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    27nt-miRNA對血管平滑肌細(xì)胞SM22α表達(dá)的調(diào)節(jié)及其對細(xì)胞活力、遷移和表型改變的影響*

    2019-02-28 09:09:36陶曉靜顏淵鴛羅雪蘭秦祖杰覃裕旺歐和生
    中國病理生理雜志 2019年2期
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)箱平滑肌表型

    沈 鳳, 楊 鵬, 陶曉靜, 李 丹, 顏淵鴛, 羅雪蘭, 秦祖杰, 覃裕旺△, 歐和生, △

    (1廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 廣西 南寧 530021; 2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院, 廣西 南寧 530001)

    血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是維持血管正常生理功能的重要細(xì)胞。在正常情況下,VSMCs呈非增殖性的收縮型,在血管損傷和一些生物活性物質(zhì)(如一氧化氮產(chǎn)物、血管緊張素Ⅱ和血小板生長因子等)刺激的情況下,VSMCs轉(zhuǎn)化為增殖性的合成表型,合成并分泌血管活性物質(zhì)和生長因子等,并發(fā)生增殖和遷移,從而導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄和血管重構(gòu)。血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是一種重要的促細(xì)胞分裂原,主要有AA、 BB 及AB 3種形式,其中 PDGF-BB 可與 VSMCs 表面的 PDGF-β受體結(jié)合以激活多條信號通路,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換、增殖和遷移。VSMCs表型轉(zhuǎn)換及增殖是高血壓和動脈粥樣硬化等血管增殖性疾病發(fā)生發(fā)展過程的重要因素[1]。

    微小RNAs(microRNAs,miRNAs,miR)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA,它們通過抑制翻譯過程或者促進(jìn)靶目標(biāo)mRNA降解參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、血管生成和腫瘤形成等幾乎所有病理生理過程。近年來發(fā)現(xiàn)miRNAs參與心血管系統(tǒng)疾病的調(diào)控過程,并且在血管重構(gòu)過程發(fā)揮重要作用,如miR-145/143可以抑制VSMCs增殖、促進(jìn)其分化,減少血管新內(nèi)膜的形成[2];而miR-34a通過調(diào)節(jié)Notch表達(dá)水平抑制VSMCs增殖和遷移,并減少內(nèi)膜增生[3]。27nt-miRNA來源于內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)基因第 4 內(nèi)含子中的 27 堿基重復(fù)序列,本課題組前期工作提示27nt-miRNA可能在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,內(nèi)含子源性27nt-miRNA一方面可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移;另一方面,高表達(dá)27nt-miRNA可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞代謝產(chǎn)生和釋放一氧化氮(nitric oxide,NO)[4]。由于NO不僅是調(diào)節(jié)血管舒張功能的重要因子,而且參與VSMCs增殖、遷移和表型改變的調(diào)節(jié)[5],因此,本研究推測27nt-miRNA可能通過對組織特異性基因的表達(dá)調(diào)節(jié),參與VSMCs增殖及其表型改變的調(diào)控過程。為證實這一觀點,本實驗選取大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞為研究對象,構(gòu)建27nt-miRNA慢病毒載體,然后轉(zhuǎn)染VSMCs,檢測VSMCs收縮型標(biāo)志物平滑肌22α蛋白(smooth muscle 22α protein, SM22α)的表達(dá)水平,并觀察VSMCs形態(tài)、細(xì)胞活力和遷移能力的變化。

    材 料 和 方 法

    1 細(xì)胞和試劑

    大鼠原代主動脈血管平滑肌細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司);DMEM培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(Lonsera);胰蛋白酶消化液(Gibco);重組人PDGF-BB (PeproTech);MTT(北京索萊寶科技有限公司);RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI);PCR試劑盒(天根生化科技有限公司);慢病毒載體(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司);兔抗SM22α和GAPDH抗體(Proteintech)。

    2 方法

    2.127nt-miRNA慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定 以eNOS第4內(nèi)含子中27堿基重復(fù)序列5’-GAAGTCTAGACCTGCTGCAGGGGTGAG-3’為根據(jù),設(shè)計miRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu),以Ubi-MCS-BFLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin為載體,經(jīng)AgeI和NheI雙酶切,轉(zhuǎn)染 293FT細(xì)胞,濃縮得到27nt-miRNA高表達(dá)慢病毒載體mimic 27nt-miRNA,同時根據(jù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)建27nt-miRNA反義序列(anti-27nt-miRNA)和陰性對照(negative control,NC)慢病毒載體。病毒載體上含有嘌呤霉素抗性,可用來識別細(xì)胞轉(zhuǎn)染是否成功,加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選,建立穩(wěn)定細(xì)胞株。

    2.2大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 VSMCs用含15%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),放置于37 ℃、5% CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞密度>85%時,傾去培養(yǎng)液,用 PBS洗滌細(xì)胞。加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化,37 ℃放置1~2 min后再加入2 mL含15% FBS的DMEM培養(yǎng)液,吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。按每孔5×105細(xì)胞的濃度接種6孔板,混勻后正常靜置培養(yǎng)24 h。上述3種慢病毒載體以MOI=70感染VSMCs,置于培養(yǎng)箱孵育48 h,在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況,加入嘌呤霉素(8 mg/L)進(jìn)行篩選。實驗分為5組:(1)正常(normal)組:VSMCs正常培養(yǎng);(2)PDGF-BB組:VSMCs加入終濃度為10 μg/L的PDGF-BB;(3)PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組:往成功轉(zhuǎn)染27nt-miRNA過表達(dá)慢病毒載體的細(xì)胞株加入終濃度10 μg/L的PDGF-BB;(4)PDGF-BB+NC組:向成功轉(zhuǎn)染陰性對照慢病毒載體的細(xì)胞株加入10 μg/L的PDGF-BB;(5) PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組:向成功轉(zhuǎn)染anti-27nt-miRNA的細(xì)胞株加入10 μg/L的PDGF-BB。

    2.3MTT法檢測細(xì)胞活力 成功轉(zhuǎn)染后,除正常組外其它4組都加入10 μg/L PDGF-BB,然后取對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔6×103個細(xì)胞接種到96孔板中,放置37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到50%時更換無血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。后加入MTT培養(yǎng)4 h,使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測每孔的吸光度(A)值。

    2.4劃痕實驗檢測各組VSMCs的遷移能力 通過細(xì)胞劃痕實驗檢測27nt-miRNA對VSMCs的遷移能力的影響。各組細(xì)胞接種到48孔板中,每孔2×104個,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞基本達(dá)到100%融合,用200 μL移液槍及槍頭在培養(yǎng)板底部正中位置劃“一”字痕,棄去原有培養(yǎng)基,并用無菌PBS洗去劃落的細(xì)胞及碎片,重復(fù)2~3次。后每孔加入無血清的DMEM培養(yǎng)基200 μL,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培養(yǎng) 0 h和24 h,應(yīng)用倒置電子顯微鏡觀察不同時點細(xì)胞遷移愈合的情況,遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%,實驗重復(fù)3 次,取平均值。

    2.5RT-PCR 檢測細(xì)胞 SM22α的mRNA 表達(dá) 根據(jù)TRIzol 試劑盒說明書提取各組細(xì)胞的總RNA,利用 Primer 5.0 軟件設(shè)計合成引物,SM22α的上游引物序列為5’-CGTGGAGATCCCAACTGGTTTATG-3’, 下游引物序列為5’-CCCTCTGTTGCTGCCCATTTG-3’; GAPDH的上游引物序列為5’-GATGACATCAAGAAGGTGGTGA-3’, 下游引物序列為5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC-3’。分別取各組細(xì)胞RNA 1 μg,加入1 μL(0.5 g/L)Oligo(dT)18Primer,70 ℃變性 5 min后立即放置冰上冷卻;加4 μL 5×Reaction Buffer、1 μL Ribo LockTMRibonuclease Inhibitor(2.0×107U/L)、2 μL dNTP Mix(10 mmol/L),37 ℃溫育5 min,加入1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶,42 ℃ 1 h,后70 ℃ 10 min終止反應(yīng),得到cDNA 第1 鏈。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性 5 min;94℃ 30 s、56℃ 1 min、72 ℃ 1 min,30個循環(huán);最后72 ℃ 5 min,終止反應(yīng)。取 5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

    2.6免疫組化檢測各實驗組SM22α的表達(dá) 將無菌玻片放入 6孔板,將實驗細(xì)胞消化,取細(xì)胞懸液加入6孔板中,每孔加2 mL,搖勻靜置,放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h后取出玻片放于載玻片上,PBS 沖洗 3 次,中性樹膠封片,4%甲醛固定。雙蒸水沖洗 3 次,敷Ⅰ抗、Ⅱ抗后顯色劑顯色。使用顯微鏡觀察、拍照,并計算細(xì)胞陽性率。實驗重復(fù)3 次,取平均值。

    2.7Western blot檢測SM22α蛋白的表達(dá) 將各組細(xì)胞裂解,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取上清。各組分別取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE(10%)分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后加入抗SM22α抗體濕盒過夜(4 ℃)。第2天用TBST沖洗3次,每次10 min,然后加入 II 抗孵育2 h,重復(fù)用TBST沖洗3次,每次10 min。最后利用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR)分析蛋白電泳條帶的灰度值,計算SM22α蛋白的表達(dá)量,以GAPDH為內(nèi)參照,SM22α相對表達(dá)量=SM22α灰度值/GAPDH灰度值。實驗重復(fù)3次,取平均值。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 27nt-miRNA對PDGF誘導(dǎo)VSMCs活力的影響

    細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染后,用MTT法檢測各組細(xì)胞24 h的細(xì)胞活力,結(jié)果顯示,與正常對照組比較,PDGF-BB組的A值明顯升高(P<0.05),提示PDGF可促進(jìn)VSMCs的活力;與PDGF-BB+NC組相比,PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組的A值下降,而PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組的A值升高(P<0.05),提示27nt-miRNA可以抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞活力,見圖1。

    Figure 1.The effect of 27nt-miRNA on the cell viability of VSMCs measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

    圖1MTT實驗檢測27nt-miRNA對VSMCs細(xì)胞活力的影響

    2 27nt-miRNA對PDGF誘導(dǎo)VSMCs遷移的影響

    劃痕實驗檢測各組細(xì)胞遷移能力,PDGF-BB組的遷移率比正常組升高(P<0.05),PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組的遷移率與PDGF-BB+NC組相比則下降(P<0.05),而PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組卻比PDGF-BB+NC組上升(P<0.05),提示27nt-miRNA對PDGF誘導(dǎo)VSMCs遷移起到一定的抑制作用,見圖2。

    Figure 2.The effect of 27nt-miRNA on the migration ability of VSMCs(×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

    圖227nt-miRNA對VSMCs遷移能力的影響

    3 RT-PCR 檢測細(xì)胞 SM22α的mRNA 表達(dá)

    與正常組比較,PDGF-BB組SM22α的mRNA表達(dá)量下降(P<0.05);與PDGF-BB+NC組比較,PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組SM22α的mRNA表達(dá)量提高,而PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組SM22α的mRNA表達(dá)量下降(P<0.05),見圖3。結(jié)果提示27nt-miRNA促進(jìn)SM22α的轉(zhuǎn)錄。

    Figure 3.The effect of 27nt-miRNA on the mRNA expression of SM22α in the VSMCs detected by RT-PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

    圖3RT-PCR檢測27nt-miRNA對SM22αmRNA表達(dá)的影響

    4 免疫組化檢測27nt-miRNA對SM22α表達(dá)的影響

    用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測各組細(xì)胞中的收縮型特異性蛋白SM22α的表達(dá)量,結(jié)果顯示,SM22α蛋白主要在細(xì)胞胞漿表達(dá),陽性染色呈棕黃色顆粒。運(yùn)用IPP6.0軟件對SM22α蛋白表達(dá)量進(jìn)行計算,平均吸光度(mean absorbance)越大,SM22α蛋白表達(dá)越高。與正常組比較,PDGF-BB組的SM22α表達(dá)量下降(P<0.05),提示PDGF-BB可以促進(jìn)VSMCs的表型轉(zhuǎn)換;PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組的SM22α表達(dá)量比PDGF-BB+NC組升高(P<0.05),而與PDGF-BB +NC相比,PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組的SM22α表達(dá)量下降(P<0.05)。結(jié)果提示,27nt-miRNA對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)換具有一定的抑制作用,見圖4。

    5 Western blot檢測27nt-miRNA對SM22α蛋白表達(dá)的影響

    與正常組比較,PDGF-BB組的SM22α表達(dá)水平下降(P<0.05);與PDGF-BB + NC組比較,PDGF-BB+mimic 27nt-miRNA組SM22α表達(dá)水平提高(P<0.05),而PDGF-BB+anti-27nt-miRNA組的SM22α表達(dá)水平下降(P<0.05)。結(jié)果提示27nt-miRNA促進(jìn)VSMCs收縮型特異性蛋白SM22α的表達(dá),見圖5。

    討 論

    本文通過研究27nt-miRNA對大鼠血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移及表型改變的影響,發(fā)現(xiàn)27nt-miRNA參與SM22α表達(dá)的調(diào)控;在調(diào)控SM22α表達(dá)同時,影響VSMCs的活力以及遷移能力。SM22α是VSMCs收縮型的特異性蛋白之一,PDGF-BB可以促進(jìn)VSMCs從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停?7nt-miRNA高表達(dá)可能抑制VSMCs從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。?jù)我們所知,這是首次報道來源于eNOS基因的27nt-miRNA參與VSMCs活力、遷移及表型改變的調(diào)控過程。

    Figure 4.The effect of 27nt-miRNA on the protein expression of SM22α in the VSMCs was detected by immunohistochemistry (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

    圖4免疫組化檢測27nt-miRNA對細(xì)胞SM22α蛋白表達(dá)的影響

    Figure 5.The effect of 27nt-miRNA on the protein expression of SM22α in the VSMCs was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPDGF-BB+NC group.

    圖5Westernblot檢測27nt-miRNA對VSMCs中SM22α蛋白表達(dá)的影響

    血管平滑肌細(xì)胞的功能改變與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系[6-7]。心血管疾病已成為威脅人類健康的主要疾病之一,高血壓、動脈粥樣硬化和缺血性腦病等血管增殖性疾病發(fā)病率及病死率逐年升高。VSMCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管的重要組成成分,血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管內(nèi)膜,VSMCs位于中膜。正常情況下,VSMCs處于分化成熟狀態(tài)也稱為收縮型,維持動脈血管壁的正常收縮功能,從而調(diào)節(jié)血壓。當(dāng)血管內(nèi)皮損傷后或周圍微環(huán)境改變后,多種信號通路被激活進(jìn)而作用于VSMCs,促使VSMCs由收縮型變成合成型,發(fā)生增殖和遷移,并大量合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)沉積于血管,從而導(dǎo)致血管重塑。研究發(fā)現(xiàn)[8],生長因子、PDGF-BB、Ang-II和機(jī)械因素等可以使VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變,促進(jìn)其增殖和遷移,其中 PDGF-BB可能通過影響 KLF4 磷酸化與不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的相互作用的機(jī)制,進(jìn)而誘導(dǎo) VSMCs 由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚蚚9]。本文選用PDGF-BB刺激VSMCs建立VSMCs表型轉(zhuǎn)換模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDGF-BB組的細(xì)胞活力和遷移率明顯高于正常VSMCs組,并且PDGF-BB組的收縮型特異性SM22α蛋白表達(dá)量低于正常VSMCs組,結(jié)果證實PDGF-BB可以促進(jìn)VSMCs表型轉(zhuǎn)變。miRNA可以通過抑制或相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞功能,如細(xì)胞分化、增殖及維持穩(wěn)態(tài)等。眾多研究表明[10],miRNA的特異性表達(dá)在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此,miRNA是否對VSMCs表型轉(zhuǎn)換以及活力和遷移有影響是一個很重要的研究課題。Yang等[11]在動物體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)大鼠受傷的主動脈中,miR-22表達(dá)水平下降,而且體外實驗發(fā)現(xiàn)miR-22過表達(dá)抑制VSMCs從收縮型變?yōu)楹铣尚?;miRNA-18a/b通過作用于血清反應(yīng)因子促進(jìn)VSMCs從收縮型變?yōu)楹铣尚蚚12];此外,miR-26a作為另外一個參與VSMCs表型調(diào)控的miRNA,可以通過抑制Smad1從而抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs的表型轉(zhuǎn)變[13]。miRNA不僅參與VSMCs表型調(diào)控,還參與VSMCs活力、遷移及內(nèi)膜形成的調(diào)控過程。Ham等[14]發(fā)現(xiàn)miR-9過表達(dá)可以抑制VSMCs增殖和遷移,且同時在球囊損傷實驗中發(fā)現(xiàn)miR-9抑制新內(nèi)膜的形成;miR-146a 通過 NF-κB依賴的途徑可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖以及遷移[15]。27nt-miRNA來源于eNOS基因第 4 內(nèi)含子中的 27 堿基重復(fù)序列,我們前期工作發(fā)現(xiàn)高表達(dá)27nt-miRNA通過抑制轉(zhuǎn)錄因子AP1從而抑制eNOS的活性,并且抑制NO的合成和釋放[4]。已有研究報道NO可以活化VSMCs內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶,通過環(huán)磷鳥苷酸依賴蛋白激酶Ⅰ信號通路催化一系列蛋白磷酸化,從而使血管平滑肌舒張,抑制VSMCs增殖和遷移[5]。由此推測27nt-miRNA可能對VSMCs的表型轉(zhuǎn)變、活力及遷移有一定影響。本研究發(fā)現(xiàn)27nt-miRNA高表達(dá)組SM22α的mRNA和蛋白表達(dá)量高于PDGF-BB+NC組,細(xì)胞活力和遷移能力明顯下降,而27nt-miRNA抑制組與高表達(dá)組相反,這一結(jié)果強(qiáng)烈提示27nt-miRNA參與VSMCs收縮型特異性SM22α基因調(diào)控,并且抑制PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs生長及遷移,并有可能抑制其表型轉(zhuǎn)換。VSMCs的表型轉(zhuǎn)變、活力及遷移是一個多因素調(diào)節(jié)的過程,不是單一分子或基因所調(diào)控,本文研究發(fā)現(xiàn)27nt-miRNA可能通過調(diào)控SM22α基因從而影響VSMCs的表型轉(zhuǎn)變、生長及遷移的過程,但是否存在其它影響因素存在,有待進(jìn)一步的探究。

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