• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    27nt-miRNA對血管平滑肌細(xì)胞SM22α表達(dá)的調(diào)節(jié)及其對細(xì)胞活力、遷移和表型改變的影響*

    2019-02-28 09:09:36陶曉靜顏淵鴛羅雪蘭秦祖杰覃裕旺歐和生
    中國病理生理雜志 2019年2期
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)箱平滑肌表型

    沈 鳳, 楊 鵬, 陶曉靜, 李 丹, 顏淵鴛, 羅雪蘭, 秦祖杰, 覃裕旺△, 歐和生, △

    (1廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 廣西 南寧 530021; 2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院, 廣西 南寧 530001)

    血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是維持血管正常生理功能的重要細(xì)胞。在正常情況下,VSMCs呈非增殖性的收縮型,在血管損傷和一些生物活性物質(zhì)(如一氧化氮產(chǎn)物、血管緊張素Ⅱ和血小板生長因子等)刺激的情況下,VSMCs轉(zhuǎn)化為增殖性的合成表型,合成并分泌血管活性物質(zhì)和生長因子等,并發(fā)生增殖和遷移,從而導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄和血管重構(gòu)。血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是一種重要的促細(xì)胞分裂原,主要有AA、 BB 及AB 3種形式,其中 PDGF-BB 可與 VSMCs 表面的 PDGF-β受體結(jié)合以激活多條信號通路,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換、增殖和遷移。VSMCs表型轉(zhuǎn)換及增殖是高血壓和動脈粥樣硬化等血管增殖性疾病發(fā)生發(fā)展過程的重要因素[1]。

    微小RNAs(microRNAs,miRNAs,miR)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA,它們通過抑制翻譯過程或者促進(jìn)靶目標(biāo)mRNA降解參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、血管生成和腫瘤形成等幾乎所有病理生理過程。近年來發(fā)現(xiàn)miRNAs參與心血管系統(tǒng)疾病的調(diào)控過程,并且在血管重構(gòu)過程發(fā)揮重要作用,如miR-145/143可以抑制VSMCs增殖、促進(jìn)其分化,減少血管新內(nèi)膜的形成[2];而miR-34a通過調(diào)節(jié)Notch表達(dá)水平抑制VSMCs增殖和遷移,并減少內(nèi)膜增生[3]。27nt-miRNA來源于內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)基因第 4 內(nèi)含子中的 27 堿基重復(fù)序列,本課題組前期工作提示27nt-miRNA可能在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,內(nèi)含子源性27nt-miRNA一方面可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移;另一方面,高表達(dá)27nt-miRNA可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞代謝產(chǎn)生和釋放一氧化氮(nitric oxide,NO)[4]。由于NO不僅是調(diào)節(jié)血管舒張功能的重要因子,而且參與VSMCs增殖、遷移和表型改變的調(diào)節(jié)[5],因此,本研究推測27nt-miRNA可能通過對組織特異性基因的表達(dá)調(diào)節(jié),參與VSMCs增殖及其表型改變的調(diào)控過程。為證實這一觀點,本實驗選取大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞為研究對象,構(gòu)建27nt-miRNA慢病毒載體,然后轉(zhuǎn)染VSMCs,檢測VSMCs收縮型標(biāo)志物平滑肌22α蛋白(smooth muscle 22α protein, SM22α)的表達(dá)水平,并觀察VSMCs形態(tài)、細(xì)胞活力和遷移能力的變化。

    材 料 和 方 法

    1 細(xì)胞和試劑

    大鼠原代主動脈血管平滑肌細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司);DMEM培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(Lonsera);胰蛋白酶消化液(Gibco);重組人PDGF-BB (PeproTech);MTT(北京索萊寶科技有限公司);RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI);PCR試劑盒(天根生化科技有限公司);慢病毒載體(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司);兔抗SM22α和GAPDH抗體(Proteintech)。

    2 方法

    2.127nt-miRNA慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定 以eNOS第4內(nèi)含子中27堿基重復(fù)序列5’-GAAGTCTAGACCTGCTGCAGGGGTGAG-3’為根據(jù),設(shè)計miRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu),以Ubi-MCS-BFLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin為載體,經(jīng)AgeI和NheI雙酶切,轉(zhuǎn)染 293FT細(xì)胞,濃縮得到27nt-miRNA高表達(dá)慢病毒載體mimic 27nt-miRNA,同時根據(jù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)建27nt-miRNA反義序列(anti-27nt-miRNA)和陰性對照(negative control,NC)慢病毒載體。病毒載體上含有嘌呤霉素抗性,可用來識別細(xì)胞轉(zhuǎn)染是否成功,加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選,建立穩(wěn)定細(xì)胞株。

    2.2大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 VSMCs用含15%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),放置于37 ℃、5% CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞密度>85%時,傾去培養(yǎng)液,用 PBS洗滌細(xì)胞。加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化,37 ℃放置1~2 min后再加入2 mL含15% FBS的DMEM培養(yǎng)液,吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。按每孔5×105細(xì)胞的濃度接種6孔板,混勻后正常靜置培養(yǎng)24 h。上述3種慢病毒載體以MOI=70感染VSMCs,置于培養(yǎng)箱孵育48 h,在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況,加入嘌呤霉素(8 mg/L)進(jìn)行篩選。實驗分為5組:(1)正常(normal)組:VSMCs正常培養(yǎng);(2)PDGF-BB組:VSMCs加入終濃度為10 μg/L的PDGF-BB;(3)PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組:往成功轉(zhuǎn)染27nt-miRNA過表達(dá)慢病毒載體的細(xì)胞株加入終濃度10 μg/L的PDGF-BB;(4)PDGF-BB+NC組:向成功轉(zhuǎn)染陰性對照慢病毒載體的細(xì)胞株加入10 μg/L的PDGF-BB;(5) PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組:向成功轉(zhuǎn)染anti-27nt-miRNA的細(xì)胞株加入10 μg/L的PDGF-BB。

    2.3MTT法檢測細(xì)胞活力 成功轉(zhuǎn)染后,除正常組外其它4組都加入10 μg/L PDGF-BB,然后取對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔6×103個細(xì)胞接種到96孔板中,放置37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到50%時更換無血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。后加入MTT培養(yǎng)4 h,使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測每孔的吸光度(A)值。

    2.4劃痕實驗檢測各組VSMCs的遷移能力 通過細(xì)胞劃痕實驗檢測27nt-miRNA對VSMCs的遷移能力的影響。各組細(xì)胞接種到48孔板中,每孔2×104個,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞基本達(dá)到100%融合,用200 μL移液槍及槍頭在培養(yǎng)板底部正中位置劃“一”字痕,棄去原有培養(yǎng)基,并用無菌PBS洗去劃落的細(xì)胞及碎片,重復(fù)2~3次。后每孔加入無血清的DMEM培養(yǎng)基200 μL,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培養(yǎng) 0 h和24 h,應(yīng)用倒置電子顯微鏡觀察不同時點細(xì)胞遷移愈合的情況,遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%,實驗重復(fù)3 次,取平均值。

    2.5RT-PCR 檢測細(xì)胞 SM22α的mRNA 表達(dá) 根據(jù)TRIzol 試劑盒說明書提取各組細(xì)胞的總RNA,利用 Primer 5.0 軟件設(shè)計合成引物,SM22α的上游引物序列為5’-CGTGGAGATCCCAACTGGTTTATG-3’, 下游引物序列為5’-CCCTCTGTTGCTGCCCATTTG-3’; GAPDH的上游引物序列為5’-GATGACATCAAGAAGGTGGTGA-3’, 下游引物序列為5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC-3’。分別取各組細(xì)胞RNA 1 μg,加入1 μL(0.5 g/L)Oligo(dT)18Primer,70 ℃變性 5 min后立即放置冰上冷卻;加4 μL 5×Reaction Buffer、1 μL Ribo LockTMRibonuclease Inhibitor(2.0×107U/L)、2 μL dNTP Mix(10 mmol/L),37 ℃溫育5 min,加入1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶,42 ℃ 1 h,后70 ℃ 10 min終止反應(yīng),得到cDNA 第1 鏈。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性 5 min;94℃ 30 s、56℃ 1 min、72 ℃ 1 min,30個循環(huán);最后72 ℃ 5 min,終止反應(yīng)。取 5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

    2.6免疫組化檢測各實驗組SM22α的表達(dá) 將無菌玻片放入 6孔板,將實驗細(xì)胞消化,取細(xì)胞懸液加入6孔板中,每孔加2 mL,搖勻靜置,放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h后取出玻片放于載玻片上,PBS 沖洗 3 次,中性樹膠封片,4%甲醛固定。雙蒸水沖洗 3 次,敷Ⅰ抗、Ⅱ抗后顯色劑顯色。使用顯微鏡觀察、拍照,并計算細(xì)胞陽性率。實驗重復(fù)3 次,取平均值。

    2.7Western blot檢測SM22α蛋白的表達(dá) 將各組細(xì)胞裂解,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取上清。各組分別取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE(10%)分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后加入抗SM22α抗體濕盒過夜(4 ℃)。第2天用TBST沖洗3次,每次10 min,然后加入 II 抗孵育2 h,重復(fù)用TBST沖洗3次,每次10 min。最后利用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR)分析蛋白電泳條帶的灰度值,計算SM22α蛋白的表達(dá)量,以GAPDH為內(nèi)參照,SM22α相對表達(dá)量=SM22α灰度值/GAPDH灰度值。實驗重復(fù)3次,取平均值。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 27nt-miRNA對PDGF誘導(dǎo)VSMCs活力的影響

    細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染后,用MTT法檢測各組細(xì)胞24 h的細(xì)胞活力,結(jié)果顯示,與正常對照組比較,PDGF-BB組的A值明顯升高(P<0.05),提示PDGF可促進(jìn)VSMCs的活力;與PDGF-BB+NC組相比,PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組的A值下降,而PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組的A值升高(P<0.05),提示27nt-miRNA可以抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞活力,見圖1。

    Figure 1.The effect of 27nt-miRNA on the cell viability of VSMCs measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

    圖1MTT實驗檢測27nt-miRNA對VSMCs細(xì)胞活力的影響

    2 27nt-miRNA對PDGF誘導(dǎo)VSMCs遷移的影響

    劃痕實驗檢測各組細(xì)胞遷移能力,PDGF-BB組的遷移率比正常組升高(P<0.05),PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組的遷移率與PDGF-BB+NC組相比則下降(P<0.05),而PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組卻比PDGF-BB+NC組上升(P<0.05),提示27nt-miRNA對PDGF誘導(dǎo)VSMCs遷移起到一定的抑制作用,見圖2。

    Figure 2.The effect of 27nt-miRNA on the migration ability of VSMCs(×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

    圖227nt-miRNA對VSMCs遷移能力的影響

    3 RT-PCR 檢測細(xì)胞 SM22α的mRNA 表達(dá)

    與正常組比較,PDGF-BB組SM22α的mRNA表達(dá)量下降(P<0.05);與PDGF-BB+NC組比較,PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組SM22α的mRNA表達(dá)量提高,而PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組SM22α的mRNA表達(dá)量下降(P<0.05),見圖3。結(jié)果提示27nt-miRNA促進(jìn)SM22α的轉(zhuǎn)錄。

    Figure 3.The effect of 27nt-miRNA on the mRNA expression of SM22α in the VSMCs detected by RT-PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

    圖3RT-PCR檢測27nt-miRNA對SM22αmRNA表達(dá)的影響

    4 免疫組化檢測27nt-miRNA對SM22α表達(dá)的影響

    用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測各組細(xì)胞中的收縮型特異性蛋白SM22α的表達(dá)量,結(jié)果顯示,SM22α蛋白主要在細(xì)胞胞漿表達(dá),陽性染色呈棕黃色顆粒。運(yùn)用IPP6.0軟件對SM22α蛋白表達(dá)量進(jìn)行計算,平均吸光度(mean absorbance)越大,SM22α蛋白表達(dá)越高。與正常組比較,PDGF-BB組的SM22α表達(dá)量下降(P<0.05),提示PDGF-BB可以促進(jìn)VSMCs的表型轉(zhuǎn)換;PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組的SM22α表達(dá)量比PDGF-BB+NC組升高(P<0.05),而與PDGF-BB +NC相比,PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組的SM22α表達(dá)量下降(P<0.05)。結(jié)果提示,27nt-miRNA對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)換具有一定的抑制作用,見圖4。

    5 Western blot檢測27nt-miRNA對SM22α蛋白表達(dá)的影響

    與正常組比較,PDGF-BB組的SM22α表達(dá)水平下降(P<0.05);與PDGF-BB + NC組比較,PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組SM22α表達(dá)水平提高(P<0.05),而PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組的SM22α表達(dá)水平下降(P<0.05)。結(jié)果提示27nt-miRNA促進(jìn)VSMCs收縮型特異性蛋白SM22α的表達(dá),見圖5。

    討 論

    本文通過研究27nt-miRNA對大鼠血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移及表型改變的影響,發(fā)現(xiàn)27nt-miRNA參與SM22α表達(dá)的調(diào)控;在調(diào)控SM22α表達(dá)同時,影響VSMCs的活力以及遷移能力。SM22α是VSMCs收縮型的特異性蛋白之一,PDGF-BB可以促進(jìn)VSMCs從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停?7nt-miRNA高表達(dá)可能抑制VSMCs從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。?jù)我們所知,這是首次報道來源于eNOS基因的27nt-miRNA參與VSMCs活力、遷移及表型改變的調(diào)控過程。

    Figure 4.The effect of 27nt-miRNA on the protein expression of SM22α in the VSMCs was detected by immunohistochemistry (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

    圖4免疫組化檢測27nt-miRNA對細(xì)胞SM22α蛋白表達(dá)的影響

    Figure 5.The effect of 27nt-miRNA on the protein expression of SM22α in the VSMCs was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

    圖5Westernblot檢測27nt-miRNA對VSMCs中SM22α蛋白表達(dá)的影響

    血管平滑肌細(xì)胞的功能改變與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系[6-7]。心血管疾病已成為威脅人類健康的主要疾病之一,高血壓、動脈粥樣硬化和缺血性腦病等血管增殖性疾病發(fā)病率及病死率逐年升高。VSMCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管的重要組成成分,血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管內(nèi)膜,VSMCs位于中膜。正常情況下,VSMCs處于分化成熟狀態(tài)也稱為收縮型,維持動脈血管壁的正常收縮功能,從而調(diào)節(jié)血壓。當(dāng)血管內(nèi)皮損傷后或周圍微環(huán)境改變后,多種信號通路被激活進(jìn)而作用于VSMCs,促使VSMCs由收縮型變成合成型,發(fā)生增殖和遷移,并大量合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)沉積于血管,從而導(dǎo)致血管重塑。研究發(fā)現(xiàn)[8],生長因子、PDGF-BB、Ang-II和機(jī)械因素等可以使VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變,促進(jìn)其增殖和遷移,其中 PDGF-BB可能通過影響 KLF4 磷酸化與不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的相互作用的機(jī)制,進(jìn)而誘導(dǎo) VSMCs 由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚蚚9]。本文選用PDGF-BB刺激VSMCs建立VSMCs表型轉(zhuǎn)換模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDGF-BB組的細(xì)胞活力和遷移率明顯高于正常VSMCs組,并且PDGF-BB組的收縮型特異性SM22α蛋白表達(dá)量低于正常VSMCs組,結(jié)果證實PDGF-BB可以促進(jìn)VSMCs表型轉(zhuǎn)變。miRNA可以通過抑制或相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞功能,如細(xì)胞分化、增殖及維持穩(wěn)態(tài)等。眾多研究表明[10],miRNA的特異性表達(dá)在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此,miRNA是否對VSMCs表型轉(zhuǎn)換以及活力和遷移有影響是一個很重要的研究課題。Yang等[11]在動物體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)大鼠受傷的主動脈中,miR-22表達(dá)水平下降,而且體外實驗發(fā)現(xiàn)miR-22過表達(dá)抑制VSMCs從收縮型變?yōu)楹铣尚?;miRNA-18a/b通過作用于血清反應(yīng)因子促進(jìn)VSMCs從收縮型變?yōu)楹铣尚蚚12];此外,miR-26a作為另外一個參與VSMCs表型調(diào)控的miRNA,可以通過抑制Smad1從而抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs的表型轉(zhuǎn)變[13]。miRNA不僅參與VSMCs表型調(diào)控,還參與VSMCs活力、遷移及內(nèi)膜形成的調(diào)控過程。Ham等[14]發(fā)現(xiàn)miR-9過表達(dá)可以抑制VSMCs增殖和遷移,且同時在球囊損傷實驗中發(fā)現(xiàn)miR-9抑制新內(nèi)膜的形成;miR-146a 通過 NF-κB依賴的途徑可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖以及遷移[15]。27nt-miRNA來源于eNOS基因第 4 內(nèi)含子中的 27 堿基重復(fù)序列,我們前期工作發(fā)現(xiàn)高表達(dá)27nt-miRNA通過抑制轉(zhuǎn)錄因子AP1從而抑制eNOS的活性,并且抑制NO的合成和釋放[4]。已有研究報道NO可以活化VSMCs內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶,通過環(huán)磷鳥苷酸依賴蛋白激酶Ⅰ信號通路催化一系列蛋白磷酸化,從而使血管平滑肌舒張,抑制VSMCs增殖和遷移[5]。由此推測27nt-miRNA可能對VSMCs的表型轉(zhuǎn)變、活力及遷移有一定影響。本研究發(fā)現(xiàn)27nt-miRNA高表達(dá)組SM22α的mRNA和蛋白表達(dá)量高于PDGF-BB+NC組,細(xì)胞活力和遷移能力明顯下降,而27nt-miRNA抑制組與高表達(dá)組相反,這一結(jié)果強(qiáng)烈提示27nt-miRNA參與VSMCs收縮型特異性SM22α基因調(diào)控,并且抑制PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs生長及遷移,并有可能抑制其表型轉(zhuǎn)換。VSMCs的表型轉(zhuǎn)變、活力及遷移是一個多因素調(diào)節(jié)的過程,不是單一分子或基因所調(diào)控,本文研究發(fā)現(xiàn)27nt-miRNA可能通過調(diào)控SM22α基因從而影響VSMCs的表型轉(zhuǎn)變、生長及遷移的過程,但是否存在其它影響因素存在,有待進(jìn)一步的探究。

    猜你喜歡
    培養(yǎng)箱平滑肌表型
    嬰兒培養(yǎng)箱的質(zhì)控辦法及設(shè)計改良探討
    微生物培養(yǎng)箱的選購與管理
    食品工程(2020年3期)2020-01-05 14:38:16
    原發(fā)性腎上腺平滑肌肉瘤1例
    喉血管平滑肌瘤一例
    建蘭、寒蘭花表型分析
    基于模糊PID參數(shù)自整定的細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度控制算法
    腸系膜巨大平滑肌瘤1例并文獻(xiàn)回顧
    GABABR2基因遺傳變異與肥胖及代謝相關(guān)表型的關(guān)系
    慢性乙型肝炎患者HBV基因表型與血清學(xué)測定的臨床意義
    咽旁巨大平滑肌肉瘤一例MRI表現(xiàn)
    女性生殖器流出的白浆| 嫩草影视91久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲av成人av| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久热在线av| 最近在线观看免费完整版| 欧美性猛交黑人性爽| av中文乱码字幕在线| 精品高清国产在线一区| 国产成人av教育| 国产精品av久久久久免费| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 日本成人三级电影网站| 我的亚洲天堂| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲片人在线观看| 国产精品免费视频内射| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品久久久久久精品电影 | 精品久久久久久,| 国产乱人伦免费视频| 国产激情欧美一区二区| 亚洲一区高清亚洲精品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲第一青青草原| av中文乱码字幕在线| 亚洲中文字幕日韩| 欧美最黄视频在线播放免费| 禁无遮挡网站| 精品免费久久久久久久清纯| 婷婷六月久久综合丁香| 成人av一区二区三区在线看| 麻豆一二三区av精品| 热99re8久久精品国产| 美女高潮到喷水免费观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲电影在线观看av| 色av中文字幕| 一夜夜www| 国产成年人精品一区二区| 亚洲色图av天堂| 国产激情欧美一区二区| 两人在一起打扑克的视频| tocl精华| 亚洲av电影在线进入| 亚洲精品色激情综合| 精品久久久久久,| 曰老女人黄片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲成国产人片在线观看| 99riav亚洲国产免费| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 成人三级黄色视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 成年版毛片免费区| 精品高清国产在线一区| 高清在线国产一区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 免费在线观看黄色视频的| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲 欧美一区二区三区| 嫁个100分男人电影在线观看| 美女免费视频网站| 在线观看66精品国产| 老司机福利观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| av视频在线观看入口| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日韩欧美三级三区| 免费在线观看完整版高清| 久久精品国产清高在天天线| 男人舔女人下体高潮全视频| 在线永久观看黄色视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 一级毛片高清免费大全| 天堂影院成人在线观看| 99热6这里只有精品| а√天堂www在线а√下载| 久久久久久国产a免费观看| 久久天堂一区二区三区四区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 午夜激情av网站| 黄片播放在线免费| 日本三级黄在线观看| 免费搜索国产男女视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲第一青青草原| 亚洲av成人av| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产三级在线视频| 欧美日韩黄片免| 日本一本二区三区精品| 精品久久蜜臀av无| 日本一区二区免费在线视频| 后天国语完整版免费观看| 午夜精品在线福利| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产三级在线视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 波多野结衣巨乳人妻| 日韩欧美国产在线观看| 精品久久蜜臀av无| 最新在线观看一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 老司机午夜十八禁免费视频| 男女视频在线观看网站免费 | e午夜精品久久久久久久| 久久精品国产清高在天天线| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 亚洲性夜色夜夜综合| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 91麻豆av在线| 久久中文字幕一级| 国产成人欧美| 色av中文字幕| 国产成人影院久久av| 亚洲精品在线观看二区| 久久青草综合色| 日韩大码丰满熟妇| 国产精品,欧美在线| 日韩国内少妇激情av| 久久久国产成人免费| 亚洲av第一区精品v没综合| 色综合站精品国产| 一进一出好大好爽视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产精品99久久99久久久不卡| 超碰成人久久| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 一级作爱视频免费观看| 国产av不卡久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久久久九九精品二区国产 | 欧美久久黑人一区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 久久久久国内视频| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲av第一区精品v没综合| 十八禁网站免费在线| 丰满的人妻完整版| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲全国av大片| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美三级亚洲精品| 国产亚洲av高清不卡| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 一区二区三区国产精品乱码| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品永久免费网站| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品 欧美亚洲| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 男人操女人黄网站| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 精品欧美国产一区二区三| 一本一本综合久久| 欧美zozozo另类| 99国产综合亚洲精品| 亚洲国产精品成人综合色| tocl精华| 99riav亚洲国产免费| 男人操女人黄网站| 国产精品 国内视频| 黄频高清免费视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 禁无遮挡网站| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲精品在线美女| 欧美久久黑人一区二区| 日本 欧美在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 又紧又爽又黄一区二区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 啦啦啦免费观看视频1| 曰老女人黄片| 久久伊人香网站| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 男人舔女人的私密视频| 不卡一级毛片| 久久久国产欧美日韩av| 99re在线观看精品视频| 香蕉av资源在线| 亚洲国产看品久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲自拍偷在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 色综合站精品国产| 99国产精品一区二区蜜桃av| 后天国语完整版免费观看| 狂野欧美激情性xxxx| 国产激情久久老熟女| 婷婷丁香在线五月| 国产99久久九九免费精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久久久亚洲av毛片大全| 长腿黑丝高跟| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲片人在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 十八禁网站免费在线| 免费高清在线观看日韩| а√天堂www在线а√下载| 在线观看午夜福利视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产激情欧美一区二区| 在线观看舔阴道视频| 欧美不卡视频在线免费观看 | 一区二区三区国产精品乱码| 欧美不卡视频在线免费观看 | 免费在线观看日本一区| 一级毛片精品| 美国免费a级毛片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 在线观看一区二区三区| 免费高清在线观看日韩| 黄频高清免费视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 嫁个100分男人电影在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 人妻久久中文字幕网| 黄色a级毛片大全视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 白带黄色成豆腐渣| 国产成人欧美| 国产又爽黄色视频| 亚洲男人天堂网一区| 香蕉丝袜av| 午夜福利在线观看吧| 亚洲成人久久爱视频| 国产人伦9x9x在线观看| 色老头精品视频在线观看| 亚洲电影在线观看av| 999久久久国产精品视频| av中文乱码字幕在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 十八禁人妻一区二区| x7x7x7水蜜桃| 欧美久久黑人一区二区| 老司机在亚洲福利影院| 老司机靠b影院| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 欧美日韩乱码在线| 成人手机av| 在线av久久热| 精品久久久久久久久久免费视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 精品欧美国产一区二区三| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 在线播放国产精品三级| 中文字幕高清在线视频| 妹子高潮喷水视频| 美女免费视频网站| 国产三级黄色录像| 69av精品久久久久久| 国内精品久久久久久久电影| 国产精品电影一区二区三区| 又紧又爽又黄一区二区| 丝袜在线中文字幕| 精品乱码久久久久久99久播| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产成人欧美在线观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久香蕉精品热| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 一边摸一边抽搐一进一小说| 桃色一区二区三区在线观看| 窝窝影院91人妻| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 在线免费观看的www视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲精品在线美女| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲黑人精品在线| 青草久久国产| 真人一进一出gif抽搐免费| www国产在线视频色| 人人妻人人看人人澡| 国产精品综合久久久久久久免费| 黄片小视频在线播放| 一本久久中文字幕| 在线播放国产精品三级| 白带黄色成豆腐渣| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美性猛交黑人性爽| 两性夫妻黄色片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲国产精品合色在线| www日本黄色视频网| 亚洲av熟女| 在线看三级毛片| 中文字幕av电影在线播放| 欧美日韩黄片免| 黄片小视频在线播放| 男人的好看免费观看在线视频 | 日韩大码丰满熟妇| √禁漫天堂资源中文www| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 好男人在线观看高清免费视频 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 男女之事视频高清在线观看| 国产日本99.免费观看| 精品国产国语对白av| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 老司机午夜十八禁免费视频| 成人精品一区二区免费| 精品电影一区二区在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 午夜激情福利司机影院| svipshipincom国产片| 欧美日本视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品乱码久久久久久99久播| 午夜福利在线观看吧| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产精品 国内视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国内精品久久久久精免费| 一进一出抽搐gif免费好疼| 视频区欧美日本亚洲| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜日韩欧美国产| 国产av在哪里看| 日本免费a在线| 中出人妻视频一区二区| 久热爱精品视频在线9| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲成a人片在线一区二区| 手机成人av网站| 久久精品影院6| 美女 人体艺术 gogo| 搞女人的毛片| 亚洲自拍偷在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 人成视频在线观看免费观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久国产精品影院| 亚洲av美国av| 久久香蕉激情| 国产成人av激情在线播放| 亚洲五月色婷婷综合| 香蕉av资源在线| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲第一电影网av| 在线观看66精品国产| 他把我摸到了高潮在线观看| 日本 欧美在线| 成人18禁在线播放| 国产视频一区二区在线看| 岛国视频午夜一区免费看| 真人一进一出gif抽搐免费| 男男h啪啪无遮挡| 国产亚洲精品第一综合不卡| 90打野战视频偷拍视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 99国产精品一区二区三区| 国产主播在线观看一区二区| 国产成人影院久久av| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 变态另类丝袜制服| 日本一区二区免费在线视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲精华国产精华精| 免费在线观看日本一区| 大型黄色视频在线免费观看| 男女视频在线观看网站免费 | 国产区一区二久久| 一本精品99久久精品77| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 97碰自拍视频| 欧美日韩乱码在线| 国产精品 欧美亚洲| 午夜激情av网站| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 一级毛片高清免费大全| 日韩欧美 国产精品| 国产午夜精品久久久久久| 国产熟女午夜一区二区三区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精品av久久久久免费| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲最大成人中文| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 此物有八面人人有两片| 黑丝袜美女国产一区| 性欧美人与动物交配| 亚洲国产精品合色在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 麻豆av在线久日| 两个人看的免费小视频| 丝袜在线中文字幕| 国产一区二区在线av高清观看| 午夜老司机福利片| 日韩国内少妇激情av| av欧美777| 在线观看免费日韩欧美大片| 日韩大尺度精品在线看网址| 日韩免费av在线播放| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产v大片淫在线免费观看| 不卡一级毛片| 日日干狠狠操夜夜爽| xxx96com| 丁香欧美五月| 久久香蕉激情| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日韩欧美一区视频在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 观看免费一级毛片| 亚洲第一电影网av| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 十八禁网站免费在线| 女人被狂操c到高潮| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲av电影在线进入| 日韩欧美国产在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久久国内视频| 美国免费a级毛片| 亚洲av美国av| 51午夜福利影视在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美精品亚洲一区二区| 嫩草影院精品99| 久久久久精品国产欧美久久久| ponron亚洲| 欧美黑人巨大hd| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产亚洲精品第一综合不卡| 男人的好看免费观看在线视频 | 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 色老头精品视频在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产极品粉嫩免费观看在线| 美女国产高潮福利片在线看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲精品中文字幕在线视频| 一夜夜www| 免费观看精品视频网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 久99久视频精品免费| 亚洲精品中文字幕在线视频| 免费看十八禁软件| 精品国产国语对白av| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| www.熟女人妻精品国产| 亚洲真实伦在线观看| 黄片大片在线免费观看| 国产亚洲精品一区二区www| 岛国视频午夜一区免费看| 色综合欧美亚洲国产小说| 91字幕亚洲| 丝袜人妻中文字幕| www日本在线高清视频| 成人免费观看视频高清| 亚洲在线自拍视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| www.www免费av| 久久精品国产综合久久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 很黄的视频免费| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲无线在线观看| 精品第一国产精品| 久久人人精品亚洲av| 99在线视频只有这里精品首页| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 淫秽高清视频在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产真实乱freesex| 亚洲中文字幕日韩| or卡值多少钱| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 午夜a级毛片| av片东京热男人的天堂| 色哟哟哟哟哟哟| 高清毛片免费观看视频网站| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美zozozo另类| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 18禁美女被吸乳视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产成年人精品一区二区| 久久久久久久久免费视频了| 久久99热这里只有精品18| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美在线黄色| 亚洲国产中文字幕在线视频| 精华霜和精华液先用哪个| 国产单亲对白刺激| 老汉色∧v一级毛片| 国产精华一区二区三区| 久热爱精品视频在线9| 18禁美女被吸乳视频| 欧美日本视频| 嫩草影院精品99| 99精品在免费线老司机午夜| 在线永久观看黄色视频| 亚洲免费av在线视频| 亚洲成人久久性| 成人手机av| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲性夜色夜夜综合| 日本一本二区三区精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲欧美激情综合另类| 成人国产一区最新在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 日韩视频一区二区在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 一区福利在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久香蕉精品热| 久久久久久久精品吃奶| 超碰成人久久| 久久中文字幕一级| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产高清有码在线观看视频 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 中文在线观看免费www的网站 | www.自偷自拍.com| 一本一本综合久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 欧美在线一区亚洲| 日韩国内少妇激情av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲成av人片免费观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 日本a在线网址| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 男男h啪啪无遮挡| 啦啦啦 在线观看视频| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲熟妇熟女久久| 窝窝影院91人妻| 亚洲熟妇熟女久久| 国产99久久九九免费精品| 国产黄a三级三级三级人| 脱女人内裤的视频| 波多野结衣高清作品| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久99热这里只有精品18| 精品日产1卡2卡| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久久久久大精品| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品久久久人人做人人爽| 热99re8久久精品国产| 国产99白浆流出| 国产成人影院久久av| 国产高清视频在线播放一区| 人人妻人人澡人人看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 一级片免费观看大全| 麻豆成人av在线观看| 禁无遮挡网站| 久久精品人妻少妇| 亚洲免费av在线视频| 村上凉子中文字幕在线| 免费在线观看成人毛片| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美中文综合在线视频| 国产一卡二卡三卡精品| 国产激情欧美一区二区| 久久久久久大精品| 亚洲自偷自拍图片 自拍|