內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響*

鄭 璐， 韓 冰, 2， 湯 雷， 田 甜， 蔡 爽， 余 蕾， 馬子華， 楊 婷, 2， 楊 勤, 2△， 謝汝佳, 2△

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1病理生理學(xué)教研室, 2貴州省常見(jiàn)慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細(xì)胞重要的膜性細(xì)胞器，在細(xì)胞的生理調(diào)控中扮演著十分重要的角色。許多有害因素,如營(yíng)養(yǎng)過(guò)?；蛉狈?、Ca2+平衡紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥和缺氧等均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)被打破，使大量未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中聚集[1-2]，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的發(fā)生。ERS時(shí)細(xì)胞為了對(duì)抗有害因素所帶來(lái)的不利影響而啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，以此來(lái)恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的平衡[3]。此外，ERS時(shí)還可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白進(jìn)行降解，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)荷，促進(jìn)細(xì)胞存活。

真核生物細(xì)胞內(nèi)有2種主要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng):一是泛素-蛋白酶體降解系統(tǒng)，二是自噬。ERS時(shí)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白能夠被泛素-蛋白酶體降解已早有定論。研究證實(shí)蛋白酶體是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD)系統(tǒng)的組成部分，如果使用蛋白酶體抑制劑則會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能損害而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[4]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)自噬可能也參與了對(duì)未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白的降解過(guò)程[5]，但自噬對(duì)ERS時(shí)細(xì)胞功能有何影響，目前尚無(wú)定論。本研究采用二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)處理體外培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞LO2,建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下自噬的發(fā)生情況；然后采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin,RAP)預(yù)處理LO2細(xì)胞，觀察其對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

人正常肝細(xì)胞LO2(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心上海細(xì)胞庫(kù))。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)；胰酶、彩虹Marker、BCA蛋白定量試劑盒、二硫蘇糖醇和電鏡固定液(北京索萊寶科技有限公司)；細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo K1622)；兔抗β-actin抗體、兔抗自噬相關(guān)基因12(autophagy-related gene 12，Atg12)、兔抗Atg5、兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、兔抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)、兔抗蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、兔抗活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)和兔抗C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)抗體(Abcam)；雷帕霉素(LC)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) LO2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換1次液，細(xì)胞密度85%時(shí)以1∶2傳代備用。

2.2多功能實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀(real-time cellular analysis，RTCA)檢測(cè)不同濃度DTT對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響 RTCA DP系統(tǒng)通過(guò) E-plate 底部的電極檢測(cè)貼壁細(xì)胞的電阻抗，可反映細(xì)胞的數(shù)量、活力、形態(tài)以及貼壁情況，以細(xì)胞指數(shù)(cell index，CI)作為檢測(cè)指標(biāo)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，使用含EDTA的胰酶消化后制成細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔以7×103個(gè)細(xì)胞接種于E-plate，待細(xì)胞貼壁后分別加入終濃度為0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0 mmol/L和6.0 mmol/L的DTT處理細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)96 h，觀察不同濃度DTT對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響，每10 min記錄1次。采用RTCA軟件分析獲取CI值并選出后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的最佳藥物濃度。

2.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型的建立 根據(jù)RTCA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給予終濃度為2.0 mmol/L的DTT誘導(dǎo)LO2細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，DTT處理時(shí)間分別為0 h、6 h、12 h和24 h。收集的細(xì)胞樣本用于real-time PCR、Western blot及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.4Real-time PCR法檢測(cè)GRP78、PERK、ATF4、CHOP、Atg12、Atg5和LC3的 mRNA表達(dá)水平 將各組細(xì)胞用PBS洗2次，加入1.0 mL TRIzol裂解液在冰上裂解10 min，收集細(xì)胞裂解液提取總RNA。采用核酸蛋白儀檢測(cè)RNA濃度，并根據(jù)A260/A280的比值確定所提RNA的純度，所有樣本的A260/A280比值均在1.8～2.0的范圍內(nèi)，符合實(shí)驗(yàn)要求。按照Thermo K1622逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5× reaction buffer 4 μL,dNTP Mix 2 μL,Oligo dT 1 μL,RNase inhibitor 1 μL,transcriptase 1 μL,RNA樣品為含1 μg RNA的體積，RNase-free H2O為11 μL減去RNA樣品的體積。反應(yīng)條件為25 ℃ 10 min、48 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA保存于4 ℃短期內(nèi)使用。按照說(shuō)明書(shū)配置實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL、cDNA 模板2 μL，RNase-free H2O 8.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。mRNA的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物序列

2.5Western blot法檢測(cè)GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、Atg12、Atg5和LC3蛋白水平的變化 收集各組細(xì)胞，分別加入300 μL細(xì)胞裂解液，在冰上裂解10 min。收集細(xì)胞懸液，12 000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。以40 μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉90 min。將兔抗GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、CHOP以及Atg12、Atg5和LC3用抗體稀釋液按相應(yīng)比例稀釋后與PVDF膜在4 ℃搖床孵育過(guò)夜;次日用TBST洗膜后加入Ⅱ抗(1∶4 000)室溫孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光成像，以β-actin為內(nèi)參照。用Image Lab圖像分析軟件對(duì)每個(gè)條帶灰度值進(jìn)行半定量分析。

2.6透射電鏡檢測(cè)自噬的發(fā)生情況 使用含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，將上清小心棄掉，加入電鏡固定液固定細(xì)胞，將固定好的細(xì)胞經(jīng)逐級(jí)乙醇脫水后，用70%乙醇醋酸雙氧鈾塊染色，包埋、切片后用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照(control)組、DTT組(給予終濃度為2.0 mmol/L的DTT處理細(xì)胞24 h)和雷帕霉素預(yù)處理+DTT組(400 nmol/L的雷帕霉素預(yù)處理細(xì)胞1 h后，再給予終濃度為2.0 mmol/L的DTT處理24 h)。使用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，2 000 r/min離心5 min。取5×105細(xì)胞，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，每組細(xì)胞中加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法，多重比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RTCA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同濃度的DTT對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響

與0 mmol/L DTT組比較，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L DTT對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯的抑制作用，2.0 mmol/L DTT對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用明顯(P<0.05)，并且隨著濃度的增加，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯，見(jiàn)圖1。

2 Real-time PCR檢測(cè)GRP78、PERK、ATF4、CHOP、Atg12、Atg5和LC3的mRNA表達(dá)情況

Real-time PCR結(jié)果顯示，與0 h組比較，DTT處理LO2細(xì)胞6 h后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路相關(guān)因子GRP78、PERK和ATF4的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，而CHOP的mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化；隨著DTT作用時(shí)間延長(zhǎng)，DTT處理LO2細(xì)胞12 h后，GRP78、PERK和ATF4的mRNA表達(dá)較6 h組進(jìn)一步增高，而CHOP的mRNA水平也較DTT 0 h及6 h組明顯增加(P<0.05)；DTT處理細(xì)胞24 h后GRP78、PERK和ATF4的mRNA表達(dá)有所下降，但仍顯著高于DTT 0 h組，而CHOP mRNA的表達(dá)仍保持在較高水平(P<0.05)。另外，還觀察到DTT處理LO2細(xì)胞6 h、12 h和24 h后，自噬相關(guān)因子Atg12、Atg5及LC3的表達(dá)均較DTT 0 h組顯著增加(P<0.05)，并且隨著DTT作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Atg12、Atg5及LC3的mRNA表達(dá)逐漸增加，見(jiàn)圖2。

Figure 1.Dynamic monitoring of the normalized cell index of LO2 cells treated with different concentrations of DTT by RTCA xCELLigence system (A), and the viability of LO2 cells exposed to DTT at different concentrations for 24 h (B). Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 mmol/L DTT group.

圖1RTCAxCELLigence系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同濃度DTT處理的LO2細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)

Figure 2.The mRNA expression of GRP78, PERK, ATF4, CHOP, Atg12, Atg5 and LC3 after DTT stimulation. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 h group.

圖2Real-timePCR檢測(cè)DTT處理細(xì)胞后GRP78、PERK、ATF4、CHOP、Atg12、Atg5和LC3的mRNA表達(dá)

3 DTT處理LO2細(xì)胞后GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、Atg12、Atg5和LC3蛋白水平的變化

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 h組比較，DTT處理LO2細(xì)胞6 h后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和p-PERK蛋白水平無(wú)明顯變化，而PERK、ATF4和CHOP的表達(dá)顯著增高(P<0.05)；DTT作用12 h和24 h后，GRP78和p-PERK的蛋白水平較DTT 0 h及6 h組顯著上調(diào)(P<0.05)；PERK、ATF4和CHOP的表達(dá)仍保持在高水平。此外，還觀察到DTT作用6 h、12 h和24 h后，細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Atg5、Atg12和LC3的表達(dá)均較DTT 0 h組顯著增加，且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值也較DTT 0 h組顯著增高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The protein levels of GRP78, PERK, p-PERK, ATF4,CHOP, Atg12, Atg5 and LC3 in the LO2 cells exposed to 2.0 mmol/L DTT at different time points. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

圖32.0mmol/LDTT處理LO2細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、Atg12、Atg5和LC3蛋白水平的影響

4 透射電子顯微鏡檢測(cè)自噬發(fā)生情況

透射電子顯微鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DTT處理LO2細(xì)胞6 h、12 h和24 h組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)自噬小體(箭頭所示)，并且隨著DTT處理LO2時(shí)間的延長(zhǎng)，自噬小體數(shù)量逐漸增加，而0 h組無(wú)此現(xiàn)象；經(jīng)雷帕霉素預(yù)處理后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自噬小體進(jìn)一步增多，見(jiàn)圖4。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LO2細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2.0 mmol/L DTT處理LO2細(xì)胞0 h、6 h、12 h和24 h后，DTT 0 h組細(xì)胞凋亡率為(4.40±0.53)%，DTT 6 h組的凋亡率為(9.70±1.42)%；隨著DTT處理時(shí)間的延長(zhǎng)，DTT 12 h組及24 h組的細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加(P<0.01)，見(jiàn)圖5。另外，雷帕霉素預(yù)處理+ DTT 24 h組的細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)的DTT處理細(xì)胞24 h組顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細(xì)胞重要的膜性細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝及蛋白質(zhì)合成后折疊與聚集的場(chǎng)所，在細(xì)胞的生理調(diào)控中扮演著十分重要的角色，因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能正常是細(xì)胞存活以及維持機(jī)體正常生理功能的關(guān)鍵[1-3]。肝細(xì)胞擁有數(shù)量豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，不論是蛋白質(zhì)的合成與分泌、膽固醇的生物合成還是外源性化學(xué)物質(zhì)的代謝均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能密切相關(guān)，因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的紊亂勢(shì)必會(huì)對(duì)肝細(xì)胞功能造成影響進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。研究證實(shí)許多肝臟疾病(例如病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病和肝纖維化等)的發(fā)生均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)[4-6]。本研究采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑DTT處理體外培養(yǎng)的LO2細(xì)胞，經(jīng)real-time PCR及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著DTT作用時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著增加。GRP78是廣泛分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種分子伴侶，其主要作用是協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊、裝配和運(yùn)輸[7]。研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)表達(dá)增加的GRP78可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊/錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確折疊，從而恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能并促進(jìn)細(xì)胞存活，故GRP78表達(dá)上調(diào)也被視為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的標(biāo)志[8-9]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，ERS時(shí)細(xì)胞除通過(guò)上調(diào)GRP78等分子伴侶的表達(dá)來(lái)促進(jìn)未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白進(jìn)行正確折疊外，還可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)對(duì)未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白進(jìn)行降解，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷。

Figure 4.Transmission electron microscopy was used to observe the occurrence of autophagy in the LO2 cells treated with 2.0 mmol/L DTT at different time points (A) and after pretreatment with RAP (B).

圖4透射電子顯微鏡觀察2.0mmol/LDTT處理LO2細(xì)胞不同時(shí)間后自噬發(fā)生情況及RAP預(yù)處理后自噬的發(fā)生情況

Figure 5.The effect of DTT at 2.0 mmol/L on the apoptosis of the LO2 cells at different time points. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group.

圖52.0mmol/LDTT處理LO2細(xì)胞不同時(shí)間后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

Figure 6.The effect of RAP pretreatment on the apoptosis of LO2 cells induced by DTT. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDTT group.

圖6RAP預(yù)處理后對(duì)DTT誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞凋亡的影響

真核生物細(xì)胞內(nèi)有2種主要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，一是泛素-蛋白酶體降解系統(tǒng)，二是自噬[10]。已有研究證明ERS可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[11-12]。在本次研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑DTT處理LO2細(xì)胞6、12和24 h后，細(xì)胞中自噬小體顯著增多，其中以12及24 h組更為明顯；此外還觀察到DTT處理LO2細(xì)胞后能顯著上調(diào)細(xì)胞中自噬相關(guān)因子Atg12、Atg5及LC3的mRNA 及蛋白表達(dá)水平，同時(shí)Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LC3 II/LC3 I的比值也較0 h組顯著增高。由于LC3有LC3 I和LC3 II 2種形式，且隨著自噬的發(fā)生，LC3 I將與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PA)結(jié)合轉(zhuǎn)變成LC3 II；當(dāng)自噬泡膜閉合時(shí)，只有LC3 II定位于自噬泡膜上，因此LC3 I向LC3 II的轉(zhuǎn)化可作為自噬發(fā)生的標(biāo)志[13],上述結(jié)果證實(shí)肝細(xì)胞LO2發(fā)生ERS時(shí)的確可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，而自噬水平增高對(duì)ERS狀態(tài)下細(xì)胞的命運(yùn)有何影響，目前尚存在爭(zhēng)議。

在本次研究中發(fā)現(xiàn)，DTT處理LO2細(xì)胞后，細(xì)胞中PERK、ATF4及CHOP 的mRNA水平明顯增高，同時(shí)PERK、p-PERK、ATF4及CHOP 的蛋白表達(dá)水平也顯著上調(diào)，上述結(jié)果提示DTT處理細(xì)胞后ERS介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路發(fā)生了活化,這是因?yàn)镋RS時(shí)由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙導(dǎo)致大量未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中聚集，作為分子伴侶的GRP78去結(jié)合和處理未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白，因此與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白PERK解離。解離后的PERK通過(guò)自身磷酸化被激活，而p-PERK可進(jìn)一步激活其下游的真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α, eIF2α)，并促進(jìn)下游促凋亡蛋白ATF4及CHOP的表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2, 14]。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示隨著DTT處理LO2細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，LO2細(xì)胞凋亡率也顯著增加。從表面上看，細(xì)胞自噬水平增高的同時(shí)細(xì)胞凋亡也顯著增加了，因此很容易得出自噬水平增加可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的結(jié)論。但也有學(xué)者對(duì)這一結(jié)論提出了質(zhì)疑，認(rèn)為自噬是細(xì)胞對(duì)抗損傷因素的一種重要的代償保護(hù)機(jī)制，而細(xì)胞凋亡增加有可能是細(xì)胞自身代償不足所造成的[15]。為進(jìn)一步研究自噬水平增高究竟對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用還是損傷作用，本實(shí)驗(yàn)采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素預(yù)處理LO2細(xì)胞，觀察外源性上調(diào)細(xì)胞自噬水平后對(duì)ERS狀態(tài)下細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素預(yù)處理LO2細(xì)胞后，能在一定程度上減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這與Tang等[16]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，肝細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，而自噬水平增高可能是細(xì)胞的一種重要的代償保護(hù)機(jī)制，但如果損傷因素過(guò)重或持續(xù)時(shí)間過(guò)久，細(xì)胞自身的代償機(jī)制不足于對(duì)抗損傷因素時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞走向凋亡。雷帕霉素預(yù)處理可在一定程度上減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞的作用。