiáng)示蹤劑攝取效率和增加凋亡巨噬細(xì)胞特異性的潛力，從而反映AS斑塊的易損性[40]。AnxA5修飾和99mTc標(biāo)記的納米粒子系統(tǒng)能夠特異性靶向含有凋亡巨噬細(xì)胞的易損AS斑塊，其對通過SPECT/CT非侵入性檢測脆弱的AS斑塊具有非常重要的價值[41]。

3.2 膜聯(lián)蛋白A5作為治療藥物和疾病標(biāo)志物

3.2.1 作為治療藥物AnxA5可以用于疾病治療，如治療心血管類疾病或炎癥。Annexin Pharmaceuticals生物技術(shù)公司正在開發(fā)新的療法治療炎癥性心血管疾病，該療法基于AnxA5的抗炎癥特性和抗心血管疾病發(fā)病機(jī)制的功能。目前該公司主要致力于外周動脈疾病的治療研究，并在多個國家申請相關(guān)專利。

體內(nèi)研究表明AnxA5具有較好的抗栓功能。眼內(nèi)手術(shù)后會出現(xiàn)血栓，注射AnxA5后，眼內(nèi)血栓形成受到抑制，血栓清除時間縮短[25]。AnxA5可以治療或緩解AS等心血管類疾病。例如，給予AnxA5治療后，AS模型小鼠的斑塊炎癥減少[42]，高膽固醇血癥小鼠的炎癥介導(dǎo)的血管重塑降低、血管功能有所改善，模型小鼠的血栓形成受到抑制、血栓清除時間縮短[25]。AnxA5對多種動物模型具有多方面的治療或緩解功能，這些功能與AnxA5結(jié)合PS的性質(zhì)密切相關(guān)。

此外，AnxA5還能抑制腫瘤生長，主要機(jī)制可能是靶向PS。研究發(fā)現(xiàn)，分別給小鼠注射分泌AnxA5的成神經(jīng)瘤細(xì)胞和正常瘤細(xì)胞，注射前者的小鼠的腫瘤生長受到抑制，主要機(jī)制是腫瘤細(xì)胞表面暴露有PS，偽裝成凋亡細(xì)胞，逃脫了免疫系統(tǒng)的識別和殺傷，而AnxA5能結(jié)合并封閉腫瘤細(xì)胞表面的PS，增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫，抑制腫瘤生長[43]。最新的研究表明，直接給黑色素瘤小鼠注射AnxA5，其腫瘤生長也受到明顯抑制，提示AnxA5能夠靶向腫瘤血管PS，通過下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子抑制血管新生，切斷腫瘤血液供應(yīng)，從而起到抑制腫瘤生長的效果[20]。

3.2.2 作為疾病標(biāo)志物研究發(fā)現(xiàn)，AnxA5可以作為腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移和浸潤的標(biāo)志物，對腫瘤還具有診斷、預(yù)后和治療方面的意義[44]。結(jié)腸癌患者癌組織中AnxA5的mRNA和蛋白水平都高于正常組織，并且AnxA5的表達(dá)與腫瘤分期及較差的預(yù)后相關(guān)，提示AnxA5可以作為腫瘤發(fā)展的預(yù)后指標(biāo)[45]。肝癌患者外周血、癌組織[46]，宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者血清中的AnxA5蛋白水平也比正常人高[47]，提示AnxA5可以作為肝癌和宮頸鱗狀細(xì)胞癌的診斷標(biāo)志物。

此外，AnxA5也與自身免疫性疾病有關(guān)。體內(nèi)AnxA5水平不穩(wěn)定或其功能的紊亂，則會造成凝血功能方面的問題。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）和抗磷脂綜合征（antiphospholipid syndrome, APS）患者血液系統(tǒng)中AnxA5水平不穩(wěn)定及其功能出現(xiàn)紊亂，與SLE和APS患者凝血功能的紊亂具有相關(guān)性[48]，同時也可作為這2種疾病的重要生物標(biāo)志物。SLE和APS患者體內(nèi)AnxA5抗體的存在干擾了其抗凝功能，抗凝活性顯著降低[48]；而抗磷脂抗體和識別β2-糖蛋白Ⅰ結(jié)構(gòu)域Ⅰ的抗體的存在，對AnxA5的抗凝活性也有破壞作用[48]。

類似研究還表明，阿爾茨海默病和路易體癡呆患者的血漿AnxA5水平顯著高于正常人，提示AnxA5可能作為這2種疾病的生物標(biāo)志物[49]。類似的研究還有很多，但這些研究仍然都停留在實驗水平，且尚無證據(jù)表明AnxA5蛋白的紊亂與疾病直接相關(guān)，因此，AnxA5能否作為疾病診斷或預(yù)后標(biāo)志物，還有待進(jìn)一步研究。

3.3 膜聯(lián)蛋白A5介導(dǎo)的靶向療法和藥物輸送

前體藥物本身無生物活性或活性較低，進(jìn)入體內(nèi)被代謝后可形成具有活性的藥物，進(jìn)而發(fā)揮藥效[50]。5-氟尿嘧啶（5- fl uorouracil，5-FU）常用于實體瘤的治療，但是存在骨髓抑制的副作用，因此，研究人員利用靶向技術(shù)使胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase，CD）在腫瘤部位催化前藥5-氟胞嘧啶（5- fl uorocytosine，5-FC）形成5-FU，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，減少全身應(yīng)用帶來的副作用。腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面暴露有PS，根據(jù)AnxA5靶向PS的特點，研究人員設(shè)計出A5-CD融合蛋白，構(gòu)建了以AnxA5介導(dǎo)的靶向腫瘤細(xì)胞的CD前體藥物療法。體外實驗表明：融合蛋白與5-FC聯(lián)用后，對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒活性，但結(jié)果尚待后續(xù)體內(nèi)實驗驗證[51]。此外，有研究將阿霉素與AnxA5偶聯(lián)，其腫瘤殺傷作用強(qiáng)于兩者單獨應(yīng)用時的效果，推斷其可能通過結(jié)合PS靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)了阿霉素的抗腫瘤效果[52]。

脂質(zhì)納米載體可通過4種方式與細(xì)胞作用：穩(wěn)定吸附、內(nèi)吞、融合和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運；脂質(zhì)體可以有效啟動角膜的轉(zhuǎn)胞吞作用，向眼球后段輸送治療藥物[53]。AnxA5蛋白與含PS的膜結(jié)合后，可以在膜表面形成高度有序的結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)形成非actin依賴的內(nèi)吞作用囊泡[54]?；谝陨闲畔ⅲ芯空咴O(shè)計了含PS的磷脂囊泡，其內(nèi)包裹藥物Avastin，分別在有或無AnxA5的條件下，給大鼠和兔進(jìn)行眼部滴注，結(jié)果顯示AnxA5蛋白能夠增強(qiáng)關(guān)聯(lián)的脂質(zhì)囊泡跨生物學(xué)屏障輸送藥物；體外實驗也證實AnxA5蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用可以增強(qiáng)藥物輸送[55]。

3.4 以膜聯(lián)蛋白A5為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)工程新藥研發(fā)

野生型AnxA5先后被用于進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞凋亡顯像[36,38]、膿毒血癥治療[29]以及抑制腫瘤生長[45-46]。利用AnxA5與PS特異性結(jié)合的特性，多種AnxA5變體被研制開發(fā)出來，較為突出的代表為：AnxA5同源二聚體Diannexin被批準(zhǔn)Ⅲ期臨床試驗，用于缺血再灌注中對移植器官的保護(hù)[56]；AnxA5與蛋白酶抑制劑Kunitz構(gòu)成的融合蛋白AnxA5-6L15作為心肌缺血-再灌注損傷候選治療藥物[45]；組織因子胞外結(jié)構(gòu)域sTF與AnxA5構(gòu)成的融合蛋白在低、高濃度時分別發(fā)揮促凝和抗凝的雙重作用[57]；AnxA5與纖溶酶原激活劑Pro-UK及其B鏈構(gòu)成的Prourokinase-AnxA5融合蛋白可將纖溶酶原激活劑靶向含磷脂的血栓[58]；AnxA5與水蛭血小板糖蛋白抑制劑Decorsin融合而成的AnxA5-Decorsin融合蛋白具有較好的抗凝活性[59]；AnxA5與嘌呤核苷磷酸化酶PNP構(gòu)成的融合蛋白用于乳腺癌靶向治療[60]；AnxA5與胞嘧啶脫氨酶構(gòu)成的融合蛋白用于前藥5-FC的乳腺癌靶向治療[51]；阿霉素-AnxA5偶聯(lián)物對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231具有更高的殺傷作用[15]；AnxA5-TRAIL融合蛋白TP8能對多種類型的細(xì)胞凋亡抵抗的腫瘤細(xì)胞及其動物模型具有強(qiáng)大的抗腫瘤療效[16]。經(jīng)改造的AnxA5變體TP5-3具有體內(nèi)低背景、高細(xì)胞凋亡特異性，其體內(nèi)監(jiān)測細(xì)胞凋亡性能顯著好于野生型AnxA5[61]；將AnxA5經(jīng)過蛋白質(zhì)工程改造成為靶向抗血栓新藥rHAP，rHAP在多種血栓動物模型上均表現(xiàn)出血栓靶向性好、抗栓作用顯著、出血副作用低等特點，明顯優(yōu)于現(xiàn)有臨床一線抗凝藥物，目前已完成臨床前研究，而且該藥物還具有治療子癇前期癥狀的療效[62]。

4 以膜聯(lián)蛋白A5為基礎(chǔ)的新藥研發(fā)的局限性及其應(yīng)用前景

不論是用于活體凋亡檢測還是治療，AnxA5的安全性問題都無法回避。相比于治療用途，用于活體凋亡檢測的AnxA5劑量和頻率相對較低，可能其對機(jī)體影響還不是很大。但是，用于長期治療時，就得考慮其毒副作用，毒副作用來源于兩方面，其一是AnxA5生產(chǎn)工藝方面，其二是蛋白本身生物學(xué)活性所致，前者可以通過質(zhì)控過程解決，后者則需要從蛋白本身入手加以解決。二聚體A5蛋白Diannexin蛋白相對分子質(zhì)量增加，與PS親和力提高，清除半衰期延長，抑制血栓等藥效時間延長[63]；但是，同時值得注意的是高濃度Diannexin蛋白應(yīng)用時，實驗動物失血增多，可能是蛋白對凝血的過度抑制引起凝血障礙所致[64]。AnxA5的SPECT造影是最常用的凋亡細(xì)胞造影的核醫(yī)學(xué)技術(shù)，尤其是99mTc-AnxA5蛋白探針。但對AnxA5探針的放射性標(biāo)記過程、造影獲取方法、造影時間、造影數(shù)據(jù)處理方法和解釋標(biāo)準(zhǔn)是將放射性標(biāo)記的AnxA5探針作為臨床常規(guī)技術(shù)前需要解決的關(guān)鍵問題[65]。

AnxA5作為體內(nèi)診斷和治療工具，需要在以下幾個方面改進(jìn)[66]：1）開發(fā)新的適用于PET成像的AnxA5蛋白探針，以增強(qiáng)造影分辨率，另外從成本角度考慮，可以將68Ga[67]和18F[68]標(biāo)記作為候選；2）進(jìn)行臨床試驗以獲取放射性標(biāo)記的A5蛋白治療評價的額外信息；3）改善放射性標(biāo)記A5蛋白的生物學(xué)分布，99mTc標(biāo)記的AnxA5在肝和腎的攝取偏高影響了造影效果，而構(gòu)建含內(nèi)源性99mTc標(biāo)記位點的AnxA5，再進(jìn)行標(biāo)記、造影時，其目標(biāo)/背景信號比值改善，肝腎脾攝取減少；4）調(diào)整注射放射性標(biāo)記的AnxA5和造影之間的時間范圍；5）AnxA5體內(nèi)造影以評價放療或化療效果；6）開發(fā)帶有AnxA5的PS靶向藥物，借助AnxA5靶向PS及其能夠被細(xì)胞內(nèi)化的特點，以提高療效且降低副作用。