基因組編輯技術(shù)及其檢測(cè)鑒定方法研究進(jìn)展

丁霖，彭城，殷海軍，陳笑蕓，徐俊鋒*，李玥瑩*

(1.沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021； 3.江蘇明天種業(yè)科技股份有限公司，江蘇 南京 210000)

近年來(lái)，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)迅猛發(fā)展，基因編輯技術(shù)成為全球性研究熱點(diǎn)，并被Science列為2012年度十大科學(xué)進(jìn)展之一[1]，Nature Methods將其評(píng)為過(guò)去10 a間對(duì)生物學(xué)研究最有影響力的10項(xiàng)研究方法之一?；蚪M編輯技術(shù)是指對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾和改變的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)主要利用序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性的DNA修飾結(jié)構(gòu)域組合而成的序列特異性核酸內(nèi)切酶切割DNA靶位點(diǎn)，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的堿基突變、缺失和基因插入替換等定向改造[2]。這項(xiàng)技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)在于不改變目標(biāo)生物基因組整體的穩(wěn)定性，只在目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生堿基的缺失或插入，實(shí)現(xiàn)了單一或多個(gè)性狀的消除或獲得[3]。目前，科學(xué)家已經(jīng)利用基因編輯技術(shù)培育出大量的動(dòng)植物。但是對(duì)基因編輯個(gè)體進(jìn)行篩選和鑒定的傳統(tǒng)方法和手段比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，這對(duì)將來(lái)針對(duì)基因編輯技術(shù)的特點(diǎn)建立有效、特異的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因編輯產(chǎn)品的有效監(jiān)測(cè)十分不利，所以急需開(kāi)發(fā)快速、靈敏、高通量的基因編輯個(gè)體篩選和鑒定方法。本文概述了CRISPR等基因編輯產(chǎn)品篩選和檢測(cè)鑒定的幾種方法，為實(shí)現(xiàn)對(duì)基因編輯產(chǎn)品的有效監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 基因組編輯技術(shù)及其原理

基因組編輯技術(shù)是使用序列特異性核酸酶(sequence-specific nucleases, SSNs)進(jìn)行的，目前包括鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)系統(tǒng)和成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)系統(tǒng)[4]。其主要原理都是通過(guò)SSNs特異切割DNA靶位點(diǎn)，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，誘導(dǎo)DNA的損傷修復(fù)機(jī)制(包括非同源性末端連接和同源重組修復(fù))，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定向編輯。

1.1 ZFNs技術(shù)

ZFNs是第一種由人工改造應(yīng)用的核酸內(nèi)切酶，ZFN單體由位于C末端的非特異性切割結(jié)構(gòu)域FokⅠ和位于N端的特異性識(shí)別DNA的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)(Zinc finger protein, ZFP)組成[5]，其中，鋅指蛋白可以識(shí)別特異的DNA序列，而Fok Ⅰ則有切割功能域的功能[6]。一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)一般包括30個(gè)氨基酸，形成2個(gè)反向的β折疊片。結(jié)合鋅離子的保守氨基酸為2個(gè)半胱氨酸殘基和2個(gè)組氨酸殘基。1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域可識(shí)別9～12 bp的堿基，將多個(gè)(通常為3～6個(gè))鋅指結(jié)構(gòu)組合在一起就可以形成1個(gè)大的DNA識(shí)別區(qū)域。將人工構(gòu)建的鋅指結(jié)構(gòu)與改造后的FokⅠ限制性內(nèi)切酶融合，就構(gòu)成了可以對(duì)特定的目標(biāo)序列進(jìn)行切割的人工核酸酶ZFNs[7-9]。只有2個(gè)FokⅠ切割域的二聚化才能切割雙鏈DNA[10]，因此，需要在基因組靶標(biāo)位點(diǎn)左右兩邊各設(shè)計(jì)1個(gè)ZFN，2個(gè)ZFN結(jié)合到特定靶點(diǎn)，當(dāng)識(shí)別位點(diǎn)間距為6～8 bp時(shí)，F(xiàn)okⅠ域便發(fā)生二聚化產(chǎn)生內(nèi)切酶活性，對(duì)目標(biāo)DNA雙鏈進(jìn)行切割，從而使雙鏈DNA斷裂，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)基因組編輯[1]。

1.2 TALEN技術(shù)

與ZFN相似，TALEN也是一種核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，該技術(shù)被評(píng)為2012年十大科學(xué)進(jìn)展之一。TALEN技術(shù)由類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(transcription activator-like effector, TALE)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與非特異性核酸內(nèi)切酶FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域融合而成。TALEN來(lái)源于植物病原菌黃單胞桿菌Xanthomonas[11]。TALEN識(shí)別區(qū)域是由34個(gè)氨基酸組成，其中32個(gè)氨基酸都是保守的，只有第12和13位的氨基酸變化較大，這2個(gè)氨基酸被稱為雙氨基酸殘基(repeatvarible di-residues, RVDs)，RVD包括NI、HD、NG以及NN，RVD與堿基的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：NI識(shí)別A，NG識(shí)別T，NN識(shí)別G，HD識(shí)別C[12-13]。每個(gè)TALE單體只靶向1個(gè)核苷酸，在構(gòu)建TALEN人工酶時(shí)需要針對(duì)每一個(gè)靶位點(diǎn)的上下游各設(shè)計(jì)1個(gè)，當(dāng)FokⅠ形成二聚體活性結(jié)構(gòu)時(shí)就可以對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行剪切[14]，實(shí)現(xiàn)基因組編輯的目的(圖1)。

源于文獻(xiàn)[14]圖1 TALEN的原理

1.3 CRISPR/Cas9技術(shù)

CRISPR/Cas系統(tǒng)存在于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中，是一種規(guī)律的成簇間隔短回文重復(fù)序列結(jié)構(gòu)。早在1987年，Nakata 等[15]就在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)有29 nt串聯(lián)間隔重復(fù)序列存在，但在當(dāng)時(shí)研究人員們并不清楚它的功能。直到2002年，科學(xué)家們才首次提出了CRISPR概念[16]。2013年，Science將CRISPR作為SSNs技術(shù)的新星列入年度十大科學(xué)進(jìn)展[17]。CRISPR由一系列高度保守的重復(fù)序列與間隔序列相間排列組成，在CRISPR序列附近存在高度保守的CRISPR相關(guān)基因(CRISPR-associated gene,Casgene)，這些基因編碼的蛋白具有核酸酶功能，可以對(duì)DNA序列進(jìn)行特異性切割。根據(jù)Cas基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)被分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3種類型，Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)需要多個(gè)Cas蛋白形成的復(fù)合體切割DNA雙鏈，而Ⅱ型系統(tǒng)只需要1個(gè)Cas9蛋白[18]。CRISPR介導(dǎo)的免疫需要2個(gè)RNA，分別是反式激活RNA(trans-activating cr RNA, tracr RNA)和CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄出來(lái)的pre-cr RNA。當(dāng)tracrRNA與pre-cr RNA互補(bǔ)配對(duì)后，激活RNAase Ⅲ并對(duì)pre-cr RNA進(jìn)行剪切，使之成為成熟的cr RNA[19-20]。成熟的cr RNA與tracr RNA形成向?qū)NA (single guide RNA, sg RNA)的嵌合RNA分子，sg RNA引導(dǎo)Cas9蛋白在雙鏈DNA的靶位點(diǎn)上，并在原型間隔毗鄰序列(proto-spacer adjacent motif, PAM)的上游3～8 bp 位置對(duì)結(jié)合的序列進(jìn)行切割[21-22](圖2)。

圖2 CRISPR/Cas 9的原理

1.4 CRISPR系統(tǒng)改進(jìn)技術(shù)—CRISPR/Cpf1

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)在基因編輯領(lǐng)域是一項(xiàng)革命性的技術(shù)，但是CRISPR/Cas9系統(tǒng)也有不完美之處，研究人員致力于尋找更加完善、操作更加簡(jiǎn)單的基因編輯工具酶。2015年，張峰團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種新的CRISPR系統(tǒng)——CRISPR/Cpf1，該團(tuán)隊(duì)證實(shí)了這項(xiàng)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)更加簡(jiǎn)單、精確的操作[23]。Cpf1存在于新兇手弗朗西斯菌(Francisellanovicida)、氨基酸球菌(Acidaminococcussp)和毛螺科菌(Lachnospiraceaebacterium)中，為CRISPR/Cas家族的二類V型蛋白[24-25]。相較Cas9酶，Cpf1具有一定的優(yōu)勢(shì)，比如：1)Cpf1 蛋白酶比Cas9蛋白酶小，Cpf1更容易進(jìn)入細(xì)胞組織；另外，Cas9的初級(jí)產(chǎn)物pre-cr RNA需要與tracrRNA互補(bǔ)配對(duì)后，激活RNAase Ⅲ，并對(duì)pre-cr RNA進(jìn)行剪切，使之成熟；而Cpf1只需自身加工pre-cr RNA，不需要tracrRNA的參與[24, 26]。2)在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，需要cr RNA與tracr RNA形成向?qū)NA，引導(dǎo)Cas9蛋白切割DNA雙鏈，靶定不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的sgRNA；而在CRISPR/Cpf1中，只要Cpf1與成熟crRNA形成嵌合體就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的識(shí)別和剪切，這樣可以簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)步驟，降低實(shí)驗(yàn)成本。3)Cas9是在相同位置同時(shí)切割DNA雙鏈，最終形成一個(gè)平末端；而Cpf1切割DNA形成會(huì)形成一個(gè)有5個(gè)核苷酸突出的黏性末端，相比較平末端，黏性末端更容易處理，對(duì)目的基因的插入更容易控制。4)Cas9剪切位點(diǎn)離PAM序列很近，如果發(fā)生NHEJ修復(fù)，插入或者缺失容易改變PAM臨近序列，而Cpf1的剪切位點(diǎn)離PAM序列較遠(yuǎn)，不會(huì)改變PAM臨近序列，使研究人員在DNA的編輯位置上可以有更多的選擇[27]。5)Cas9和Cpf1都是單鏈RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，但Cas9只能切割DNA，而Cpf1既可以切割DNA又可以切割RNA。

1.5 3種基因編輯技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

作為第1代人工內(nèi)切核酸酶技術(shù)的ZFNs技術(shù)和傳統(tǒng)技術(shù)比有一定的優(yōu)勢(shì)，但是依舊存在很多缺陷，比如周期長(zhǎng)、載體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高等缺點(diǎn)[28]，最主要的是ZFNs技術(shù)無(wú)法對(duì)基因組進(jìn)行任意編輯，會(huì)有脫靶效應(yīng)，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性。因此，該技術(shù)在應(yīng)用上受到了一定的限制。TALENs技術(shù)被稱為第2代人工內(nèi)切核酸酶技術(shù)，與ZFNs技術(shù)相比，TALENs脫靶效率低，效率比較高，但該項(xiàng)技術(shù)會(huì)帶來(lái)一定的毒副作用，因?yàn)門(mén)ALENs與靶序列沒(méi)有完全配對(duì)，會(huì)導(dǎo)致基因組中不同位點(diǎn)的非特異性切割，從而擾亂基因組的穩(wěn)定，發(fā)生毒副作用，并且每個(gè)堿基都需要1個(gè)TALEN識(shí)別模塊，所以整個(gè)構(gòu)建過(guò)程工作量較大。改造時(shí)間長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)成本高等缺點(diǎn)阻礙了以上2種核酸酶技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。當(dāng)?shù)?代CRISPR技術(shù)出現(xiàn)后，成本低、操作簡(jiǎn)單、效率高、脫靶效率低的優(yōu)點(diǎn)使其成為當(dāng)今分子生物學(xué)領(lǐng)域最受歡迎的技術(shù)之一。

2 CRISPR技術(shù)的應(yīng)用

2.1 CRISPR技術(shù)在動(dòng)物育種中的應(yīng)用

2013年，CRISPR技術(shù)成功地應(yīng)用在人和小鼠的細(xì)胞上，開(kāi)啟了基因編輯技術(shù)的新時(shí)代[29-31]。之后廣泛應(yīng)用在小鼠、大鼠、果蠅、斑馬魚(yú)等模式動(dòng)物的研究中。農(nóng)業(yè)動(dòng)物包括豬、牛、羊、雞、鴨、兔、犬等都是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，利用CRISPR技術(shù)的單基因、多基因敲除、大片段敲除和調(diào)控基因表達(dá)等功能來(lái)提高農(nóng)業(yè)動(dòng)物的生產(chǎn)性能，可以大大增加經(jīng)濟(jì)效益。豬藍(lán)耳病是養(yǎng)殖業(yè)危害最大的傳染病，研究認(rèn)為，豬藍(lán)耳病病毒的受體基因是分化簇163(CD163)，而分化簇1D(CD1D)則是一類抗原遞呈因子。研究人員通過(guò)CRISPR技術(shù)敲除了CD163和CD1D基因，最后獲得了基因編輯豬，發(fā)現(xiàn)它們有良好的抵抗藍(lán)耳病的能力[32]。肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN)基因的功能是調(diào)控肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育。通過(guò)CRISPR技術(shù)獲得了敲除MSTN基因的綿羊，發(fā)現(xiàn)它們的產(chǎn)肉性能有所提高[33]。牛奶是人類目前消費(fèi)最多的動(dòng)物奶，但牛奶與人乳還是存在一定的差異，比如乳鐵蛋白是十分重要的一種蛋白，但在牛奶中的含量只有人乳的十分之一。牛奶含有的令人過(guò)敏的乳球蛋白，但在人乳中不含。為了生產(chǎn)更適合人類飲用的人乳化牛奶，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)戴蘊(yùn)平團(tuán)隊(duì)利用基因編輯技術(shù)培育出了轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白、人乳溶菌酶、牛β-乳球蛋白基因敲除等一系列新型奶牛。農(nóng)業(yè)動(dòng)物不僅是經(jīng)濟(jì)動(dòng)物還是理想的生物醫(yī)學(xué)模型[34]。臨床發(fā)現(xiàn)，血管性血友病是因?yàn)関WF基因缺陷，周琪領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)利用CRISPR 技術(shù)獲得了vWF基因敲除的廣西巴馬小型豬，發(fā)現(xiàn)這些小型豬與血友病人相似，同樣患有凝血功能障礙[35]。由此可見(jiàn)，隨著CRISPR技術(shù)發(fā)展及完善，會(huì)有越來(lái)越多服務(wù)人類的研究成果。

2.2 CRISPR技術(shù)在植物育種中的應(yīng)用

CRISPR技術(shù)被開(kāi)發(fā)以來(lái)很快應(yīng)用于人與動(dòng)物，2013年中國(guó)科學(xué)院高彩霞實(shí)驗(yàn)室將該技術(shù)應(yīng)用到水稻、小麥中，證明了CRISPR技術(shù)可以應(yīng)用到植物編輯中[28]。水稻中奔達(dá)松敏致死基因BEL決定了水稻對(duì)苯達(dá)松和磺酰脲類除草劑的抗性，通過(guò)CRISPR技術(shù)獲得的bel突變體對(duì)相關(guān)除草劑的抗性功能缺失，其中部分純合突變體表現(xiàn)出對(duì)除草劑苯達(dá)松敏感表型[35]。研究人員針對(duì)玉米中植酸合成的關(guān)鍵酶基因ZmIPK構(gòu)建了2個(gè)不同位點(diǎn)的CRISPR載體，靶位點(diǎn)1含SacⅠ酶切位點(diǎn)，靶位點(diǎn)2含BamHⅠ酶切位點(diǎn)，測(cè)序分析表明發(fā)生了不同程度的插入與缺失。除此之外，CRISPR技術(shù)還應(yīng)用在小麥、高粱、甜橙、大豆、煙草等經(jīng)濟(jì)作物[36]，該項(xiàng)技術(shù)在作物育種與培育方面起到重要作用。

2.3 CRISPR技術(shù)在分子檢測(cè)中的應(yīng)用

2016年張鋒團(tuán)隊(duì)首次描述了一種靶向RNA的CRISPR相關(guān)酶——CRISPR/Cas13a (之前稱之為C2c2)。不同于靶向DNA的CRISPR酶，研究人員稱Cas13a不僅可以靶向RNA，還可以靶向DNA，同時(shí)還能切割RNA附近的序列，研究者稱之為“附帶切割”。2016年9月，Jennifer等[37]利用Cas13a的這種附帶切割活性檢測(cè)RNA。然而，這種方法需要存在幾百萬(wàn)個(gè)RNA分子，因此Cas13a缺乏很多研究和臨床應(yīng)用所需的靈敏度。2017年4月，張鋒團(tuán)隊(duì)將Cas13a改造成一種快速、廉價(jià)和高度靈敏的診斷工具。該團(tuán)隊(duì)將這種新工具稱為“SHERLOCK”，這種工具能夠經(jīng)設(shè)計(jì)作為一種基于試紙條的測(cè)試方法加以使用，這樣就可以簡(jiǎn)單地儲(chǔ)存并且可以廣泛使用。在新的研究中，SHERLOCK的靈敏度增加了一百萬(wàn)倍。這種CRISPR工具還包括一種RNA報(bào)告分子，當(dāng)該報(bào)告分子被切割時(shí)，它會(huì)發(fā)出熒光。當(dāng)Cas13a檢測(cè)到靶RNA序列時(shí)，它的附帶切割活性也會(huì)切割這種RNA報(bào)告分子，從而釋放可檢測(cè)到的熒光信號(hào)。研究者稱可以利用這種工具輕松高效地檢測(cè)任何核酸分子，這種方法有很多應(yīng)用，比如：在幾小時(shí)內(nèi)檢測(cè)病人血液或尿液樣品中的寨卡病毒，區(qū)分寨卡病毒的非洲毒株和美洲毒株的基因序列，區(qū)分大腸埃希菌等細(xì)菌的特定類型，檢測(cè)抗生素耐藥性基因，鑒定不含細(xì)胞的DNA片段中的致癌性突變[38]。

3 CRISPR基因編輯個(gè)體篩選方法

基因編輯技術(shù)的核酸酶是有針對(duì)性地誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，而后細(xì)胞啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制。修復(fù)后基本上會(huì)產(chǎn)生3種結(jié)果(圖3)：1)通過(guò)NHEJ或同源重組完美修復(fù)(HR)(靶向基因仍然不變)，2)用供體模板(HR基因已轉(zhuǎn)化為模板序列)對(duì)HR進(jìn)行完美修復(fù)，3)容易出錯(cuò)的NHEJ修復(fù)(靶向基因已插入或缺失(indel))。完全修復(fù)和基因?qū)氩呗缘?1)和(2)的結(jié)果是可預(yù)測(cè)的，可以使用專門(mén)設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行檢測(cè)。與此相反，通過(guò)容易出錯(cuò)的NHEJ修復(fù)會(huì)產(chǎn)生各種不同形式的突變，包括缺失、插入等結(jié)果，這對(duì)突變體的檢測(cè)仍然是一項(xiàng)技術(shù)挑戰(zhàn)[39]。研究人員建立了許多方法檢測(cè)CRISPR系統(tǒng)產(chǎn)生的突變體，目前主要的檢測(cè)方法有5種。

圖3 細(xì)胞修復(fù)的結(jié)果

3.1 T7核酸內(nèi)切酶I(T7E1)測(cè)定

2009年，Kim等[40]在改進(jìn)ZFNs技術(shù)時(shí)，利用人類胚胎腎細(xì)胞(HEK293)以趨化因子CCR5為靶標(biāo)基因，通過(guò)插入螢火蟲(chóng)熒光酶基因破壞CCR5序列，研究人員設(shè)計(jì)23對(duì)ZFNS對(duì)CCR5基因的8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行切割，最后用T7E1檢測(cè)方法測(cè)定，凝膠電泳圖顯示8個(gè)位點(diǎn)的CCR5基因均被切割破壞。2011年， Mussolino等[41]在開(kāi)發(fā)新的基因編輯技術(shù)TALEN時(shí)，同樣利用HEK293細(xì)胞，修飾IL2RG和CCR5基因，以T7E1檢測(cè)方法，得到了預(yù)期結(jié)果，2種基因均被修飾。而Cho等[42]在2013年同樣以CCR5基因?yàn)榘谢?，利用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因修飾，用T7E1測(cè)定，在預(yù)期的位置得到了DNA條帶，并根據(jù)條帶強(qiáng)度可以計(jì)算突變頻率。

3.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定

因?yàn)榇蟛糠值娜笔蛔儼l(fā)生在DSBs位點(diǎn)，稱為突變熱點(diǎn)區(qū)域(MHS)，假設(shè)引物3’端覆蓋或者部分覆蓋MHS區(qū)域，缺失突變體就不會(huì)被擴(kuò)增，只有野生型會(huì)被擴(kuò)增?；谶@個(gè)理論，2014年，Yu等[43]以定量PCR為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)2對(duì)引物去檢測(cè)突變體并計(jì)算突變頻率，一對(duì)引物設(shè)計(jì)在MHS外側(cè)為Po，而另一對(duì)引物在MHS的3’端，稱為引物側(cè)翼Pf，這樣Po就可以擴(kuò)增出缺失突變體，而Pf就可以擴(kuò)增出野生型。Hua等[44]在2017年以PCR為基礎(chǔ)，通過(guò)改變臨界點(diǎn)退火溫度，開(kāi)發(fā)一種新的檢測(cè)CRISPR/Cas9產(chǎn)生的突變體的方法—ACT-PCR，對(duì)八氫番茄紅素脫氫酶(ospds)、水稻os02g23823、OsMPK2、斑馬魚(yú)phn3.1、glycogenin2、per3基因進(jìn)行檢測(cè)，最后證實(shí)ACT-PCR可以有效檢測(cè)突變體。研究人員發(fā)現(xiàn)，ACT-PCR可以檢測(cè)到1 pb的突變，而傳統(tǒng)方法T7E1無(wú)法檢測(cè)到。

3.3 高分辨率熔解(HRM)分析法

Dahlem等[45]在2012年，通過(guò)TALENs技術(shù)對(duì)斑馬魚(yú)的基因組進(jìn)行特定的基因突變，包括golden、ryr3、tbx6、ryr1a基因，TALENs的序列特異性較高但不是很完美。2013年，Bassett等[46]以果蠅的黃色白色基因?yàn)榘袠?biāo)基因，通過(guò)CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因編輯，利用HRM進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CRISPR技術(shù)誘導(dǎo)靶基因突變高達(dá)80%，并且這種突變會(huì)遺傳到下一代；而且HRM檢測(cè)靈敏度很高，即使是單堿基缺失，HRM也會(huì)檢測(cè)到突變體。2014年，Thomas等[47]報(bào)道，HRM能檢測(cè)到結(jié)果最好的片段大小為50 bp左右，而片段大小在100 bp時(shí)檢測(cè)結(jié)果良好。

3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)法

本課題組利用傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量平臺(tái)開(kāi)發(fā)出了一個(gè)簡(jiǎn)單、高效檢測(cè)CRISPR誘導(dǎo)的突變體的新方法。該方法的原理是CRISPR創(chuàng)造的突變一般發(fā)生在前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)5’端第3個(gè)堿基處，利用這個(gè)規(guī)律，開(kāi)發(fā)雙熒光探針，在PCR擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)同時(shí)標(biāo)記2個(gè)熒光探針，一個(gè)探針處于突變靶點(diǎn)位置檢測(cè)靶位點(diǎn)是否發(fā)生突變(探針Ⅰ，F(xiàn)AM)，另一個(gè)不在突變靶點(diǎn)，用作內(nèi)參基因來(lái)評(píng)估整體樣本內(nèi)的等位基因數(shù)量(探針Ⅱ，HEX)，以此來(lái)區(qū)分突變個(gè)體并檢測(cè)突變頻率。以基因編輯的水稻為材料，利用該種方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，這種檢測(cè)方法能夠有效區(qū)分水稻的野生型、雜合型突變和純合型突變。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，qPCR法可以在擬南芥、高粱和玉米等不同物種的基因編輯植物中得到有效應(yīng)用[48]。

3.5 幾種方法的比較

幾種檢測(cè)方法的比較結(jié)果見(jiàn)表1。有的檢測(cè)方法有一定的局限性，比如耗費(fèi)時(shí)間和勞動(dòng)力，或者需要昂貴的設(shè)備[49]。PCR/RE試驗(yàn)篩選CRISPR誘導(dǎo)的突變體通常是簡(jiǎn)單的和敏感的，但是靶序列附近限制酶位點(diǎn)的可用性受到一定的限制。雖然T7E1得到廣泛的使用，適用于任何目標(biāo)并且可以識(shí)別序列和消化不匹配的異源雙鏈DNA，但與PCR/RE相比，這種方法既浪費(fèi)時(shí)間又消耗勞動(dòng)力[30]。高分辨率熔解(HRM)分析法是基于解鏈溫度的不同而形成不同形態(tài)熔解曲線來(lái)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)突變體，此方法可以成功地用于基因突變的篩選，但是所需要的設(shè)備費(fèi)用昂貴[44]。

表1 基因編輯產(chǎn)品檢測(cè)方法比較

4 展望

CRISPR/Cas9技術(shù)是繼ZFNsTALEN之后的一種高效快捷的基因編輯技術(shù)，而且設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、耗時(shí)短。因?yàn)镻AM存在于任何物種中，基本不受物種限制[50]，所以CRISPR/Cas9技術(shù)無(wú)論在動(dòng)物還是在植物以及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中都有極大的發(fā)展前景。目前，該項(xiàng)技術(shù)還存在一些不足，比如脫靶現(xiàn)象、基因突變等非預(yù)期效應(yīng)。脫靶效應(yīng)是指設(shè)計(jì)的sgRNA會(huì)與非靶點(diǎn)的DNA錯(cuò)配導(dǎo)致非預(yù)期的基因突變，而這種現(xiàn)象會(huì)嚴(yán)重影響CRISPR技術(shù)的應(yīng)用[51]。所以應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)時(shí)，著重考慮CRISPR的脫靶效應(yīng)顯得尤為重要。為此，研究者們對(duì)脫靶現(xiàn)象進(jìn)行了研究分析，提出了一系列弱化脫靶的策略。影響脫靶效應(yīng)的因素主要有：1)PAM序列，PAM序列影響CRISPR的DNA切割率，研究表明NGG介導(dǎo)切割率最高，而且增加PAM序列的長(zhǎng)度也會(huì)提高靶位點(diǎn)的專一性[52]；2)sgRNA序列，改變sgRNA發(fā)卡的長(zhǎng)度，可以增加與Cas9的結(jié)合率[53]，而sgRNA序列的長(zhǎng)度對(duì)靶序列的專一性也有一定的影響[54]；3)Cas9/sgRNA的濃度，Cas9蛋白和sgRNA濃度高并不能提高靶位點(diǎn)的專一性，相反，Cas/sgRNA復(fù)合體濃度高的時(shí)候，Cas9的切割率反而降低[55]。針對(duì)這些因素，研究者們提出的策略有：1)sgRNA設(shè)計(jì)與脫靶效應(yīng)評(píng)估軟件，比如CRISPR Design、Cas9 Design、CRISPR-P、CHOOCHOP等軟件可在設(shè)計(jì)時(shí)直接評(píng)估脫靶率，以此來(lái)提高sgRNA序列設(shè)計(jì)的特異性[56]。2)雙切口措施，通過(guò)改造Cas9蛋白得到其突變型Cas9n切口酶，改造過(guò)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，可大幅度降低脫靶效應(yīng)[57-58]。3)改變sgRNA的序列，通過(guò)改變sgRNA的結(jié)構(gòu)和序列長(zhǎng)度可以降低脫靶率，比如將sgRNA的序列長(zhǎng)度縮短到17～18個(gè)核苷酸時(shí)，可以大大降低脫靶率[54]。4)控制Cas9/sgRNA的濃度，降低Cas9/sgRNA的復(fù)合體濃度，脫靶率也隨之降低，而利用RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可以更好地控制sgRNA的表達(dá)量[59]。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者們對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)不斷地進(jìn)行優(yōu)化和完善，以期發(fā)揮該項(xiàng)技術(shù)的最大用處。

隨著CRISPR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，基因編輯產(chǎn)品不斷涌出，針對(duì)其產(chǎn)品的檢測(cè)與鑒定顯得尤為重要。雖然目前有許多方法可以檢測(cè)CRISPR突變體，但這些方法都有相應(yīng)的缺點(diǎn)。本文對(duì)這些方法進(jìn)行了分析比較，指出現(xiàn)行方法的優(yōu)缺點(diǎn)，研究人員可以根據(jù)自身需要進(jìn)行選擇，也可以幾種方法相互結(jié)合，互相驗(yàn)證。同時(shí)，我們期待研究者能研究出一種耗時(shí)短、靈敏度高、成本低的方法，對(duì)基因編輯產(chǎn)品進(jìn)行鑒定檢測(cè)。