麻杏石甘湯對(duì)哮喘模型小鼠氣道重塑及肺組織MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響*

徐 鳳， 張 巖， 商 華， 肖韓艷

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 黑龍江 牡丹江 157011)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是以氣道內(nèi)各種炎癥細(xì)胞的彌漫性浸潤為主要病變的氣道炎癥性疾病，由多種免疫細(xì)胞共同誘發(fā)，常常導(dǎo)致氣促、胸悶、咳嗽、反復(fù)發(fā)作的喘息、黏液過量分泌和杯狀細(xì)胞增生等癥狀，并伴隨氣流阻塞，直接影響人體健康[1-2]。西藥以糖皮質(zhì)激素為主的支氣管哮喘序貫治療方案雖寫入哮喘防治指南，但是長期使用存在一定的副作用，而中醫(yī)藥防治支氣管哮喘具有較好療效[3-4]。麻杏石甘湯(Maxing-Shigan decoction, MSD)由麻黃、杏仁、石膏和炙甘草組成，麻黃上宣肺氣、外散皮毛之邪、下通利水道、內(nèi)祛臟腑之濕，與杏仁、石膏、炙甘草配伍，清泄肺熱、止咳平喘。臨床研究表明，麻杏石甘湯能夠改善哮喘發(fā)作的臨床癥狀及體征，療效顯著，安全性好[5-6]；另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，麻杏石甘湯可能通過抑制白細(xì)胞介素13/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6/黏蛋白途徑減輕哮喘大鼠炎癥反應(yīng)，也可能通過調(diào)控Sec14l3在肺組織的表達(dá)水平有效減輕哮喘大鼠氣道炎癥的程度[7-8]。但是有關(guān)于麻杏石甘湯對(duì)哮喘模型氣道重塑的影響的研究則鮮見報(bào)道。因此，本研究觀察了麻杏石甘湯對(duì)哮喘模型小鼠氣道重塑的影響，并進(jìn)一步觀察了麻杏石甘湯對(duì)哮喘模型小鼠肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)表達(dá)的影響，探討MMP-9和TIMP-1在哮喘小鼠氣道重塑方面的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 72只健康BALB/c雌性小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(25±2) g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。本實(shí)驗(yàn)方案遵循動(dòng)物福利和倫理原則，經(jīng)過牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)(編號(hào)：MMU2013-16)審查，符合倫理規(guī)范要求。

1.2麻杏石甘湯的制備 麻杏石甘湯由麻黃12 g、杏仁9 g、石膏18 g和炙甘草6 g組成：首先以1 L雙蒸水浸泡麻黃0.5 h，煮沸1 h，掠去上沫，然后再同杏仁、石膏(用紗布包裹)和炙甘草煮沸0.5 h，3 000 r/min離心10 min，棄沉渣，取上清。生理鹽水調(diào)配至濃度1 kg/L，4 ℃儲(chǔ)存，待用。臨用前加熱至常溫，以生理鹽水稀釋至1 kg/L、0.5 kg/L和0.25 kg/L。

1.3主要試劑 卵清蛋白購自Sigma；地塞米松磷酸鈉注射液購自天津金耀藥業(yè)有限公司；MMP-9和TIMP-1 ELISA檢測(cè)試劑盒購自ADL；羊抗小鼠MMP-9多克隆抗體及兔抗小鼠TIMP-1多克隆抗體購自Affinity；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG購自上海榕柏生物技術(shù)有限公司。

1.4主要儀器 超聲霧化器(402A，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)；自動(dòng)平衡離心機(jī)(LDZ5-2，北京京立離心機(jī)有限公司)；動(dòng)物無創(chuàng)肺功能檢測(cè)系統(tǒng)(FinePointeTMNAM，Buxco)；光學(xué)顯微鏡(BH-2，Olympus)；電子天平(UW820S，Shimadzu)。

2 方法

2.1動(dòng)物分組和小鼠哮喘模型的建立 將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照(blank control)組、模型(model)組、麻杏石甘湯低劑量(low-dose MSD)組、麻杏石甘湯中劑量(middle-dose MSD)組、麻杏石甘湯高劑量(high-dose MSD)組和陽性對(duì)照(positive control)組，每組12只。除空白對(duì)照組外，于第1天和第8天皮下注射10 mg卵清蛋白和200 mg氫氧化鋁凝膠，從第15天開始，將全部小鼠放置到超聲霧化器中，以2%卵清蛋白生理鹽水霧化激發(fā)哮喘?？瞻讓?duì)照組均以不含卵清蛋白的生理鹽水替換，每天1次，每次約30 min，共連續(xù)激發(fā)8 周?？瞻讓?duì)照組和模型組于激發(fā)前30 min以生理鹽水灌胃。以60 kg成人每日服用藥物劑量與小鼠體表面積換算比值換算出小鼠1 d用量，計(jì)算出各藥物組的臨床等效劑量并參照文獻(xiàn)[9-10]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為中劑量。麻杏石甘湯低劑量組、中劑量組和高劑量組于激發(fā)前30 min以麻杏石甘湯按5.0 g/kg、10.0 g/kg和20.0 g/kg劑量灌胃；陽性對(duì)照組于激發(fā)前30 min以地塞米松按0.005 g/kg劑量灌胃，每天1次，共連續(xù)給藥7 d。

2.2氣道反應(yīng)性的測(cè)定[11]最后1次給藥2 h后進(jìn)行氣道反應(yīng)性測(cè)定，連接動(dòng)物無創(chuàng)肺功能檢測(cè)系統(tǒng)。將小鼠置于體描箱內(nèi)，適應(yīng)5 min。給予不同濃度(依次為6.25、12.5、25和50 g/L)的乙酰甲膽堿(methacholine，MCh)，每個(gè)劑量間隔5 min以上，記錄各組小鼠增強(qiáng)呼吸間歇(enhanced pause，Penh)值評(píng)價(jià)氣道阻力，Penh(%)=(呼氣時(shí)間/松弛時(shí)間-1)×最大呼吸流量/最大吸氣量×100%。

2.3標(biāo)本制備和嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)計(jì)數(shù) 氣道反應(yīng)性測(cè)定完成后，各組小鼠麻醉，結(jié)扎右側(cè)主支氣管，經(jīng)氣管插管，以4 ℃預(yù)冷的無菌Hanks 液行支氣管肺泡灌洗6次，每次0.5 mL，回收率約80%。收集到的支氣管肺泡沖洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)經(jīng)3 000 r/min 離心 10 min，取沉渣經(jīng)生理鹽水重懸，取10 μL以Diff-Quik 染色液染色BALF細(xì)胞涂片后用于EOS計(jì)數(shù)。隨機(jī)取6只小鼠，切取右肺上葉，用于高碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色和Masson染色。剩余6只小鼠，切取右肺門部位組織用于ELISA測(cè)定及Western blot 和RT-qPCR分析。

2.4組織學(xué)檢查 肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片(5 μm)，分別進(jìn)行PAS 染色和Masson染色。采集圖像用 Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測(cè)定杯狀細(xì)胞百分比(%)，以杯狀細(xì)胞占所在支氣管上皮細(xì)胞的比例表示氣道的黏液分泌能力；測(cè)定上皮下Masson 陽性面積(μm2)和支氣管基底膜周長(μm)，計(jì)算Masson陽性面積/支氣管基底膜周長比(μm2/μm)，以表示膠原沉積情況。

2.5肺組織MMP-9和TIMP-1蛋白水平的測(cè)定 取約1/3右肺組織剪碎勻漿，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的操作說明測(cè)定肺組織MMP-9和TIMP-1水平。另取約1/3右肺組織剪碎勻漿，提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照常規(guī)操作方法進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。分別加入 I 抗(1∶500稀釋)孵育1 h；PBST洗滌后，加入 II 抗(1∶2 000稀釋)孵育1 h,以GAPDH為內(nèi)參照。每份樣品設(shè)5個(gè)平行孔。用Odyssey 熒光掃描儀掃描。

2.6RT-qPCR 分析肺組織MMP-9和TIMP-1的mRNA水平 參照TRIzol試劑說明書進(jìn)行剩余肺組織總RNA 提取，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。用cDNA 模板對(duì)相關(guān)基因分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列見表1。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s、72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán);再72 ℃延伸10 min。每個(gè)樣本以內(nèi)參照GAPDH調(diào)整。每份樣品檢測(cè)5次。采用2-ΔΔCt法測(cè)定mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR 引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析進(jìn)行多組間比較，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 麻杏石甘湯對(duì)哮喘模型小鼠氣道反應(yīng)性的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠氣道反應(yīng)性顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，麻杏石甘湯各劑量組和陽性對(duì)照組小鼠氣道反應(yīng)性均顯著降低(P<0.05或P<0.01),見表2。

表2 各組小鼠Penh 值的比較

**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

2 麻杏石甘湯對(duì)哮喘模型小鼠組織學(xué)的影響

PAS染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組少見杯狀細(xì)胞；模型組可見明顯杯狀細(xì)胞；麻杏石甘湯各劑量組和陽性對(duì)照組的杯狀細(xì)胞較模型組顯著減少，見圖1。圖像分析結(jié)果顯示，模型組小鼠的杯狀細(xì)胞百分比顯著升高，與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；麻杏石甘湯各劑量組和陽性對(duì)照組小鼠的杯狀細(xì)胞百分比均顯著降低，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見圖2。Masson染色結(jié)果顯示空白對(duì)照組少見膠原沉積；模型組可見明顯膠原沉積；麻杏石甘湯各劑量組和陽性對(duì)照組的膠原沉積顯著減少，見圖1。圖像分析結(jié)果顯示，模型組小鼠Masson染色陽性面積/支氣管基底膜周長比與空白對(duì)照組比較顯著增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而麻杏石甘湯各劑量組和陽性對(duì)照組的Masson染色陽性面積/支氣管基底膜周長比顯著減小(P<0.05或P<0.01)，見圖2。以上結(jié)果提示麻杏石甘湯可顯著降低哮喘模型小鼠膠原沉積。

Figure 1.The results of PAS staining and Masson staining in lung tissues of different groups (×200).

圖1各組小鼠肺組織PAS染色和Masson染色結(jié)果

Figure 2.The results of the goblet cell percentage and the collagen deposition in the lung tissues of different groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖2各組小鼠肺組織杯狀細(xì)胞百分比和膠原沉積結(jié)果的比較

3 麻杏石甘湯對(duì)哮喘模型小鼠BALF中EOS計(jì)數(shù)的影響

BALF中EOS計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠EOS計(jì)數(shù)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，麻杏石甘湯各劑量組和陽性對(duì)照組小鼠EOS計(jì)數(shù)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

4 ELISA檢測(cè)哮喘模型小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1水平的變化

ELISA結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠MMP-9和TIMP-1水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，麻杏石甘湯各劑量組和陽性對(duì)照組小鼠MMP-9和TIMP-1水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見圖4。

5 Western blot檢測(cè)哮喘模型小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1表達(dá)的變化

Figure 3.The results of the EOS counts in the BALF of different groups. Mean±SD.n=12.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖3各組小鼠BALF中EOS計(jì)數(shù)的比較

Figure 4.The ELISA results of the MMP-9 and TIMP-1 levels in the lung tissues of different groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖4ELISA檢測(cè)各組小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1的蛋白水平

Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠MMP-9和TIMP-1表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較,麻杏石甘湯各劑量組和陽性對(duì)照組小鼠MMP-9和TIMP-1表達(dá)均顯著降低(P<0.05或P<0.01),見圖5。

Figure 5.The protein expression of MMP-9 and TIMP-1 in the lung tissues of different groups determined by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖5Westernblot檢測(cè)各組小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1的蛋白表達(dá)

6 哮喘模型小鼠肺組織MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA表達(dá)的變化

RT-qPCR結(jié)果顯示，模型組小鼠MMP-9 和TIMP-1的mRNA表達(dá)顯著升高，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，麻杏石甘湯各劑量組和陽性對(duì)照組小鼠MMP-9 和TIMP-1的mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見圖6。

Figure 6.The mRNA expression of MMP-9 and TIMP-1 in the lung tissues of different groups detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖6RT-qPCR檢測(cè)各組小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1的mRNA表達(dá)水平

討 論

氣道高反應(yīng)性是哮喘發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素，當(dāng)炎癥細(xì)胞激活和(或)炎癥介質(zhì)釋放即會(huì)導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性[12-13]。本研究結(jié)果顯示，麻杏石甘湯可有效降低哮喘模型小鼠氣道反應(yīng)性；同時(shí)本研究中組織學(xué)也發(fā)現(xiàn)，各劑量的麻杏石甘湯均可以抑制哮喘模型小鼠肺組織杯狀細(xì)胞百分比及上皮下膠原沉積。以上結(jié)果說明，麻杏石甘湯可有效抑制哮喘模型小鼠氣道反應(yīng)性和氣道重塑，減輕哮喘癥狀。

氣道的炎癥和重塑是哮喘的特征性病理改變[14]。氣道重塑被認(rèn)為可能成為防治哮喘的新靶點(diǎn)，其發(fā)生基礎(chǔ)以氣道慢性炎癥為特征，是炎癥慢性發(fā)展的最終結(jié)果之一[15]。研究表明，在哮喘氣道組織中存在大量的炎癥細(xì)胞浸潤，如EOS。當(dāng)EOS分泌嗜酸性細(xì)胞陽離子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)，即可刺激成纖維細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，合成和分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)并沉積，導(dǎo)致氣道壁增厚而引起氣道重塑。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠BALF中EOS計(jì)數(shù)較空白對(duì)照組明顯增加，說明模型組小鼠BALF中EOS升高；而麻杏石甘湯各劑量組小鼠BALF中EOS計(jì)數(shù)較模型組降低。以上結(jié)果提示，麻杏石甘湯抑制哮喘模型小鼠氣道重塑與其抑制慢性氣道炎癥密切相關(guān)，同時(shí)，也進(jìn)一步證明麻杏石甘湯具有明顯的體內(nèi)抗炎作用[7-8]。

氣道重塑是一個(gè)復(fù)雜的過程，主要改變包括上皮損傷、上皮下纖維化、氣道平滑肌增生、杯狀細(xì)胞肥大和增生以及血管生成等，其中最顯著的異常改變是ECM分子的過度產(chǎn)生和沉積[16]。ECM的動(dòng)態(tài)環(huán)境主要由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制物(TIMPs)維持。MMPs是調(diào)節(jié)ECM代謝的主要限速酶，能夠特異性降解ECM，參與多種生理和病理生理過程，為一個(gè)大家族。MMPs家族中與哮喘關(guān)系最密切相關(guān)的有MMP-9和TIMP-1,TIMP-l是MMP-9的特異性抑制物，可通過抑制MMP-9的活性而保護(hù)氣管基質(zhì)蛋白不被降解，二者共同維持著正常基質(zhì)和機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[17-18]。MMP-9與TIMP-1的失衡是引起ECM降解和氣道重塑的重要原因。MMP-9通過影響EOS等炎癥細(xì)胞的遷移、ECM沉積和基質(zhì)中膠原的降解，在氣道重塑中起關(guān)鍵作用[19-20];而TIMP-1通過與MMP-9的催化位點(diǎn)結(jié)合而抑制MMP-9活性，使降解產(chǎn)物在黏膜下層聚集，導(dǎo)致氣道壁增厚，促進(jìn)氣道重塑的發(fā)生發(fā)展，被認(rèn)為是哮喘發(fā)生氣道重塑現(xiàn)象的標(biāo)志[21]。故此，調(diào)節(jié)MMP-9及TIMP-1的水平可能是抑制哮喘氣道重塑的有效方法。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠MMP-9和TIMP-1水平較空白對(duì)照組均升高，與以往研究結(jié)果相一致[22]。麻杏石甘湯各劑量組小鼠MMP-9和TIMP-1水平均較模型組降低。以上結(jié)果均說明，麻杏石甘湯可能通過抑制MMP-9和TIMP-1表達(dá)而抑制哮喘模型小鼠氣道重塑。

綜上所述，麻杏石甘湯可有效降低哮喘模型小鼠的氣道高反應(yīng)性，同時(shí)也具有抑制氣道重塑的作用，其機(jī)制可能與其抑制MMP-9和TIMP-1表達(dá)有關(guān)。本研究的局限之處在于并未探討拆方的作用。至于其拆方對(duì)哮喘模型小鼠氣道重塑的作用及可能機(jī)制，將作進(jìn)一步的探討。