紅花籽亞麻籽復(fù)合油對(duì)小鼠血糖的干預(yù)作用

趙圓圓，楊夢(mèng)娟，李心爽，楊曉君

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

糖尿病是一種慢性的、終身的、代謝紊亂性疾病，其發(fā)生與發(fā)展的過(guò)程中有兩個(gè)重要的生理學(xué)特征，胰島β細(xì)胞功能缺陷與胰島素抵抗（IR）[1]。胰島素抵抗是指胰島素介導(dǎo)的葡萄糖吸收與代謝能力的下降，包括靶細(xì)胞對(duì)胰島素反應(yīng)性下降、敏感性降低與機(jī)體代償性的分泌過(guò)多胰島素。胰島素抵抗，糖尿病患者體內(nèi)胰島素為發(fā)揮正常的降血糖功能，胰島β細(xì)胞分泌功能增加，血液中的胰島素增多，這使得糖尿病患者血液中不但血糖升高，胰島素水平也明顯高于正常[2]。糖尿病一直被人們認(rèn)為是“沉默的殺手”，患有糖尿病的患者由于長(zhǎng)期高血糖，將引發(fā)多種疾病，例如：心血管并發(fā)癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變、腦血管病變等[3]。

亞油酸、α-亞麻酸為人體必需氨基酸，人體自身不能合成，需從日常飲食中獲取[4]。亞油酸為十八碳二烯酸，是一種ω-6系列多不飽和脂肪酸[5,6]，被人們稱為“血管清道夫”。亞油酸，可防止人體血清膽固醇在血管壁的沉積[7-9]。衣丹等[10]人應(yīng)用MTT比色法測(cè)定共軛亞油酸對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響，用綠色熒光蛋白標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白/碘化丙啶雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和死亡，發(fā)現(xiàn)共軛亞油酸2 μmol/L處理細(xì)胞72 h，細(xì)胞存活率為126.3%；在濃度小于5 μmol/L時(shí)呈劑量和時(shí)間性依賴。共軛亞油酸能部分阻斷軟脂酸(PA)和硬脂酸(SA)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡。α-亞麻酸為十八碳三烯酸，是一種ω-3系列多不飽和脂肪酸，可降血糖、抗衰老、降血脂，對(duì)心血管疾病也有良好的預(yù)防作用[11,12]。ω-3和ω-6系列多不飽和脂肪酸與人體健康密切相關(guān)，具有重要的生理學(xué)意義。多數(shù)情況下，ω-3和ω-6系列多不飽和脂肪酸在功能上相互協(xié)調(diào)、相互制約、共同調(diào)節(jié)著生物體的生命活動(dòng)[13]。

日常生活中，ω-6系列的多不飽和脂肪酸主要來(lái)源于谷物及植物油中，其中紅花籽油中亞油酸含量最高，77%左右[14]。ω-3系列的多不飽和脂肪酸多存在于植物油、高脂魚(yú)類和海洋哺乳動(dòng)物中。日常使用的植物油以亞麻籽油中所含亞麻酸的比例最高，57%左右[15]。本試驗(yàn)所用的復(fù)合油為紅花籽亞麻籽復(fù)合油，由紅花籽油與亞麻籽油提取物科學(xué)配伍制成。經(jīng)前期試驗(yàn)表明[16,17]，當(dāng)紅花籽亞麻籽復(fù)合油中亞油酸與亞麻酸比例為1：1～2時(shí)，紅花籽亞麻籽復(fù)合油具有良好的降血脂功能，高血脂與糖尿病對(duì)人體的危害互為因果，因此，本試驗(yàn)在明確紅花籽亞麻籽復(fù)合油具有良好的降血脂功能的基礎(chǔ)上，進(jìn)行紅花籽亞麻籽復(fù)合油對(duì)糖尿病模型小鼠血糖的影響研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠72只，雌雄各半，體重（18～22 g），購(gòu)買于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK[新]2016-0003）。觀察一周無(wú)異常反應(yīng)后進(jìn)行試驗(yàn)，飼料為滅菌全價(jià)柱狀飼料，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖，分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司；羧甲基纖維素鈉、分析純，天津市精細(xì)化工研究所；吐溫-20，天津市福晨化學(xué)試劑廠；鏈脲佐菌素、生物技術(shù)級(jí)，上海麥克林生化科技有限公司；紅花籽油，新疆紅花緣科技有限公司（20170908，明亮的淺黃色油脂，具有穩(wěn)定的香味）；亞麻籽油，新疆紅果實(shí)生物制品有限公司（20170720，明亮的黃色油脂）；去離子水、亞麻籽油提取物，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；電子分析天平（METTLER TOLEDO，PL303，d=0.001 g）；血糖儀及血糖試紙（三諾GA-3型）；Neofuge 13R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，力康生物科技有限控股公司；小鼠胰島素（INS）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；X-Mark酶標(biāo)儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海冠戈實(shí)業(yè)有限公司（DNP-9052A型）。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS法檢測(cè)分析亞麻籽油提取物組分

1.3.1.1 亞麻籽油提取物的制備

在前期研究已確定的皂化中和純化一體化制備亞麻籽油提取物工藝[18]基礎(chǔ)上，改進(jìn)皂化工藝，采用高速剪切皂化-冷凍分離法制備亞麻籽油提取物，工藝流程圖如下：

1.3.1.2 甲酯化處理

參照國(guó)標(biāo)《GB/T 17376-2008動(dòng)植物油脂脂肪酸甲酯制備》，選取三氟化硼法對(duì)亞麻籽油提取物進(jìn)行處理。

1.3.1.3 GC-MS法檢測(cè)分析[19]

GC檢測(cè)條件：色譜柱：HP-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細(xì)管柱；進(jìn)樣量：0.2 μL；分流比：100：1；升溫程序：起始溫度為50 ℃，以10 ℃/min升溫至210 ℃，然后以3 ℃/min升溫到240 ℃，再以10 ℃/min升到300 ℃/min保持5 min。運(yùn)行時(shí)間：37 min。

MS檢測(cè)條件：電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源發(fā)生器溫度：230 ℃；質(zhì)量掃描范圍：30～700 u；溶劑延遲：3 min。

1.3.2 試驗(yàn)準(zhǔn)備

1.3.2.1 鏈脲佐菌素溶液（STZ）的配制[20]

稱取檸檬酸2.10 g，檸檬酸鈉2.90 g，將二者分別置于200 mL燒杯中，加入100 mL去離子水溶解，配制成溶液。將檸檬酸與檸檬酸鈉溶液按照1：1.32的比例混合均勻。測(cè)pH值，將溶液配制成pH=4.4的檸檬酸緩沖溶液。稱取0.1 g鏈脲佐菌素粉末置于10 mL棕色容量瓶中，用檸檬酸緩沖溶液定容，配制濃度為1%的鏈脲佐菌素溶液備用。

1.3.2.2 不同受試物灌胃試樣的制備[21]

試驗(yàn)前期證明，為滿足紅花籽亞麻籽復(fù)合油中亞油酸與亞麻酸的比例為 1：1～2，紅花籽亞麻籽復(fù)合油中紅花籽油與亞麻籽油提取物的比例為 3：2。按照中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦食用油的攝入量，設(shè)人體食用油量為25 g/60 kg d，依照公式：B種動(dòng)物的劑量(mg/kg)=W(換算系數(shù))×A種動(dòng)物的劑量(mg/kg)，得出小鼠的食用油量為0.038 g/10 gd。稱取紅花籽油1.520 g，亞麻籽油提取物2.280 g混合，加入0.2 mL吐溫-20，2%羧甲基纖維素鈉溶液，定容至10 mL攪拌均勻，灌胃給予小鼠。紅花籽油、亞麻籽油與亞麻籽油提取物均直接稱取3.800 g受試物，加入2%羧甲基纖維素鈉溶液定容至10 mL攪拌均勻，灌胃給予小鼠。正常組和高血糖對(duì)照組灌飼同體積2%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.3.3 糖尿病小鼠模型的建立

選用昆明種小鼠72只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為正常組與模型組，共6組，每組12只，雌雄各半，其中模型組隨機(jī)分組為高血糖對(duì)照組、紅花籽油組、亞麻籽油組、亞麻籽油提取物組、紅花籽亞麻籽復(fù)合油組。正常組小鼠正常飼養(yǎng)，模型組小鼠禁食不禁水，12 h后一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液150 mg/kg，并于72 h后測(cè)定模型組小鼠空腹血糖值，小鼠空腹血糖值高于11.1 mmol/L即為造模成功。建模未成功小鼠腹腔補(bǔ)注射 1%鏈脲佐菌素溶液60 mg/kg，于72 h后測(cè)量小鼠空腹血糖值，挑選出建模成功小鼠。將模型組小鼠分別灌胃給予 0.1 mL/10 gd 2%羧甲基纖維素鈉、紅花籽油、亞麻籽油、亞麻籽油提取物、紅花籽亞麻籽復(fù)合油制備而成的混懸劑?？瞻捉M灌胃給予同體積 2%羧甲基纖維素鈉。連續(xù)灌胃14 d。

1.4 受試物對(duì)糖尿病小鼠餐后血糖的影響

動(dòng)物試驗(yàn)第一天，各組小鼠禁食不禁水12 h，尾靜脈取血，使用血糖試紙與血糖儀檢測(cè)各組小鼠空腹血糖濃度。依照分組對(duì)小鼠連續(xù)灌胃14 d。第一次灌胃給藥與末次灌胃給藥前，小鼠禁食不禁水12 h，其余時(shí)間小鼠自由采食。小鼠末次灌胃給藥30 min后，各組小鼠灌胃給予葡萄糖2.0 g/kg。分別于10、30、60、90、120 min處小鼠尾靜脈取血，測(cè)定血糖濃度[22]。使用式1求出各組小鼠AUC相對(duì)值。

1.5 受試物對(duì)糖尿病小鼠體重的影響

1.6 不同受試物對(duì)糖尿病小鼠餐后胰島素水平的影響試驗(yàn)

小鼠末次給藥 30 min后，灌胃給予葡萄糖 2.0 g/kg。1 h后，眼眶取血，置于2 mL離心管中，冷凍離心機(jī)離心制備血清。使用小鼠胰島素（INS）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒測(cè)定小鼠胰島素水平，分別代入式2、式3求出小鼠胰島素抵抗指數(shù)，胰島β細(xì)胞功能[23]。公式見(jiàn)（2）、（3）。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻籽油提取物GC-MS分析結(jié)果

按照1.3.1.2所確立方法甲酯化處理后，以1.3.1.3所確定的GC-MS檢測(cè)條件進(jìn)行脂肪酸組分檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果的交叉對(duì)比檢索庫(kù)、置信度取舍、化學(xué)積分工作站等同亞麻籽油提取物的總離子圖見(jiàn)圖 1，亞麻籽油提取物中所含各脂肪酸組分的各物質(zhì)保留時(shí)間、峰面積、脂肪酸含量、匹配度等情況見(jiàn)表1。

由表1可知，亞麻籽油提取物中α-亞麻酸含量最高為60.07%，其次是亞油酸，含量為17.91%。不飽和脂肪酸含量為78.92%。

2.2 不同受試物對(duì)小鼠餐后血糖的影響

依照分組，連續(xù)14 d對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃后，測(cè)量小鼠的血糖，并通過(guò)式1得出AUC相對(duì)值。數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，正常組小鼠與高血糖對(duì)照組小鼠，二者在進(jìn)食葡萄糖2 h內(nèi)AUC具有極顯著性差異（p＜0.01）。紅花籽油、亞麻籽油、紅花籽亞麻籽復(fù)合取物對(duì)小鼠進(jìn)食葡萄糖后的血糖生成無(wú)抑制作用，AUC相對(duì)值高于高血糖對(duì)照組小鼠。

表1 亞麻籽油提取物的GC-MS檢測(cè)結(jié)果Table 1 GC-MS test results of Flaxseed Oil Extract

表2 不同受試物對(duì)進(jìn)食葡萄糖后血糖生成的影響Table 2 Effect of different test substances on blood glucose production after glucose intake (±SD)

表2 不同受試物對(duì)進(jìn)食葡萄糖后血糖生成的影響Table 2 Effect of different test substances on blood glucose production after glucose intake (±SD)

注：*表示與高血糖對(duì)照組比較具有顯著性差異，p＜0.05，**表示與高血糖對(duì)照組比較具有極顯著差異p＜0.01。

組別 樣本數(shù)/n 餐后血糖值/(mmol/L)0 h 0.17 h 0.5 h 1 h正常組 10 5.92±1.54** 5.33±1.25** 5.46±1.30** 5.34±2.15**高血糖對(duì)照組 6 19.55±4.93 18.40±2.85 17.38±3.02 17.38±3.02紅花籽油組 5 17.64±2.78 19.72±3.73 16.22±2.03 13.50±4.48亞麻籽油組 7 17.93±5.85 15.26±6.64 15.96±4.26 13.5±4.21亞麻籽油提取物組 9 17.09±3.78 19.36±3.02 19.01±3.02 14.03±1.80紅花籽亞麻籽復(fù)合油組 9 16.67±3.93 14.01±3.03 15.73±4.40* 14.60±2.75組別 樣本數(shù)/n 餐后血糖值/(mmol/L) 血糖應(yīng)答曲線下面積/(h·mmol/L)AUC相對(duì)值/(100%)1.5 h 2 h正常組 10 4.47±1.09** 4.08±1.02** 9.97±2.22** -高血糖對(duì)照組 6 12.70±4.99 12.22±5.44 29.93±6.83 100紅花籽油組 5 11.76±5.31 12.36±6.52 28.88±5.66 98亞麻籽油組 7 13.63±4.44 12.89±6.93 28.62±8.60 96亞麻籽油提取物組 9 13.19±1.53 12.31±2.04 30.87±3.12 103紅花籽亞麻籽復(fù)合油組 9 14.07±2.14 12.48±3.60 28.90±3.92 97

圖1 亞麻籽油提取物的GC-MS總離子圖Fig.1 total GC-MS ion diagram of flaxseed oil extract

2.3 不同受試物對(duì)小鼠體重的影響

由表3可知，造模第1 d，模型組小鼠體重均低于正常組，造模第1 d與給藥第14 d模型組體重增長(zhǎng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。

給藥14 d后，模型組小鼠與正常組比較,體重均顯著下降(p＜0.05)。

而與高血糖對(duì)照組比較，紅花籽油組、亞麻籽油組、亞麻籽油提取物組、紅花籽亞麻籽復(fù)合油組小鼠體重均增長(zhǎng)，說(shuō)明能夠緩解高血糖模型小鼠體重減輕的病癥，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。

2.4 不同受試物對(duì)小鼠餐后胰島素的影響

依照小鼠胰島素（INS）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒的測(cè)定方法，進(jìn)行不同受試物小鼠血清中胰島素含量的測(cè)定，以減去空白后的光密度（OD）值為橫坐標(biāo)，胰島素濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.1358x+0.0505，r=0.9943，線性關(guān)系良好。根據(jù)所擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線可得出不同受試組小鼠進(jìn)食葡萄糖后的胰島素水平，并通過(guò)小鼠胰島素濃度（FINS）和小鼠的空腹血糖濃度（FBG），按照式2得出胰島素抵抗指數(shù)，式3得出小鼠胰島β細(xì)胞功能，結(jié)果見(jiàn)表4。

經(jīng)數(shù)據(jù)分析，模型組小鼠胰島β細(xì)胞分泌功能較弱，胰島抵抗指數(shù)大于2.69，抵抗超標(biāo)。正常組與高血糖對(duì)照組，二者存在顯著性差異（p＜0.05），正常組血液中胰島素濃度低，對(duì)胰島素的抵抗弱，胰島β細(xì)胞分泌功能良好；亞麻籽油提取物組血清胰島素水平與胰島β細(xì)胞分泌功能和高血糖對(duì)照組相比存在顯著性差異（p＜0.05），亞麻籽油提取物組胰島素抵抗指數(shù)較低，胰島β細(xì)胞分泌功能弱；紅花籽亞麻籽復(fù)合油組數(shù)據(jù)均未與高血糖對(duì)照組小鼠形成顯著性差異（p＞0.05），但該組小鼠胰島β細(xì)胞分泌功能最高，對(duì)胰島素的抵抗作用弱于紅花籽油組、亞麻籽油組及高血糖對(duì)照組，對(duì)胰島素的敏感性較高；高血糖對(duì)照組及紅花籽油組胰島β細(xì)胞分泌功能較高，血清中胰島素濃度高于其它幾組，但由于胰島素抵抗指數(shù)也較高，機(jī)體對(duì)胰島素的敏感度低，不能有效的促進(jìn)與利用葡萄糖以降低小鼠血糖；亞麻籽油組胰島β細(xì)胞分泌功能低，血清中胰島素濃度低。證明單一的亞麻籽油及亞麻籽油提取物不能改善糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞的分泌功能，可提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，但與正常組相比機(jī)體內(nèi)胰島素分泌過(guò)少，不能有效降低小鼠餐后血糖。

紅花籽油可提高糖尿病小鼠胰島β分泌功能，但對(duì)小鼠胰島素抵抗無(wú)作用；紅花籽亞麻籽復(fù)合油可提高糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞分泌功能，提高小鼠胰島素分泌量，但與正常組相比仍較低，紅花籽亞麻籽復(fù)合油可降低糖尿病小鼠對(duì)胰島素的抵抗，提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，降低小鼠餐后血糖。

表3 不同受試物對(duì)小鼠體重的影響Table 3 Effects of different subjects on weight of mice

表4 不同受試物對(duì)小鼠餐后胰島素的影響Table 4 Effects of different test substances on postprandial insulin in mice

3 討論

本研究中，與正常組相比，模型組小鼠給藥14 d后體重變輕，精神萎靡，毛豎無(wú)光澤，墊料潮濕等現(xiàn)象有明顯改善。結(jié)果表明紅花籽亞麻籽復(fù)合油可降低糖尿病小鼠對(duì)胰島素的抵抗，提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，對(duì)小鼠餐后血糖有抑制作用，但與高血糖對(duì)照組相比較無(wú)顯著性差異（p＞0.05），不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。紅花籽油組、亞麻籽油組、亞麻籽油提取物組及紅花籽亞麻籽復(fù)合油組小鼠胰島β細(xì)胞分泌功能均低，造成該現(xiàn)象的原因可能是本試驗(yàn)灌胃時(shí)間為14 d，較短，受試物可能未能完全發(fā)揮其作用。董振興[24]等人研究牡丹籽油對(duì)糖尿病小鼠血糖及糖耐量的影響，將高血糖小鼠模型連續(xù)灌胃給藥30 d，檢測(cè)小鼠血糖值，結(jié)果表明牡丹籽油各劑量組均顯著降低糖尿病小鼠的血糖值，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牡丹籽油可降低正常小鼠的血糖水平；杜林娜[25]等人將誘導(dǎo)成功的糖尿病小鼠經(jīng)格列苯脲和不同劑量的蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物治療20 d后，與模型組小鼠血糖相比，格列本脲、蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物（1000 mg/kg和3000 mg/kg）組的小鼠空腹血糖均顯著降低（p＜0.05）；金情政[26]等人對(duì)糖尿病模型小鼠給予不同劑量的瓜蔞子油灌胃，連續(xù)給藥4周，發(fā)現(xiàn)瓜蔞子油能顯著升高模型小鼠的血清胰島素含量，降低血清TC、TG、NO和NOS含量。有研究表明[27]，當(dāng)空腹血糖升高，小鼠胰島素抵抗增加，胰島素敏感性降低，胰島β細(xì)胞分泌功能增加，血清胰島素水平上升。本試驗(yàn)提取物組小鼠，胰島素抵抗增加，但血清胰島素水平趨于正常組小鼠，造成該現(xiàn)象的原因可能為建模造成小鼠胰島β細(xì)胞破壞分泌胰島素能力低，該原因有待進(jìn)一步試驗(yàn)探討。

4 結(jié)論

紅花籽亞麻籽復(fù)合油可降低糖尿病小鼠血糖，降低小鼠的AUC，并且，此作用在餐后30 min效果顯著（p＜0.05）。紅花籽亞麻籽復(fù)合油還可提高糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞分泌功能，降低胰島素抵抗，提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，使胰島素促進(jìn)與利用葡萄糖的效率增加，但作用無(wú)顯著意義。后續(xù)將深入探討紅花籽亞麻籽復(fù)合油對(duì)Ⅱ型糖尿病模型小鼠血糖干預(yù)作用的影響，檢測(cè)其血液中的PI3K酶、AKT酶的活性大小及肝臟中的IRS-1絲氨酸磷酸化水平，與相應(yīng)的AUC相對(duì)值、胰島素分泌指數(shù)、胰島素抵抗指數(shù)，進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，探討紅花籽亞麻籽復(fù)合油對(duì)Ⅱ型糖尿病模型小鼠血糖的干預(yù)作用機(jī)制。